Содержание к диссертации
Введение
1. Красители и флуорохромы - представители ксенобиотиков-ионов:.взаимодействие с живыми клетками 9
1.1. Проблема асимметричного распределения красителей между клеткой и внешней средой 12
1.2. Роль биомембран в создании асимметричного распределения заряженных красителей между живой клеткой и средой 15
1.3. Токсичность заряженных красителей и фяуорохромов для живых клеток 20
2. Флуорохромы как индикаторы изменений в мембранах живых клеток 22
2.1. Метод флуоресцентных зондов 23
2.2. Флуоресцентные зонды в исследовании взаимодействия заряженных молекул с биомембранами S3
3 Постановка задачи 39
3. Материалы и методы исследований 4Ї
3.1. Флуоресцентные зонды 41
3.2. Ксенобиотики 41
3.3. Объекты исследований 44
3.4 Инкубация объектов с ксенобиотиками и флуоресцентными зондами 48
3.5. Оптические методы наблюдений и измерений 50
3.6. Получение денситограмм флуоресцентного изображения клеток на фотопленке 54
3.7. Измерение рН 54
3.8. Статистическая обработка результатов 55
4. Экспериментальный поиск информативной системы витальных флуоресцентных зондов 56
4.1. Флуоресценция зонда ДСМ в живых клетках 57
4.2. Флуоресценция мембранных зондов МБА и АНС в живых клетках 65
5. Свойства флуоресцентного зонда ДСМ 71
5.1. Физико-химические и оптические свойства ДСМ 71
5.2. Взаимодействие с фосфолипидными мембранами 83
5.3. Флуоресценция ДСМ в изолированных клеточных мембранах 98
5.4. Взаимодействие ДСМ с полиуглеводами и нуклеиновыми кислотами 101
5.5. Взаимодействие ДСМ с изолированными клеточными ядрами 106
6. Взаимодействие заряженных флуоресцентных зондов с живыми клетками 110
6.1. Зависимость распределения ДСМ и АНС в живых клетках от энергетического состояния митохондрий 111
6.2. Аккумуляция заряженных зондов в живой клетке: теоретические аспекты 117
6.3. Экспериментальные данные о кинетике аккумуляции ДСМ и АНС в живых лимфоцитах 132
6.4. ДСМ и АНС как флуоресцентные индикаторы некрозных клеток 138
6.5. Оценка мембранных потенциалов в живых тимоцитах с помощью зонда ДСМ 138
6.6. Действие ДСМ на живые клетки 144
7. Флуоресцентные тесты для исследования влияния ксенобиотиков на мембранные системы в живых клетках 153
7.1. Локализация флуоресцирующих фармакологических препаратов в живых клетках 154
7.2. Влияние заряженных ксенобиотиков на плазматические мембраны живых клеток 159
7.3. Оценка параметров связывания фармакологи ческих препаратов с мембраной эритроцита человека 170
7.4. Влияние заряженных ксенобиотиков на митохондрии в живых клетках 177
7.5. Оценка трансмембранных потенциалов на плазматической и митохондриальдах мемб ранах тимоцита в присутствии заряженных ксенобиотиков 188
8. Применение флуоресцентных зондов ДСМ и АНС на уровне живого организма 194
8.1. Оценка состояния мембранных систем в эмбрионе морского ежа с помощью зондов ДСМ и АНС 195
8.2. Флуоресценция ДСМ и АНС в органах живой КРЫСЫ 208
9. Обсуждение результатов 214
9.1. К вопросу о паранекротическои реакции живой клетки на повреждающее воздействие 214
9.2. О связи эффектов заряженных ксенобиотиков в живых клетках с их фармакологической ж биологической активностью на уровне орга низма 216
Заключение .219
- Роль биомембран в создании асимметричного распределения заряженных красителей между живой клеткой и средой
- Ксенобиотики
- Взаимодействие с фосфолипидными мембранами
- ДСМ и АНС как флуоресцентные индикаторы некрозных клеток
Введение к работе
Центральной проблемой фармакологии является установление связи между строением химических соединений и их биологическим (фармакологическим) действием. Однако результат действия любого вещества на живую систему предопределяется не только его химической структурой, но и исходным состоянием самой системы. Большинство химических соединений, используемых в человеческой жизнедеятельности, являются ксенобиотиками, т.е. веществами чуждыми организму; к ним относятся, в частности, синтетические фармакологические препараты, красители и флуорохромы. Молекулы многих ксенобиотиков при физиологических значениях рН приобретают заряд и поэтому ве- • дут себя в организме как ионы. Следовательно, можно предполагать, что биологический эффект заряженных ксенобиотиков тесно связан с градиентами электрических полей в клеточных мембранах.
Таким образом, проблема изучения состояния различных клеточных мембран по таким характеристикам как проницаемость для органических ионов, поверхностный заряд и трансмембранный электрический потенциал, актуальна не только для биофизики, но и для цито-фармакологии.
Благодаря развитию биофизических методов исследования за последние 20 лет выяснены многие физико-химические механизмы взаимодействия органических ионов с модельными и изолированными из клеток мембранами. В настоящее время возникает проблема перехода от биофизики изолированных субклеточных структур к биофизике клетки как единой системы. В таком же системном аспекте, по-видимому, необходимо рассматривать и процесс физико-химического взаимодействия ксенобиотиков-ионов с мембранами в живой клетке.
Решение этой проблемы требует развития таких методов исследо вания, которые позволяли бы следить за распределением органических ионов (в том числе фармакологических препаратов) внутри живой клетки и одновременно регистрировать характеристики мембран. На сегодня, покалуй, единственным методом, который в принципе позволяет проводить такие исследования, является метод флуоресцентных зондов.
Основная цель данной работы заключалась в том, чтобы разработать и применить систему флуоресцентных измерений для изучения состояния живой клетки, позволяющую:
- следить в реальном масштабе времени за проникновением низко-молекулярных заряженных ксенобиотиков в живую клетку и за их распределением по клеточным компонентам;
- исследовать влияние заряженных ксенобиотиков на проницаемость, поверхностный заряди трансмембранный электрический потен-циал мембран в живых клетках;
- выяснить, как результат взаимодействия зарякенных ксенобиотиков с живой клеткой зависит от свойств их молекул, с одной стороны, и от физико-химических свойств (прежде всего электрических) клеточных мембран, с другой стороны.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- найти витальный флуоресцентный зонд-катион для исследования поверхностных и трансмембранных электрических потенциалов в клетках и исследовать его основные свойства;
- сформулировать математическую модель взаимодействия заряженных молекул - в том числе флуоресцентных зондов - с мембранами в живых клетках;
- разработать тесты с двумя противоположно зарякенными зондами для оценки состояния мембран в клетках разных видов;
- с помощью флуоресцентных тестов и на основе модели исследовать действие группы заряженных ксенобиотиков на мембранный аппарат живых клеток.
В результате проведенной работы был найден новый полихроматический флуоресцентный зонд-краситель катионного типа 4-(п.-диме тиоаминостирил)-І-метилпиридиний (ДСМ). Он позволяет получать информацию о градиентах электрических полей в мембранах живых клеток и о действии на некоторые характеристики мембран ксенобиотиков, которую трудно (или даже невозможно) получить другими способами. В то же время, ДСМ является флуоресцентной молекулярной моделью ксенобиотиков-катионов типа местных анестетиков.
Роль биомембран в создании асимметричного распределения заряженных красителей между живой клеткой и средой
Сегодня хорошо известно, что биологические мембраны по отношению к органическим и неорганическим ионам представляют собой сложные кинетические барьеры, обладающие как фазовыми, так и другими физико-химическими свойствами: поверхностным зарядом, вязкостью, трансмембранным потенциалом, определенным соотношением белок/липид и т.д. /24, 42, 87, 108, 136, 167, 186, 209, 328,463/. Этот вывод является итогом изучения взаимодействия органических и неорганических ионов с модельными и изолированными из клетки мембранам на основе различных биофизических методов, среди которых успешное применение нашел метод флуоресцентных зондов /44, 47, 67, III, 257, 295, 306, 363, 365, 456/. На таких мембранах оказалось возможным изучать независимо влияние каждого физико-химического параметра мембраны на проникновение через нее флуоресцирующих молекул и ионов. Плазматическая мембрана. В экспериментах с радиоактивными ионами /26, 42/ и с флуоресцентными красителями-катионами цианино-вого ряда /263, 338, 339, 361, 457, 475/ продемонстрирована существенная роль плазматических мембран различных видов клеток в создании асимметричного распределения органических и неорганических ионов между цитоплазмой и наружной средой. Концентрация ионов /\/а+, Ca t К по обе стороны мембраны клетки регулируется системой активного транспорта, включающей АТФ-азы /24, 87, 116, 121, 124, 415/ трансмембранный потенциал, возникающий на плазматической мембране в результате активного переноса ионов Na+ из цитоплазмы наружу, в свою очередь, может являться источником энергии для закачивания проникающих органических катионов, в том числе красителей /42, 44, 108/. Процесс диффузии малых заряженных молекул через мембрану клеток обычно рассматривают в рамках электродиффузной модели Нернс- та-Планка /42, 43/. Б соответствие с этим подходом поток (Ф) (в ь\оляф ы ) ионов через мембрану зависит от их концентрации в мембране (Ґ ), подвижности ионов (it) и от градиента электрохимического потенциала (а) в мембране: $=-тІ- (і) где = Шг+г/ . Здесь г - заряд молекул, - число Фарадея, R - газовая постоянная, f - потенциал в точке х. Согласно модели Нернста-Планка мембрана по отношению к прони-. кающим молекулам и ионам является однородной фазой. Однако, ионы многих красителей обладают амфифильными свойствами и, благодаря этому, ДОЛЕНЫ располагаться, преимущественно, не в толще мембранной фазы, а вблизи ее поверхности (в интерфазе) /44, 66, 67, 136/. А поскольку две поверхности мембраны могут заметно отличаться по своей структуре /24, 87, 169/, то в общем случае распределение амфифильных заряженных молекул в мембране может иметь асимметричный характер. Однако, эта асимметрия в современных теоретических работах не учитывается. На сегодня остается актуальной проблема построения электродиффузной модели, учитывающей поведение заряженных молекул на поверхностях плазматической мембраны. В определенной степени успех решения этой проблемы зависит от получения конкретных экспериментальных данных о взаимодействии красителей-ионов с поверхностями биологических и модельных мембран. С другой стороны, на диффузию ионов в клетку и на связывание их с внутренней поверхностью плазматической мембраны должны оказывать влияние внутриклеточные мембранные системы и, прежде всего, те, на которых формируется градиент электрического поля. Б связи с этим существует более общая проблема - применение электродиффузной модели для описания процесса аккумуляции заряженных органических молекул (в том числе красителей) в живой клетке с учетом их взаимодействия с внутриклеточными мембранами и органеллами. Митохондрии. Б последние годы появляется все больше экспериментальных данных, свидетельствующих о важной роли митохондрий в создании ионного гетерогенитета в цитоплазме живой клетки. Установлено, что подавляющее большинство животных и растительных клеток содержат в цитоплазматическом пространстве множество митохондрий. Так, в лимфоцитах - свыше 30 митохондрий /384, 406/, в инфузориях, яйцеклетках, гепатоцитах, нервных клетках - число митохондрий может достигать 1000 /173, 210, 334/. Б цитоплазме митохондрии часто располагаются определенным образом. Например, в клетках простейших они локализуются вблизи ки-нетосом /334/, а нервных клетках имеется два пула митохондрий -вблизи ядра и вблизи мембраны /97/, в сперматозоидах митохондрии сосредоточены в хвостовой части /59, 213/. В целом ряде исследований обнаружено, что изменение физиологического состояния клеток приводит к изменению объема митохондрий и характера их распреде-ления в цитоплазме /57, 107, 123, 142, 161, 163, 205, 218, 334, 379, 410/. Уже на основании этих морфологических данных можно предполагать, что характерная гранулярная картина цитаплазмы клеток, которая наблюдается в фазовом контрасте и при окрашивании клеток основными красителями /107, 154, 197/, обусловлена прежде всего митохондриями. Такое же заключение можно сделать, исходя из современных представлений о свойствах митохондриальных мембран. Согласно хемо-осмотической концепции /390/ главной особенностью митохондриальных мембран является способность генерировать трансмембранный электрический потенциал (минус внутри) и трансформировать его в химическую энергию при синтезе молекул АТФ. Митохондрии, имеющие трансмембранный потенциал, обычно называют энергизированными. В ряде исследований показано, что энергизированные митохондрии являются "аккумуляторами" различных проникающих катионов как органических /184, 185, 245, 299/, так и неорганических /57, 79, 106, 188, 252, 379, 386, 470/. Установлено, что молекулы абсорбционных красителей типа сафранина (в том числе янус зеленый) /138, 230, 254, 364/ и флуорохромы типа 2-(а-днметиламиностирил)-1-ме-тилпиридиния(ДАСГВД)/249, 387/, а также родамин (6 Ж; 123), этил-родамин /13, 345, 473/ при физиологических рН находятся в катион-ной форме и накапливаются в энергизированных митохондриях клеток. Для понимания общих закономерностей и выявления особенностей взаимодействия ионобразующйх ксенобиотиков с митохондриями важное значение имеют данные, полученные на изолированных митохондриях и субмитохондриальных частицах (СМЧ) (см. Приложение, П). Исходя из анализа этих данных, можно заключить, что перераспределение ионобразующйх красителей в цитоплазме живых клеток в значительной степени должно быть обусловлено изменениями трансмембранных потенциалов на мембранах митохондрий. На фоне этого эффекта могут иметь место и другие явления: изменение ионного состава в цитоплазме, митохондриях и других органеллах, связанные с изменением рН внутри /51, 79, 128, 292, 329/, изменением поверхностного заряда на внутриклеточных мембранах /66, 240/. Для уточнения природы цитоплазматических гранул, накапливающих основные и кислые красители, необходимо изучать распределение в тех Ее клетках катионных красителей, которые положительно заряжены в широком диапазоне рН и накапливаются внутри клетки по градиентам электрических полей; для этой цели наиболее удобен ка-тионный флуоресцентный зонд ДАСПМИ /249/. Ядро. Асимметричное распределение красителей катионного типа между клеткой и окружающей средой обусловлено не только накоплением в цитоплазме, но и связыванием с ядерными структурами /84, 138, 197/ (см. Приложение, Ш). В настоящее время не выяснена роль ядерной мембраны в регуляции распределения ионобразующих красителей между кариоплазмой, цитоплазмой и наружной средой; не установлены конкретные причины, вызывающие увеличение концентрации красителей в кариоплазме и в хроматине при паранекротической реакции клетки /138, 158/. Это существенно осложняет интерпретацию флуоресцентных изменений в ядрах окрашенных живых клеток /261/; в связи с этим наиболее широкое распространение ядерные флуорохромы получили как "маркеры " нуклеиновых кислот в фиксированных клетках /84, 96/. Анализ данных литературы о распределении красителей и флуоро-хромов в живых клетках при их различном физиологическом состоянии позволяет указать на две закономерности: - красители анионного типа слабо аккумулируются цитоплазмой и митохондриями живых клеток, но степень их аккумуляции резко возрастает в поврежденных и мертвых клетках; - красители катионного типа аккумулируются в живых клетках в высокой концентрации и преимущественно локализуются в мембранах, митохондриях и ядре. Имеется ряд экспериментальных данных, что именно с влиянием на эти субклеточные структуры связаны токсичные эффекты катионных красителей и фяуорохроыов в живых клетках. 1.3.
Ксенобиотики
В качестве флуоресцентных зондов Б работе использованы следующие флуоресцирующие соединения: - Си-фенил)-1-амино-8-сульфонафталин (АНС) фирмы "Serva" (ФРГ); - 3-метоксибензантрон (МБА), любезно предоставленный Б.М.Красо-вицким (НПО "Монокристаллреактив", г Ларьков); - а-толуолсульфонат 4-(диметиламиноотирил)-1-метилшридиния (ДСМ), синтезированный Г.Я.Дубуром и Р.Р.Дубуре в Институте органического синтеза АН Латв.ССР, Взаимодействие зондов МЕА и АНС с модельными и биологическими мембранами исследовано ранее /44, 60, 66/; изучение флуореоцент-ных свойств ДСМ в модельных системах и биоструктурах является предметом исследования данной диссертации и рассматривается в главе 5. 3.2. Ксенобиотики В качестве ксенобиотиков на клеточных объектах испытывались указанные выше флуоресцентные зонда и другие ионобразующие соединения (флуоресцирующие и нефлуореоцирующие) о известным типом биологического или фармакологического действия (табл. 2), В экспериментах использованы химически чистые вещества (в том числе фармакологические препараты отечественного производства).Синтетический биостимулятор крезацин и его производное - натриевая соль крезоуксусной кислоты (КУ) /48, 49, 198/ синтезированы М.Г. Воронцовым и Н.В.Семеновой в Институте органического синтеза СО АН СССР (г. Иркутск). 3.3. Объекты исследований 3.3.1. Модельные системы и изолированные биоотруктуры Исследование свойств зонда ДОМ в модельных мембранах проводилось на униламеллярных лапосомах.
Липооомы формировали путем быстрого впрыскивания этанольного раствора яичного фосфатидилхолина (30 мг/мл) в перемешивающийся буферный раствор (0,01 М трис«НСЬ, рН 7,5) до концентрации этанола не выше 1% /247/. Использовали фосфатидилхолин производства завода "Бакпрепараг" (г.Харьков). Липооомы, полученные таким способом, имеют одну бислойную оболочку, однородны по размерам (средний диаметр 40-50 нм) /44, 60/. Исследования проводили на липосомах, приготовленных из маточной суспензии липосом (2 г/л), путем разведения ее буфером до конечной концентрации 0,4 г/л. В качестве заряженных лигандов в опытах на липосомах использовали линоленовую кислоту (для создания дополнительного отрицательного заряда на поверхности мембран) и бромид цетилтриметил-ам-мония ШТАБ) (для создания положительного заряда на поверхности мембран) /60, 105/. При исследовании взаимодействия ДСМ с полимерами в растворах использовали твин-40 фирмы "Ferrak " (Берлин), гепарин фирмы "Spofa " (ЧССР), декстрансульфат фирмы "Pharmacia " (Швеция), натриевую соль РНК производства Олайнского завода, натриевую соль ДНК из эритроцитов цыплят фирмы "Reanai "(Венгрия) и ДНК, выделенную из тимуса теленка по методу Кэя с некоторой модификацией /77/. Конечные концентрации нуклеиновых кислот и остальных полимеров в буфере (0,01 М трис-HCI СрН 7,5) были соответственно 0,1 г/л и 0,5 г/л. Флуоресцентные свойства ДОМ в изолированных биомембранах исследовали на микросомах (из печени крыс), любезно предоставленных В.О.Жихаревой (ШИЛ 2-го МОЛГЩ), и на тенях эритроцитов человека, полученных Н.Н.Полухиной (НИИ по БИХС) по методу Доджа /297/. В качестве буфера в опыте с микросомами использовали 0,01 трис-НСІ (рН 7,5), в опыте с тенями эритроцитов гипотонический безглюкозный фосфатный раствор (содержащий 7 мМ иа НРО и 10 мМ аН2Р04), рН 7,4. Содержание белка в микросошх определяли по методу Лоури /378/. В экспериментах использованы клеточные ядра, выделенные Т.А. БарщевскоЁ (ЦНШЕ 2-го М0ЛШИ) из печени белых беспородных крыо по методу, описанному в работе /464/. 3.3.2. Кише объекты Исследование флуоресценции зондов в клетках при различных экспериментальных условиях проводили на следующих объектах: теграхи-менах, сперматозоидах речного вьюка, клетках женьшеня, дрожжевых клетках, ядерных эритроцитах морского моллюска, эритроцитах человека, лимфоцитах из тимуса крыс, эмбрионах морского ежа, почках и печени живых крыс. Тетрахимены. В работе использовали безмикронуклеусный штамм Setrabymena pyriformie . Культура тетрахимен была любезно предоставлена Н.А.Меркуловой (Институт цитологии АН СССР, г.Ленинград). В нашей лаборатории культура клеток велась В.М.Голициным. Культуру поддерживали в пробирках в стерильном боксе при 28 С на среде, содержащей 0,2$ дрожжевого экстракта и 0,6$ аминопептида (отечественного производства), а также минеральные соли, в количестве, рекомендуемом Френкелем /313/. Для получения культуры тетрахимен в логарифмической и поздней стационарной фазах использовали методику, описанную в работе /93/. Для сравнительного исследования энергетического состояния тетрахимен брали пробы из двух колб, в которых клетки находились на указанных выше отадиях роста, и в виде капли наносили на стекло. Остановку тетрахимен на стекле производили путем их прижимания покровным стеклом (без механического повреждения) и отсасывания избытка среды между стеклами фильтровальной бумагой. Сперматозоиды. Сперматозоиды выделяли из семенников речного вьюна. Суспензию сперматозоидов приготавливали на физиологическом растворе с добавлением дистиллированной воды до 1/20 объема. Для исследования каплю суспензии клеток наносили на предметное стекло, равномерно распределяли по стеклу на площади в І см и покрывали покровным стеклом.
Для фотографирования неподвижных жизнеспособных сперматозоидов использовали суспензию клеток, приготовленную на физиологическом растворе. Клетки культуры женьшеня. Культура клеток штамма женьшеня Panax ginseng с.А. Mey (Araiiacence ), выращиваемого в Ленинградском химико-фармацевтическом институте на агаризованной питательной среде, была любезно предоставлена Л.И.Слепян. Штамм рос в обычных условиях культивирования / 187/ при температуре 26І+ІС в темноте, В эксперименте использовали клетки в стадии стационарного роста. Суспензию клеток приготавливали на культуральной среде, как описано в работе /65/. ДрОЖЖеВЫе КЛеТКИ. В работе ИСПОЛЬЗОВаЛЙ КЛеТКИ ВИДа Sacchar Cerevisiae , выращенные Т.Н.Сахаровой (НИИ по БИХС) на твердой питательной среде. Для исследования небольшое количество биомассы снимали с твердой среды проволочной петлей, переносили в пробирку с физиологическим раствором и дезагрегировали сгекланной палочкой. Эритроциты. В экспериментах использовали эритроциты человека, полученные из донорской крови (Институт гематологии и переливания крови АМН СССР) путем трехкратного ее отмывания в безглюкоз-ном изотоническом фосфатном буфере методом центрифугирования при 2000 об/мин, и ядерные эритроциты, полученные из крови морского моллюска Anadara . Суспензию ядерных эритроцитов приготавливали на морской воде. лимфоциты. В экспериментах использовали лимфоциты, выделенные из тимуса белых беспородных декапитализированных крыс по методу, описанному в работе /29/. Тимоцию отмывали средой Хенкса (Институт полиомеэлита и вирусных энцефалитов, Москва) путем центрифугирования суспензии клеток в этой среде в течение 10 мин при 2000 об/мин. Жизнеспособность лимфоцитов оценивали по тесту с трипановым синим; в контрольных клетках она составляла 93-96$. До проведения экспериментов приготовленные суспензии эритроцитов и лимфоцитов выдерживали при комнатной температуре в течение I часа с целью их адаптации. Переживающие клетки хранили в темноте при температуре 5С. Эмбрионы. В работе использовали эмбрионы морского єна вида strongyloceivtrotus Dr dbachiensis . Выделение яйцеклеток и сперматозоидов морского ежа, оплодотворение яйцеклеток и получение эмбрионов на различных ранних стадиях развития проводила Л.А.Протозанова по методике Г.А.Бузникова /37/. Почка и печень С in vivo). Исследование распределения зондов в почках и печени живого организма проводили на белых беспородных крысах весом 150-200 г, наркотизированных 20 -ным раствором урета- на из расчета I г на I кг веса животного (введение внутримышечное) и оперированных в области брюшины. Операцию вывода почки из брюшины наружу производили, как описано ранее в работе /16/.
Взаимодействие с фосфолипидными мембранами
Если ДСМ связывается с фосфолипидом, то основные характеристики его флуоресценции в липосомах (ЖІС) должны изменяться в ту же сторону, как и при переходе ДСМ из полярного растворителя в неполярный. На рис. 12 представлены спектры возбуждения и флуоресценции ДСМ, полученные в суспензии липосом из яичного фосфатидилхоли-на. Как можно видеть, при возбуждении длиной волны 430 нм максимум флуоресценции смещается влево ( Лп = 590 нм), а сам спектр несколько уширяется ( дА = 120 нм) по сравнению со спектром ДСМ в воде. Последнее позволяет думать, что спектр флуоресценции ДСМ в липосомах является суммой нескольких спектров с различными максимумами при одной и той же длине волны возбуждения, т.е. имеется более чем одна флуоресцентная форма ДСМ в мембране. Как известно, такая ситуация весьма типична для мембранных флуоресцентных зондов (например, МБА, ДМХ) /44, 75/. Эксперимент показал, что изменяя длину волны возбуждения, можно получить в липосомах точно такой же спектр флуоресценции ДСМ, как и в воде ("красную" форму). Таким образом одна флуоресцентная форма выявлена (рис. 12, спектр 4). Но должны быть и другие формы, более коротковолновые, которые уширяют спектр и сдвигают его максимум в коротковолновую сторону. Какие они? Сколько их? Если из общего спектра флуоресценции вычесть красную компоненту, то разностный спектр имеет максимум в зеленой области. Таким образом, возможно, имеется "зеленая" форма флуоресценции ДСМ в ли-посомах. По-видимому, эти формы флуоресценции ДСМ отражают различные способы расположения молекул зонда в мембране. Как мы видели, спектры флуоресценции ДСМ в воде и связанного с мембраной в "красной" форме, оказались идентичны. Это позволило предположить, что часть молекул зонда гидрофобно адсорбируется на поверхности липида, располагаясь параллельно поверхности мембраны.
Такой способ связывания ДСМ с мембраной будем называть "гидрофобным прилипанием". В результате адсорбции на поверхности мембраны квантовый выход флуоресценции ДСМ должен возрасти, что и наблюдалось в эксперименте по росту интенсивности красной флуоресценции, "Зеленую" флуоресценцию ДСМ долкны давать молекулы, которые вертикально погружаются в липид. Такой способ связывания с мембраной будем называть "гидрофобным погружением1; При этом погружении молекула зонда переходит в менее полярную среду. Поэтому мы наблюдаем "позеленение" флуоресценции и рост ее интенсивности. Согласно /67/, молекула типа ДСМ может гидрофобно погрузиться в липид, замещая I молекулу фосфолипида на поверхности мембраны. Такие молекулы оказываются в окружении фосфатов, ориентированных только двумя способами. Как показано в работе /67/, этим двум ориентациям соответствуют 2 фосфата (2Ф) и 3 фосфата (ЗФ), повернутые к молекуле зонда (рис. 13). Обе эти ситуации должны давать свой вклад во флуоресценцию ДСМ: молекулы зонда в. положении 2Ф дадут более коротковолновый спектр, чем в положении ЗФ. Однако, обе они будут более коротковолновыми, чем "красная" форма флуо- .реоценции ДОМ. В случае незаряженного зонда ДМХ формы 2Ф и ЗФ равновероятны /67/, но в случае катиона ДСМ форма ЗФ может быть более вероятна, чем 2Ф. Таким образом, установлено, что флуоресценция ДСМ в фосфолшіид-ных мембранах неоднородна. Красную флуоресценцию дают молекулы ДСМ, адсорбирующиеся на поверхности мембраны; зеленую флуоресценцию - молекулы зонда» погруженные в липид. Возможно, эта зеленая флуоресценция в свою очередь является суммой двух флуоресценции: более коротковолновой при ориентации фосфатов около молекулы ДСМ (2Ф) и более длинноволновой при их ориентации (ЗФ). В соответствие с нашими данными можно считать, что наиболее коротковолновая форма флуоресценции ДСМ имеет максимум приЛф=520 нм. 5.2.2. Энергия взаимодействия ДСМ с фосфолипидной мембраной: теоретическая оценка Как показал эксперимент, прирост интенсивности флуоресценции ДСМ с ростом концентрации липосом происходит линейно (рис. 14). Поскольку даже при I г/л липосом доля связанного ДСМ мала, то непосредственно в эксперименте не удается достичь полного насыщения мембран зондом (т.е., когда большинство центров связывания в мембранах заняты молекулами ДСМ) и тем самым определить константу связывания ДСМ о фосфолипадом. Поэтому мы попытались приблизительно оценить коэффициент распределения ДСМ между фосфолипидом и водой (К-) теоретическим путем. С этой целью оценим свободную энергию взаимодействия ДСМ с фосфолипидной мембраной, которая однозначно связана с К- /45, стр. 109/: д & является суммой энергий гидрофобного взаимодействия ( Д &Г9) молекулы ДСМ с водой и кулоновского взаимодействия ( д vac) заряда молекулы зонда с его отражением вблизи границы двух сред вода-мембрана: A G = ДСГФ Д&эс (?) Величины этих энергий будут различными для двух возможных положений молекулы ДСМ в мембране: "вертикального погружения" и "горизонтального прилипания". Глубина погружения заряженной молекулы ДСМ в мембрану по нормали к ее поверхности определяется балансом д (?ГФ и д &эс . Сначала оценим величину д гФ , приходящуюся на I атом углерода в предельных и непредельных углеводородах.
Величина Д г р определяет растворимость углеводородов в воде. Растворимость спиртов в воде при увеличении числа звеньев СН2 согласно /193/ изменяется так: энергия переноса молекулы спирта из спирта в воду, то Agw3RT[ CCa)-La(Cft+,)] - - разница энергий растворения предыдущего и последующего спиртов в воде. Как следует из этой таблицы, в среднем» на одно звено Сй2 приходится примерно ДЗг р =0»6 ккал/моль. При встраивании молекулы ДСМ в мембрану атомы углерода удаляются из воды, и энергия гидрофобного взаимодействия при переходе ДСМ в мембрану будет пропорциональна до,гч, и числу погруженных в липид атомов углерода ДСМ. Изменение энергии гидрофобного взаимодействия при встраивании молекулы зонда вдоль нормали к поверхности мембраны представлено на риси 16, где д&г р определяли из расчета 0,6 ккал/моль на каждый атом углерода в молекуле ДСМ. Теперь оценим энергию кулоновского взаимодействия ДСМ с фосфо-липидом. Распределение одного положительного заряда ДСМ в невозбужденной молекуле по данным /375/ представлено на рис. 15. Будем для упрощения расчетов считать, что весь заряд молекулы ДСМ сосредоточен около атома азота пиридинового кольца (точнее, на рас- о стоянии 12 А от края молекулы со стороны диметиламиногруппы). Заряд ДСМ переносится из водной среды с (= 80 в среду с данной . Поскольку между водой и углеводородной областью мембраны (с 6-2) имеется переходный слой с концентрацией воды около 7,7 М /44/, то g «(80 - 2)» rZ + 2 - із. Согласно теории /IT?/, перенос заряда из среды с в среду с 6г даст положительную электростатическую энергию из-за взаимодействия заряда с собственным отраженным зарядом, локализованным во второй среде.
ДСМ и АНС как флуоресцентные индикаторы некрозных клеток
Б ходе экспериментов обнаружено, что после добавления ДСМ или АНС к кивым клеткам (на стекле) в поле зрения микроскопа выявляется несколько очень ярких клеток (5-10$). В случае ДСМ яркая флуоресценция в этих клетках обусловлена ядром, а в случае АНС -в основном, мембранами и митохондриями. Окрашивание лимфоцитов трипановым синим показало, что яркие клетки, проявляющиеся в первую минуту после инкубации с ДСМ или АНС, являются мертвыми, т.е. необратимо поврежденными клетками. Спустя 30 мин от начала инкубации клеток с ДСМ митохондрий в мертвых клетках остаются бледно-зелеными или совсем не видны, а интенсивность красной флуоресценции в ядре в 10-20 раз выше, чем в живых, но деэнергизированных клетках (рис. 30). Таким образом, по характеру аккумуляции ДСМ в клеточных ядрах (в первые минуты инкубации клеток с зондом) можно обнаружить клетки с необратимыми изменениями в мембранах и хроматине. 6.5. Оценка мембранных потенциалов в живых тимоцитах с помощью зонда ДСМ На суспензии лимфоцитов по флуоресценции ДСМ невозможно оценить величины д Ya я АЧ . + дУ » так как максимумы флуоресценции связанного ДСМ изнутри митохондрий и в ядре практически совпадают. Чтобы измерить эти потенциалы, необходимо иметь возможность регистрировать флуоресценцию зонда с участка цитоплазмы отдельной клетки, содержащего митохондрии. Такую возможность предоставляет микрофлуориметр.
Предлагаемый микрофлуорометрический способ оценки суммы трансмембранных потенциалов на внешней и митохондриальных мембранах отдельной живой клетки основан на регистрации красной флуоресценции ДСМ (при Аф = 605 нм) в участке скопления митохондрий. Рассмотрим результат типичного эксперимента, полученный на ти-моцитах одной крысы. Из данных экспериментов, описанных выше, следует, что через 20 мин после добавления ДСМ к суспензии тимоцитов прекращается рост красной флуоресценции зонда в митохондриях и можно считать, что концентрация свободного ДСМ внутри митохондрий близка к равновесной (). Чем выше концентрация ДСМ во внешней среде (CQ), тем выше равновесная интенсивность его флуоресценции внутри митохондрий (рис. 31а), пока величина CQ не достигнет 0,15 мкМ: дальнейший рост CQ уже не приводит к увеличению интенсивности флуоресценции митохондрий. Такое "насыщение" флуоресценции могло бы быть обусловлен двумя причинами: 1. Концентрация свободного зонда во внутримитохондриальной среде (Ср) достигла предела растворимости (обозначим его Cg_a). Поэтому количество зонда, связанного с внутренней стороной мито-хондриальной мембраны, - а вместе с ним и флуоресценция митохондрий - тоже перестали расти. "Избыточный" зонд, который, возможно, продолжает накапливаться внутри митохондрий (при GQ 0,15 мкМ), кристаллизуется и поэтому не вызывает повышения С2 и F . 2. Концентрация свободного зонда во внутримитохондриальной среде достигла величины (обозначим ее С- ), при которой практически: все центры связывания зонда с мембраной заполнены зондом, поэтому дальнейшего связывания и роста флуоресценции не происходит. Если внутри митохондрий ДСМ связывается с мембраной, попадая в нее из водной среды, то оценкой для величины С2_а может служить предел растворимости ДСМ в физиологическом растворе; по нашим данным он равен (1,5+0,3) мМ. Оценка для величины G2-6 П0ЛУчена ПРИ измерении роста интенсивности флуоресценции ДСМ в суспензии де-знергизированных митохондрий , когда С2 CQ (рис. 316). Из этих данных следует, что С близка к 0,7+0,2 мМ (если д f на мембране полностью отсутствует) или выше 0,7 мМ (если АЧ не снято полностью). аким образом, можно полагать, что при концентрации ДСМ во внешней среде CQ = 0,15 мкМ его концентрация в водной фазе внутри митохондрий лимфоцита (Cg) находится между 0,7 и 1,5 Ж (в среднем - (1,1+0,5) мМ). При концентрации лимфоцитов менее 10 мл-1 накопление ДСМ в клетках мало отражается на С0 (не более, чем на I0S8). л Q = д +д G2=-RTlfiCC/Co) (49) где д G - свободная энергия переноса I моля ДСМ4" из внешней среда в митохондрии; из наших данных следует д +д&=-ЙТлШ00/0,15) = 5,4+0,2 ккал/моль і 2 . Если аккумуляция однозарядного катиона ДСМ в митохондриях обусловлена трансмембранными электрическими полями на цитоплазмати- х) Митохондрии выделяли из печени крыс и деэнергизировали выдерживанием в растворе 0,1 мМ 2,4-динитрофенола; 0,21 М сахарозы; 35 мМ KCL; 3 мМ фосфата; 3 мМ ЭДТА; 10 мМ трис; 10 мг/мл альбумина, рН 7,4 при 4С в течение 24 часов. ческой и митохондриальной мембранах клетки, то сумма потенциалов этих полей, соответствующая 5,4 ккал/моль, согласно уравнению (21) будет: У=д? + s "58 (С2/Со} = ( 232±І0 мБ Б других экспериментах на тимоцитах крыс мы не получали более высоких значений суммы этих потенциалов. Среднее значение 4 1 А% полученное в 9 экспериментах, составило-(200+5) мВ с дисперсией - 17 мВ. Согласно результатам других исследователей /43/, величина потенциала на плазматической мембране тимоцита ЛТІ60 мВ. Тогда (в соответствие с нашими данными) потенциал на мембранах митохондрий тимоцита д 170 мВ. Предложенный микрофлуорометрический метод на сегодня является единственным методом, который позволяет оценивать 4 + дУ2 и дУ непосредственно в составе живой клетки. Этот метод имеет то преимущество, что не требуется знать объем клетки и митохондрий, количество накопленного зонда, или проводить аналогии между естественной способностью клетки аккумулировать зонд и накоплением зонда, навязанным ей извне под действием валиномицинового потенциала; можно сопоставлять данные флуорометри» суспензии клеток (органелл), окрашенных ДСМ, с реальной картиной аккумуляции зонда в органеллах клеток. Поскольку полученная выше оценка л% соответствует величине митохондриального потенциала, измеренного другими способами /103, 127, 387, 391/, моано полагать, что накопление ДСМ внутри митохондрий, по крайней мере, до предела его растворимости не приводит к ингибированию или шунтированию ионных насосов. Действие ДСМ на живые клетки Практически все известные флуоресцентные зонды и красители в той или иной степени токсичны для живых клеток. Многие из них сильно повреждают мембранные структуры и влияют на состояние ядерного хроматина (см. гл. 1,2). Поскольку зонд ДСМ связывается с мембранами клеток, накапливается в митохондриях и ядре, то он неизбежно должен вызвать изменения в этих субклеточных структурах.
Данные, представленные ниже, демонстрируют влияние ДСМ на мембраны, митохондрии и ядро живых клеток и обосновывают выбор нетоксичных концентраций зонда при работе с разными видами клеток. 6.6.1. Влияние ДСМ на подвижность клеток Подвижность клеток может являться одной из эффективных характеристик их жизнеспособности. Движение автономных клеток обеспечивается ресничками или жгутиками и требует затрат энергии, запасаемой в митохондриях /40/. При воздействиях на такую клетку, затрагивающих мембранные структуры или (и) энергетику митохондрий, могут изменяться скорость, направление и форма траектории движения клетки. Чтобы обнаружить подобные изменения, был проведены испытания ДСМ на различных видах движущихся клетках (тетрахименах, сперматозоидах речного вьюна). Исследование показало, что даже при высоких концентрациях ДСМ (0,5 мМ) характер движения этих клеток меняется только в первые минуты после добавления ДСМ: наблюдается искривление траектории, реверсия движения. Однако через 15-20 мин клетки полностью "адаптируются" к присутствию зонда: харак- тер их движения перестает отличаться от движения контрольных клеток (без ДОМ), Важно подчеркнуть, что подвижность клеток в присутствий ДОМ сохраняется по крайней мере в течение двух часов. Чтобы установить, возникают ли изменения в движении клеток при длительном воздействии ДСМ на них, был поставлен ел едущий опыт. Движущиеся тетрахимены фотографировали в свете флуоресценции при экспозиции 4 с (рис. 32а). Суспензию окрашенных клеток оставляли в темноте на 24 часа, и затем клетки снова фотографировали при тех же условиях (рис. 326).
