Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор
1.1. Изучение механизмов проводимости биологических ионных каналов 10
1.1.1. Многообразие каналов клеточных мембран: характеристика , классификация 10
1.1.2. Методы изучения ионных каналов с помощью регистрации трансмембранных токов 19
1.1.3. Свойства катион-проводящих каналов клеточных мембран 24
1.1.4. Современные представления о механизмах проводимости ионных каналов 27
1.2. Моделирование ионных каналов клеточных мембран 31
1.2.1.Транспорт ионов в бислойных липидных мембранах 31
1.2.2. Нанометровые поры ПЭТФ мембран как модели биологических ионных каналов 36
1.2.3. Моделирование блока проводимости на нанометро-вых порах полиэтилентерефталатных мембран 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы.
2.1. Получение пор в полиэфиленфереффалафных (ПЭТФ) мембранах 51
2.2. Получение грамицидиновых каналов в бислойных
липидных мембранах и исследование их характеристик 52
2.3. Исследования электрохимических характеристик на-нометровых пор ПЭТФ мембран 53
2.4. Измерение селективности ПЭТФ мембраны. 55
2.5. Условия проведения экспериментов 56
2.6. ОбрабоФка результатов экспериментов 57
ГЛАВА 3. Результаты исследований.
3.1. Характеристика модельных систем — нанометровых пор ПЭТФ мембран 59
3.2. Действие органических катионов на модельные системы - нанометровые поры ПЭТФ мембран 66
3.2.1. Исследование действия шестизарядного комплексного катиона рутениевого красного 66
3.2.2. Исследование действия амилорида на проводимость пор ПЭТФ мембран и билипидных мембран, модифицированных грамицидином. 71
3.2.3.Действие местных анестетиков на проводимость и селективность нанометровых пор ПЭТФ мембран 76
ГЛАВА 4 Обсуждение... 85
Выводы 95
Список литературы 96
- Многообразие каналов клеточных мембран: характеристика , классификация
- Нанометровые поры ПЭТФ мембран как модели биологических ионных каналов
- Исследования электрохимических характеристик на-нометровых пор ПЭТФ мембран
- Исследование действия шестизарядного комплексного катиона рутениевого красного
Введение к работе
Актуальность проблемы. Транспорт ионов через каналы клеточных мембран играет существенную роль для обеспечения ионного гомеостаза клетки и процессов передачи сигнала, а также для реализации специализированных функций, включая проведение импульса по нервному волокну, мышечное сокращение, преобразование энергии, рецепцию и т. д. Важное значение имеют такие свойства ионных каналов, как избирательная проницаемость и способность к открыванию и закрыванию при смещении трансмембранного потенциала или при взаимодействии с гормонами и агонистами внеклеточной среды. Изучение физико-химических основ работы каналов клеточных мембран необходимо для понимания функционирования клетки, а также для решения практических задач биотехнологии, медицины, фармакологии и т.д.
Последние годы отмечены интенсивным развитием фундаментальных исследований принципов организации ионных каналов, в том числе и с использованием различных модельных систем (Korchev et al.,1995; Siwy et al., 2002). Как известно, наиболее распространенными моделями клеточных мембран являются бислойные липидные мембраны (БЛМ). Возможность шире варьировать экспериментальные условия, чем на чувствительных клеточных мембранах является большим преимуществом БЛМ для изучения физико-химических основ транспорта ионов. Как всякая модель, БЛМ имеют и свои достоинства, и недостатки: при относительной близости к нативным мембранам по химическому составу данные модели в условиях эксперимента могут быть весьма нестабильны и не способны выдерживать сильные колебания различных физико-химических воздействий (рН, давление, величина подаваемого на мембрану напряжения). Поэтому выяснение механизмов ионного транспорта с использованием новых модельных систем - нанометровых пор из полиэтилентерефталата (ПЭТФ) представляет особый интерес (Pasternak et al.,1995; Pasternak et al.,1993). Исследования особенностей проводимости пор ПЭТФ мембран позволяют получить информацию о биологических структурах и процессах, происходящих в на-нопространствах на молекулярном уровне. Как показывает анализ литературных данных, изучение свойств сверхузких пор представляет практический интерес для разработки новых способов тестирования биопрепаратов с использованием нанотехнологий.
Результаты проведенных исследований (Lev et al., 1993; Korchev et al.,1997) позволяют полагать, что в экспериментах с применением модельных нанометровых пор могут быть изучены важнейшие особенности ионных каналов клеточных мембран, включая такие свойства как дискретность ионных токов, ионная селективность, нелинейность вольт-амперных характеристик, чувствительность к фармакологическим агентам. Повышенный интерес вызывает исследование механизмов блокирования и феномена аномального выпрямления, характерных для катион-селективных каналов клеточных мембран, в частности для каналов TRP (transient receptor potential) семейства. Важное значение для практической фармакологии и медицины имеет понимание фундаментальных механизмов ингибирующего действия известных физиологически значимых агентов: диуретиков, характеристических блокаторов эпителиальных натриевых каналов; местных анестетиков, известных как модификаторы ионных каналов возбудимых мембран нервных и мышечных образований.
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение проводящих свойств и механизмов блокирования биологических ионных каналов с использованием нанометровых пор в модельных мембранах.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Характеристика проводящих свойств одиночной поры мембраны из полиэтилентерефталата. Выяснение возможностей применения нанометровых пор для моделирования и изучения свойств ионных каналов клеточных мембран.
2. Выяснение особенностей вольт-амперных характеристик нанометровой конической поры и анализ эффектов многозарядного катиона рутениевого красного для понимания феномена аномального выпрямления ионных токов.
3. Исследование действия амилорида на проводимость
а) конических и цилиндрических нанометровых пор ПЭТФ мембран;
б) каналов, образованных антибиотиком грамицидином в билипидных мембранах.
4. Изучение механизма действия местных анестетиков, различающихся по степени липофильности и кислотно основным характеристикам, на проводимость нанометровых пор.
Научная новизна полученных результатов. Для изучения физико-химических основ функционирования ионных каналов клеточных мембран предложена удобная модель - одиночная коническая нанометровая пора мембраны из полиэтиленте-рефталата. Впервые показано действие на проводимость нанометровых пор фармакологических препаратов двух групп -диуретиков и местных анестетиков, а также известного бло-катора катион-проводящих каналов клеточных мембран комплексного катиона рутениевого красного. Предложено новое понимание механизма блокирования на основе действия на проводимость, возникающую в узких нанометровых пространствах, стенки которых имеют поверхностный заряд. Выявлена возможная взаимосвязь нелинейности вольт-амперных характеристик с геометрией поры и существованием поверхностной проводимости.
Теоретическое и практическое значение работы. Выявление механизмов проводимости нанометровых пор ПЭТФ мембран важно для понимания принципов функционирования каналов и пор в плазматической мембране и внутриклеточных структурах. Известная простота модельной системы позволяет получить информацию о протекающих физико-химических процессах, происходящих в нанометровой поре на молекулярном уровне. Принципиальное значение для клеточной биологии имеют выводы о том, что селективность каналов и дискретность регистрируемых токов обусловлены существованием так называемой поверхностной проводимости, возникающей в нанометровых пространствах со стенками, несущими заряды. Разработанная модельная система- с изученными физико-химическими свойствами может быть использована для тестирования свойств фармакологических препаратов, а также для электрического детектирования биопрепаратов. Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Основные положения были представлены и обсуждены на научных семинарах Группы физической химии клеточных мембран Института цитологии РАН, на 3 Всероссийском Биофизическом съезде (Воронеж, 2004), на 7 Всероссийской конференции молодых ученых "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2004).
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста и содержит 19 рисунков и 7 таблиц.
Многообразие каналов клеточных мембран: характеристика , классификация
Живая клетка является элементарной ячейкой биологической организации, обеспечивающей все функции организма. Сочетание транспорта вещества с сохранением и автономностью внутреннего устройства клетки осуществляется единственно возможным способом - для выполнения своих функций клетка отделена от внешней среды полупроницаемой перегородкой. Появление клеточной мембраны в процессе эволюционного развития было важным этапом в процессе возникновения жизни - компартментализации - отделении внутриклеточного содержимого от внешнего мира. С другой стороны, тонкая регуляция внутриклеточных процессов осуществляется на основе пространственного разделения органоидов клетки. Внутриклеточные мембраны служат для компартментализации внутреннего содержания клетки (Волькенштейн,1981).
Биологические мембраны - надмолекулярные системы, протяженность которых значительно превосходит их толщину, имеющую величину порядка 10 нм; все механизмы, ответственные за биологическую функциональность мембраны, локализованы в ее толще. Среди множества явлений, протекающих в клетке и определяющих барьерные свойства клеточных мембран, важное место занимают активный и пассивный транспорт веществ, осмос, фильтрация и биоэлектрогенез.
Ионные каналы являются макромолекулярными порами в мембранах клетки. Не вполне ясно, когда они возникли и какую роль играли на ранних стадиях жизни, но в настоящее время известно, что данные структуры представляют собой важные элементы в клеточных мембранах, т. к. благодаря им осуществляется пассивный транспорт ионов ( Hille, 2001) . Ионная регуляция является одним из важных механизмов управления внутриклеточными процессами. Изменения ионной силы или ионного состава в клетке влияют на агрегатное состояние и характер движения протоплазмы, функциональное состояние органелл, конформацию и взаимодействие биомакромолекул, изменяют активность и специфичность ферментов и мультиферментных систем и т.д. В осуществлении и регулировании различных метаболических процессов в клетке активное участие принимают, прежде всего, ионы металлов. Одновалентные катионы участвуют в регуляции внутриклеточного рН, являются кофакторами многих ферментов, обеспечивают электрические свойства мембран клеток. Ионы Na+ и К+ в клетке распределены неравномерно - ионы натрия выбрасываются из клетки, ионы калия накапливаются в ней. В результате создается разность концентраций одновалентных ионов на клеточной мембране, необходимая для генерации возбуждения в нервных и мышечных клетках. Первично-активный транспорт ионов, осуществляющийся с использованием энергии АТФ или окислительно-восстановительных реакций, происходит с участием транспортных АТФаз. Градиент концентрации одновалентных ионов необходим и для функционирования систем вторично-активного транспорта (в т.ч. .Сахаров и аминокислот). В клетке ионы калия являются активаторами многих ферментативных процессов, в противоположность этому ионы натрия активируют лишь синтез липидов и являются ингибиторами многих клеточных реакций. Кроме того, одновалентные катионы участвуют в регуляции осмотического баланса организма, а также модифицируют конформа-ционное состояние молекул белков и нуклеиновых кислот. Важную роль в жизнедеятельности клетки играют также двухвалентные катионы - Са2+ и Мд2+. Ионы кальция представляют собой единственный вторичный мессенджер животных и растительных клеток. Ионы магния способны модифицировать кон-формационное состояние молекул белков, выступать в качестве субстратсвязывающих ионов и переносчиков электронов, необходимы в качестве кофакторов более чем сотни ферментов, входят в состав фотосинтетического пигмента растительных клеток (Артюхов и др., 2000). Сочетанное функционирование пассивно проводящих ионы трансмембранных ионных каналов и систем активного транспорта обеспечивает необходимый для жизнедеятельности клетки гетерогенитет распределения ионов между внутренней средой клетки (гиало-плазмой) и наружной средой.
Как правило, каналообразующие белки внешних мембран бактерий (а также митохондрий и хлоропластов) образуют большие, относительно неспецифичные поры. На сегодняшний день также хорошо изучены поры, отвечающие за перенос белков в митохондриях. Хотя данная органелла содержит собственный геном, более. 95% митохондриальных протеинов декодируется в ядре, синтезируется в цитозоле и затем импортируется в эту органеллу (Grigoriev et al., 2004). Использование электрофизиологических техник существенно для понимания переноса белков через митохондриальную внутреннюю (рис. 1.1) и внешнюю мембраны. Комплекс белков, отвечающих за подобный транспорт, состоит из одной единицы во внешней мембране митохондрии - ТОМ комплекса, и двух- во внутренней мембране - ТІМ 22 и ТІМ 23 комплексов. ТОМ и ТІМ 23 комплексы изучены лучше чем ТІМ 22, их максимальная проводимость достигает 1000 pS, а величина самих пор 2.5 нм. С точки зрения ионной проводимости описанные выше каналы являются слабокатионселективными. Когда как ТОМ, ТІМ 22 и ТІМ 23 белки являются каналами транспортирующими белки внутрь митохондрии, митохондриальный канал МАС используется для выведения цитохрома С из внутримембранного пространства в цитоплазму (Grigoriev et al., 2004). Диаметр поры данного канала достигает величины 4-6 нм, проводимость от 2 до 5 нСм. Хорошо изученным каналом, ответственным за высокую проницаемость митохондриальных мембран для низкомолекулярных веществ и являющимся основным путем для вывода метаболитов из митохондрий (Manella et al., 1998; Manella et al., 1983; Shimizu et al., 2000), является канал VDAC (voltage dependent anion channel) (Colombini et al., 1987). Каналы, образованные VDAC, имеют довольно большой (от 2 до 4 нм) внутренний диаметр(Colombini, 1980) и высокую анион-катионную селективность (Shein et al., 1976). VDAC обнаружен во всех митохондриальных мембранах (Forte et al., 1996). Изучение работы митохондриальных каналов может помочь в дальнейшем в понимании процессов, происходящих в эндоплазма тическом ретикулуме и хлоропластах.
Нанометровые поры ПЭТФ мембран как модели биологических ионных каналов
Трековые мембраны из полиэтилентерефталата - структуры с правильной геометрией пор, узким разбросом их диаметра, известным количеством пор на единицу площади поверхности мембран - также являются удобной моделью для исследования механизма транспорта частиц как в узких, так и в относительно широких каналах (Апель и др., 1985) .
Толщина трековой ПЭТФ мембраны составляет порядка 10-12 мкм. Возможно изготовление многопоровых мембран с заданным диаметром и количеством пор на см2 (например, ко-личество пор 10 на см и диаметр пор 15 нм).
Процедура получения нанометровых пор ПЭТФ мембраны состоит из двух стадий: изготовления трека и последующего его травления. При прохождении тяжелой заряженной частицы в циклотроне через полиэтилентерефталатные пленки происходит возмущение структуры полимерного материала - образование трека. В результате щелочной обработки .(травления) трековых мембран возможно образование пор разной геометрической формы в зависимости от условий травления (симметричное или ассиметричное), а также при разном выборе температурных условий (Apel et al., 2001).
Процесс травления трека тяжелой заряженной частицы в полимере включает в себя стадию быстрого растворения де.структированного материала в сердцевине трека и стадию более медленного растворения неповрежденного материала вне области трека. Эти стадии характеризуются скоростями VT и VB соответственно. В результате травления формируются поры, конусность которых определяется соотношением величин VT и VB. Согласно общепринятой модели травления трека в изотропном материале диаметр поры в самом узком участке (именно им определяются селективные свойства фильтра) определяется выражением: Где D0 - диаметр избирательно травимой области вокруг траектории частицы, L - толщина исходной пленки, Т - время травления трека.
Величины D0, VB/ VT могут в той или иной степени меняться от трека к треку в результате влияния многих случайных факторов - различия в степени кристалличности полимера, наличия микропримесей, флуктуации потерь энергии и т.д. (Апель и др., 1985).
Для получения одинако малых пор необходимо добиться высокой избирательности травления. Это возможно при облучении полимерной пленки ионами с большим зарядом ядра с последующей сенсибилизацией треков УФ-облучением и при соответствующих условиях травления.
К настоящему моменту времени физико-химические характеристики трековых нанопор достаточно хорошо изучены. Заряд поверхности пор таких мембран является важной характеристикой и электроповерхностные свойства в большой степени определяют селективные свойства пор трековых мембран (Березкин и др.,2003; Саббатовский, 2003; Apel et al., 2002) . В нейтральной области рН поры ПЭТФ мембраны имеют отрицательный заряд поверхности, обусловленный диссоциацией карбоксильных групп полимера, образовавшихся при радиационной деструкции и последующей щелочной обработке. Ионы Н+ и ОН" являются для полиэтилентерефталатных нанопо-ровых мембран потенциалопределяющими. Положительный заряд поверхности пор в кислой области рН обусловлен специфической адсорбцией ионов Н+, а рост отрицательного заряда при подщелачивании раствора - увеличением степени диссоциации карбоксильных групп (Ермакова и др., 1998). Мембрана меняет знак заряда при рН = 3,8 - в зоне изоэлек-трической точки (Сидорова и др., 1990). Селективность на-нофильтра зависит от поверхностного заряда мембраны, знака, величины заряда иона и его подвижности в растворе. Кроме того, селективность меняется пропорционально поверхностному заряду нанопор, а также заряду и подвижности противоиона. При действии на отрицательнозаряженную поверхность нанопор катионов металлов (Березкин и др., 2003) происходит перезарядка поверхности пор и, соответственно, изменение ионной селективности мембраны.
Селективные свойства поры определяются диаметром поры в самом узком участке фильтра(Apell et al.,2001). Кроме гидрофильных взаимодействий с заряженными участками ПЭТФ-мембраны возможны и гидрофобные с участками незаряженного полимерного материала на стенках нанометровых пор (Сидорова и др., 1990). Специфические свойства нанофильтров обусловлены наличием гель-слоя, образующегося при набухании полимера в водных растворах. При модификации ПЭТФ мембран возможно увеличение селективности за счет не только образование дополнительных полярных групп, но и разрыхления слоя полимера, соответственно образованию гель-слоя с высоким объемным зарядом, поле которого повышает ионную селективность модифицированной мембраны (Сергеев и др., 2003) .
Благодаря совершенствованию методов облучения ПЭТФ пленок были получены мембраны с одиночными треками. При варьировании процедур травления появились одиночные поры цилиндрической и конической формы. Исследования электрохимических характеристик однопоровых мембран выявили ряд сходных с биологическими ионными каналами свойств и позволили использовать данные мембраны как модели пор ионных каналов клеточных мембран. Среди данных особенностей - высокая катион-анионная селективность; флуктуации между высоко и низкопроводящими уровнями; блокирование проводимости протонами и дивалентными катионами. Дискретные токи одиночных пор ПЭТФ-мембран и селективность подобных мембран обусловлены флуктуациями поверхностного заряда трековых нанопор (Korchev et al.,1997).
Исследования электрохимических характеристик на-нометровых пор ПЭТФ мембран
Исследование проводимости модельных искусственных систем - трековых мембран из полиэтилентерафталата (Lev A.A. et al., 1993) позволяют в качестве одного из вариан-тов блокирования проводимости предложить механизм работы ионного канала, отличный от использования гипотез, предложенных для объяснения проводимости на каналах биологических мембран (воротные структуры, потенциальный барьер) и каналах искуственных бислойных мембран. Кроме того, особый интерес представляет выяснение природы высокой ка-тионной или анионной избирательности трековых нанопор.
Для объяснения механизма проводимости, существующего в нанометровых порах ПЭТФ мембран, необходимо дать некоторые теоретические пояснения о существовании так называемого двойного электрического слоя и скачка потенциалов на границе раздела фаз, играющих важную роль в процессах адсорбции ионов и ионного обмена.
Первую количественную теорию двойного электрического слоя разработал Гельмгольц в 187 9 году (Духин, Дерягин, 1976). При рассмотрении электрокинетических явлений были введены значительные упрощения, согласно которым двойной электрический слой (ДЭС) представляет собой плоскопараллельный конденсатор, внутренняя обкладка которого представлена зарядами твердого тела, внешняя - зарядами, локализованными в жидкости. В дальнейшем механизм формирования ДЭС был развит независимо Гуи и Чепменом, которые учли важность теплового движения и успешно применили аппарат статистической физики. Согласно их представлениям пространственное распределение противоионов определяется тем, что они находятся в состоянии теплового движения и одновременно притягиваются к поверхностному заряду, в результате чего они образуют диффузную атмосферу определенной протяженности, толщина которой при низких концентрациях электролита может быть весьма значительной. Напряженность электрического поля в двойном слое должна монотонно убывать при удалении от заряженной поверхности, поскольку ее заряд экранируется зарядом противоионов, размещенных в слое между данной точкой и поверхностью, причем эта экранировка тем сильнее, чем больше расстояние от выделенной точки до поверхности. У внешней границы двойного слоя электрическое поле должно обращаться в нуль, иначе был бы непрерывный приток ионов из объема в двойной слой (или в обратном направлении), т.е. отсутствовало бы равновесие между двойным слоем и объемом. Исчезновение электрического поля у внешней границы двойного слоя достигается в результате электронейтральности двойного слоя, т.к. при этом внешняя диффузная обкладка двойного слоя полностью экранирует поверхностный заряд, его поле не проникает в объем электролита. То есть электронейтральность двойного слоя является необходимым условием равновесия между ним и объемом электролита. Поскольку напряженность электрического поля, определяющая притяжение противоионов к поверхности, спадает с удалением от нее, для концентрации противоионов также имеет место аналогичный спад от максимального значения у поверхности, причем у внешней границы избыток концентрации противоионов по сравнению с объемом уже не должен иметь места. Ионы, одноименно заряженные с поверхностью, именуемые коионами или побочными ионами, отталкиваются от поверхности, так что их концентрация в пределах двойного слоя ниже, чем в объеме. Поскольку сила, с которой коионы отталкиваются от поверхности, убывает с удалением от нее, концентрация коионов растет с удалением от поверхности. Кроме того, необходимо отметить, что в узких пространствах при достаточно большой плотности фиксированных зарядов и малых размерах поперечного сечения возможно перекрывание зоны двойных слоев. Закономерности качественного распределения ионов двойного слоя представлены на рис.1.7, а количественные закономерности пространственного распределения потенциала и концентраций ионов могут быть установлены исходя из условий равновесия внутри двойного слоя и законов электростатики. Условием равновесия внутри двойного слоя является отсутствие в нем потоков ионов. Это возможно, несмотря на огромные значения .напряженности электрического поля за счет компенсации электромиграционных потоков диффузными. Благодаря количественному описанию двойного слоя стало возможным охарактеризовать его толщину величиной так называемого дебаев-ского радиуса экранирования (для одно-одно валентного электролита). Для водных растворов одно-одновалентных солей:
В 1924 году теория двойного слоя была дополнена Штерном, который фактически разделил двойной слой на две части: слой ионов, прилегающие к заряженной стенке и слой противоионов в диффузном слое (Фридрихсберг, 1984).
Смолуховский (1903) указывал на то, что избыток ионов вблизи заряженной поверхности, формирующей наружную обкладку двойного слоя, вносит определенный вклад в электропроводность, который был назван поверхностной проводимостью. В случае сильнозаряженных поверхностей локальные значения концентрации противоионов в диффузной части двойного слоя на несколько порядков превышают концентрацию ионов за пределами двойного слоя и поверхностная проводимость может превышать объемную, даже если толщина двойного слоя меньше радиуса капилляра (Духин, Дерягин, 1976).
Исследование действия шестизарядного комплексного катиона рутениевого красного
Соответственно проводимость таких пространств должна быть практически связана с проводимостью прилегающего к стенке поры слоя ионов, т.е. с поверхностной проводимостью. Величина поверхностной проводимости определяется суммарной концентрацией противоионов, находящихся в двойном слое и величиной их подвижности. Оба эти фактора меняются в зависимости от расстояния от стенки поры, несущей фиксированные заряды. Конфигурация двойного электрического слоя (его толщина) зависит также от концентрации так называемого свободного электролита, если такой существует в пространстве поры. Плотность фиксированных зарядов на стенках поры и геометрические параметры поры определяют долю, приходящуюся на поверхностную проводимость поры (Духин, Дерягин, 197 6).
Проводимость такой зоны, определяющей катион-анионную селективность поры в целом, практически полностью зависит от поверхностной проводимости.
Для пор с большой площадью поперечного сечения следует ожидать на определенном расстоянии от стенки электролита того же состава, что и находящегося по обе стороны мембраны- (при равенстве концентраций электролита по обеим сторонам мембраны). При наличии ассиметричной системы оценка концентраций ионов внутри поры представляет собой определенные трудности, поэтому в таком случае применяется так называемое среднее логарифмическое значение для средней концентрации в свободном пространстве поры.
Моделирование блокирования проводимости нанометровых пор ПЭТФ мембран за счет блокирование проводимости протонами и дивалентными катионами обнаруживает сходство в поведении модельной систем - нанопор ПЭТФ мембран с каналами клеточных мембран - и может объясняться уничтожением поверхностной проводимости за счет нейтрализации фиксированных зарядов на стенках пор.
Соответственно действие более специфичных блокаторов катионных каналов клеточных мембран на трековые нанопоры позволит предположить существование одного из возможных механизмов блокирования катионселективных биологических ионных каналов.
О правомерности изложенного выше подхода свидетельствует экспериментально показанная высокая катионная избирательность для катионпроводящих ионных каналов клеточных мембран, т.е. "калиевых", "кальциевых", "натриевых" каналов . Нейтрализация фиксированных зарядов в вышерассмотренной зоне (например, при понижении рН наполняющего пору раствора) должна приводить к понижению или полному исключению поверхностной проводимости. Если доля поверхностной проводимости в рассматриваемой зоне была велика, то дискретные изменения проводимости канала (токи одиночных ионных каналов) можно связать с включением и выключением механизма поверхностной проводимости.
Из сказанного выше следует, что характерные для высокоизбирательных катионных каналов клеточных мембран дискретные изменения проводимости во времени можно связать с соответствующими изменениями поверхностной проводимости такого рода ионных каналов и представить как один из возможных механизмов работы ионных каналов. Эксперименты проводились на одно и многопоровых мембранах из полиэтилентерефталата толщиной 10-12 мкм.
Образцы трековых ПЭТФ мембран были получены из лаборатории ядерных реакций им. Г.Н. Флерова ОИЯИ (Объединенный институт ядерных исследований), Дубна. Фильтры с одиночными треками - из института GSI (Общество исследования тяжелых ионов), Дармтдштадт, Германия.
Процедура изготовления образцов состояла в облучении ПЭТФ пленок тяжелыми ионами, например, золото, ксенон, криптон, с энергией порядка 250 МэВ/кул в циклотроне или линейном ускорителе. Одиночный трек формировался при облучении мембраны таким образом, что поток тяжелых ионов отклонялся при обнаружении детектором прохождения одной частицы, в случае же получения множественных треков отклоняющая система отсутствовала.
Для получения одно и многопоровых фильтров использовалась разная процедура травления. В случае получения многопоровых мембран травление проводилось раствором 0.1 NaOH в симметричных электролитных условиях при температуре 80 С. Обработанные таким образом образцы пленки имели количество пор 106 на см2 и диаметр пор 15 нм. Конусность пор была слабо выражена (Апель и др., 1985).
Для получения одиночной поры конической формы использовалась процедура травления, при которой с одной стороны мембраны находился 10 М раствор NaOH, тогда как с другой 10 М раствор уксусной кислоты. Травление проводилось при температуре 21-22 С, и прекращалось при появлении первых признаков электропроводности мембраны. Происходящая в данном случае нейтрализация щелочи кислотой приводила к остановке травления и образования на узкой части конической поры крайне малого отверстия. Приблизительное время травления при температуре + 23 С составляло 2 часа. Затем мембрана многократно промывалась в биди-стилляте и заливалась 0.1 М раствором КС1.
