Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Литературный обзор 8
1.1. Характеристика объекта исследования 8
1.1.1. Молекулярная структура фитотоксинов 8
1.1.2. Биологическая активность фитотоксинов 10
1.1.3. Канал оформерная активность сирингомицина Е в искусственных и эритроцитарных мембранах 11
1.1.4. Действие сирингопептинов на проводимость модельных липидных мембран.. 14
1.2. Мембранная активность амфифильных циклических пептидов 15
1.2.1. Влияние полимиксина на проницаемость модельных и клеточных мембран 15
1.2.2. Мембранная активность токсинов цианобактерий 17
1.3. Липид-содержащие поры в клеточных мембранах 21
1.3.1. Поры слияния клеточных мембран при экзоцитозе 22
1.3.2. Липид-содержащие поры и апоптоз 24
1.4. Потенциал-управляемый воротный механизм ионных каналов 29
1.4.1. Потенциал-управляемые каналы эукариот 31
1.4.2. Потенциал-управляемые каналы простейших 33
1.5.2. Соединения, формирующие потенциал-управляемые ионные каналы вБЛМ...: 35
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 38
2.1. Материалы исследования 38
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Формирование бислойных липидных мембран и измерение их электрических характеристик 39
2.2.2. Измерение проницаемости эритроцитарных мембран 41
2.2.3. Действие фитотоксинов на дрожжевые клетки 42
ГЛАВА З Результаты и обсуждение 44
3.1. Характеристики проводимости фитотоксиновых каналов 44
3.1.1. Многоуровневая проводимость каналов 44
3.1.2. Влияние липидного состава мембран и концентрации электролита на проводимость фитотоксиновых каналов 47
3.1.3. Олигомерная структура каналов 52
3.2. Воротные характеристики каналов 54
3.2.1. Влияние поверхностного заряда БЛМ на воротные свойства каналов 54
3.2.2. Влияние поверхностного заряда БЛМ и концентрации электролита на воротные характеристики СМЕ каналов 59
3.2.3. СМЕ-канал: липидная пора, стабилизируемая липодепсипептидом 66
3.2.4. Влияние дипольных модификаторов на воротные характеристики СМЕ-каналов 73
3.2.5. Влияние спонтанной кривизны липидного монослоя на каналоформерную активность СМЕ 81
3.3. Активность фитотоксинов в БЛМ и клеточных мембранах 84
3.3.1. Каналоформерная активность фитотоксинов в БЛМ 84
3.3.2. Действие СП22А и СТБ на проницаемость эритроцитарных мембран 86
3.3.3. Активность фитотоксинов в клеточных мембранах 90
3.4. Влияние актина на каналоформерную активность сирингомицина Е 92
Выводы 103
Список литературы
- Молекулярная структура фитотоксинов
- Влияние полимиксина на проницаемость модельных и клеточных мембран
- Формирование бислойных липидных мембран и измерение их электрических характеристик
- Влияние липидного состава мембран и концентрации электролита на проводимость фитотоксиновых каналов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Способность молекул экзогенных соединений формировать ионопроводящие поры в липидном бислое клеточных мембран может приводить к нарушениям водного и электролитного баланса клеток и, таким образом, быть причиной их токсического действия. Многие из этих соединений (каналоформеров) являются антибиотиками и могут быть использованы в фармакологической практике; именно для этого необходимы исследования молекулярных механизмов их биологической активности. С другой стороны, свойства пор, образуемых каналоформерами, часто аналогичны свойствам нативных ионных каналов, что позволяет с помощью этих соединений моделировать, а, следовательно, и понять принципы функционирования каналов в клеточных мембранах. Поскольку липидный бислой является составной частью любой клеточной мембраны, взаимодействие каналоформеров с бислойными липидными мембранами (БЛМ) в значительной мере отражает характер их биологической активности. Применение БЛМ также позволяет непосредственно контролировать липидный состав бислоев, а также гораздо шире, чем в случае клеточных мембран, варьировать ионный состав и рН околомембранных водных растворов.
В данной работе была изучена мембранная активность группы фитотоксинов, продуцируемых бактериями Pseudomonas syringae pv. syringae - сирингопептина 22A (СП22А), сирингомицина Е (СМЕ), метилированного СМЕ (метил-СМЕ), сирингостатина А (ССА) и сиринготоксина Б (СТБ) в модельных и клеточных мембранах. Указанные соединения привлекают внимание, прежде всего тем, что обладают высокой степенью токсичности для растительных, грибковых и дрожжевых клеток, будучи значительно менее патогенными для клеток млекопитающих (Takemoto et al., 1992; Sorensen et al, 1996; Iacobellis et al, 1996; Lavermicocca et al., 1997; Dalla Serra et al., 1999). Установлено, что основной мишенью фитотоксинов является плазматическая мембрана (Zhang, Takemoto, 1987; Reidl et al. 1989; Hutchison
5 et al. 1995), тем не менее, молекулярные механизмы их биологической
активности окончательно не установлены.
Первые исследования показали, что сирингомицин Е (СМЕ) обладает
каналоформерной активностью в модельных липидных мембранах (Hutchison
et al., 1995; Feigin et al., 1996). СМЕ-каналы характеризуются выраженной
потенциал-чувствительностью открывания и закрывания, преимущественно
анионной селективностью, а также зависимостью проводимости от
липидного состава БЛМ и трансмембранной разности потенциалов (Feigin et
al., 1996.; Schagina et al., 1998; Каулин, Щагина, 1999). Благодаря этим
свойствам СМЕ-каналы и каналы, образуемые родственными ему
соединениями, могут выступать в качестве удобной модели для изучения
механизмов функционирования подобных каналов клеточных мембран.
Установлено, что характеристики СМЕ-каналов в значительной мере
определяются поверхностным зарядом модельных липидных мембран
(Каулин, Щагина, 1999; Малев и др., 2001). Это обстоятельство позволяет
использовать фитотоксиновые каналы и как объект изучения пептид-
липидных взаимодействий, лежащих в основе образования трансмембранных
пор при экзоцитозе и апоптозе.
Цели и задачи исследования
Цель данной работы - установление природы активности СМЕ и его аналогов - метил-СМЕ, ССА, СТБ и СП22А в клеточных мембранах и построение адекватной модели формирования и функционирования каналов, образуемых этими фитотоксинами. Для достижения поставленной цели решали следующие экспериментальные задачи:
1) провести сравнительный анализ характеристик ионных каналов,
образуемых СМЕ, метил-СМЕ, ССА, СТБ и СП22А в заряженных и
незаряженных БЛМ, омываемых растворами различного ионного
состава;
2) выяснить влияние дипольных модификаторов мембран на воротные
свойства фитотоксиновых каналов;
установить относительную каналоформерную активность токсинов СП22А, СМЕ, метил-СМЕ, ССА и СТБ в модельных липидных бислоях и эритроцитарных мембранах;
изучить действие глобулярного (G) актина на каналообразующую активность СМЕ.
Научная новизна исследований
Установлено, что фитотоксины СП22А, СМЕ, ССА, СТБ и метил-СМЕ в модельных липидных мембранах формируют ионные каналы, характеризующиеся сходными параметрами - величиной проводимости, кластерной организацией проводящих уровней, а также зависимостью открывания и закрывания от приложенной к БЛМ разности потенциалов. Впервые показано, что мембранообразующие липиды не только влияют на условия транспорта ионов в фитотоксиновых каналах, но и непосредственно входят в состав их потенциал-управляемого воротного механизма. Предложена модель фитотоксиновых каналов, в которой липидные молекулы являются составной частью структуры каналов.
Впервые показана возможность регуляции каналоформерной активности сирингомицина Е актином - основным белком цитоскелета.
Данные, полученные в ходе работы, являются свидетельством того, что биологическое действие СП22А, СМЕ, ССА, СТБ и метил-СМЕ определяется их каналоформерной активностью в плазматических мембранах клеток-мишеней.
Теоретическое и практическое значение работы
Полученные данные о механизмах формирования и функционирования фитотоксиновых каналов в модельных мембранах развивают представления о роли липидных молекул в регуляции активности ионных каналов и липидных пор в клеточных мембранах. Несомненную ценность представляют сведения об участии- липидных молекул в структуре воротного механизма ионных каналов, образуемого продуцентами P. syringae. Получены данные о том, что модификаторы дипольного потенциала мембран - флоретин, RH-421 и 6-кетохолестанол, могут быть применены для тестирования вклада зарядовых и
7 дипольных компонентов в воротный механизм ионных каналов. Данные,
полученные в ходе исследования влияния актина на каналоформерную
активность СМЕ в БЛМ, указывают на существование актин-липидных
взаимодействий, которые могут иметь гидрофобную и электростатическую
природу. Эти данные дают возможность предполагать участие цитоскелета в
регуляции активности ионных каналов, образуемых фитотоксинами, и
планировать дальнейшую экспериментальную работу в данной области.
Молекулярная структура фитотоксинов
Фитопатогенные штаммы бактерий Pseudomonas syringae pv. syringae продуцируют две группы токсинов, сходных по своему строению -сирингопептины и липодепсинанопептиды (Bender et al., 1999). Представители обеих групп являются циклическими липодепсипептидами - в их состав входит положительно заряженная пептидная "голова" и гидрофобный "хвост". Такая структура определяет высокую поверхностную активность этих соединений, что подтверждается низкими значениями их критической концентрации мицеллообразования - 0.7-1.25 мг/мл (Hutchison et al., 1995; Hutchison, Gross, 1997; Dalla Serra et al., 1999a). Структурные формулы фитотоксинов (в цвиттерионном виде) приведены на рис. 1.
В состав сирингопептина 22 А (СП22А), входит пептидная цепь, образованная 22-мя аминокислотными остатками (рис. 1, А). На амино-концевом участке цепи находится остаток 2,3-дигидро-2-аминобутановой кислоты (Dhb), ацилированый 3-гидроксидекановой кислотой. Линейная часть цепи сирингопептина содержит только гидрофобные аминокислотные остатки. Сложноэфирная связь между карбокси-концевым остатком тирозина и треонином замыкает первые восемь остатков молекулы СП22А в макролактонный цикл (Ballio et al., 1991). В циклической части молекулы СП22А локализованы два остатка 2,4-диаминобутановой кислоты (Dab), определяющие суммарный положительный заряд молекулы. Сирингопептин 25, практически полный аналог СП22, образован соответствующим числом (25) аминокислотных остатков в составе пептидной цепи. А и В формы сирингопептинов различают по длине углеводородного "хвоста" (Ballio et al., 1992).
Пептидная часть молекул сирингомицинов, второй группы токсинов-продуцентов P. syringae, содержит девять аминокислотных остатков, также замкнутых в макролактонный цикл. Типичным представителем этой группы соединений является липодепсинанопептид сирингомицин Е (СМЕ) (рис. 1, Б). Сложноэфирная связь в молекуле СМЕ образована между N- и С-концевыми остатками пептидной цепи, серином и 4-хлортреонином; помимо A А - сирингопептин 22А (СП22А); Б - сирингомицин Е (СМЕ); В -сирингостатин А (ССА); Г - сиринготоксин Б (СТБ); Д -сирингомицин Е, метилированный по остатку 3-ОН гидроксиаспарагиновой кислоты (метил-СМЕ). Сокращения: Dab - диаминобутановая кислота, Dhb -дигидроаминобутановая кислота, Hse - гомосерин. этого, N-концевой остаток серина ацилирован жирной кислотой (Segre et al., 1989; Fukuchi et al., 1992). Как видно из рисунка, молекула СМЕ содержит три положительно заряженных и один отрицательно заряженный аминокислотный остаток, что определяет суммарный заряд молекулы равный 2 положительным эл. зарядам при значениях рН, близких к нейтральным.
Интегральный заряд СМЕ, метилированного по остатку 3 гидроксиаспарагиновой кислоты (метил-СМЕ, рис. 1, Д) составляет 3 положительных заряда. Другие токсины данной группы - сирингостатин А (ССА, рис. 1, В) и сиринготоксин Б (СТБ, рис. 1, Г) сходны с сирингомицином Е по молекулярному строению, различаясь аминокислотным составом пептидной цепи (на участке между вторым и шестым остатками), зарядом и длиной жирнокислотного "хвоста". (Ballio et al., 1990; Isogai et al., 1990; Fukuchi et al., 1990; Fukuchi et al., 1992). Строение пептидной цепи и аминокислотный состав фитотоксинов весьма необычны для соединений белковой природы. Эти особенности вызваны тем, что синтез указанных соединений осуществляется специализированными ферментативными комплексами и не зависит от рибосомального аппарата клетки (Morgan et al., 1987; Grgurina, Mariotti, 1997; Guenzi et al., 2000).
Токсины-продуценты P. syringae pv. syringae вызывают некрозы в различных растительных тканях (Sinden et al., 1971; Gross, DeVay, 1977, Iacobellis et al., 1993) и подавляют рост дрожжевых и грибковых клеток (Takemoto, 1992; Iacobellis et al., 1993; Lavermicocca et al., 1997). Кроме того, недавно обнаружена активность сирингомицина Е и родственных ему соединений по отношению к патогенным для человека микобактериям Mycobacterium smegmatis (Buber et al., 2002). To обстоятельство, что фитотоксины значительно менее активны в отношении клеток млекопитающих, позволяет рассматривать их в качестве перспективных фармакологических препаратов (Sorensen et al., 1996; Lavermicocca et al., 1997; Buber et al., 2002).
Установлено, что основной причиной гибели клеток под действием фитотоксинов являются нарушения физиологических процессов, протекающих в клеточных мембранах (Bender et al., 1999). Сообщается о существенном увеличении скорости транспорта через мембраны ионов К+, Н+, Са2+, изменении активности различных мембранных ферментов, в частности протонной АТР-азы и кальциевых насосов (Zhang, Takemoto, 1986; Bidwai et al., 1987; Hutchison et al., 1995; Che et al 1992; Camoni et al., 1995). Установлено также, что токсическая активность сирингомицина определяется стериновым и сфинголипидным составом мембран клеток-мишеней (Takemoto et al., 1992; Grilley et al., 1998). При этом молекулярные механизмы активности фитотоксинов-продуцентов P. syringae pv. syringae на настоящее время остаются неясными. Одна из точек зрения состоит в том, что эти соединения способны нарушать целостность липидного бислоя плазматических мембран клеток-мишеней, вызывая утечку ионов из цитоплазмы и коллоидно-осмотический лизис.
Влияние полимиксина на проницаемость модельных и клеточных мембран
Полимиксины (ПМ) - семейство поликатионных циклических пептидов, продуцируемых штаммами Bacillus polymixa. Характерной чертой этих соединений является семичленный пептидный цикл с присоединенной к нему боковой цепью, состоящей из трех аминокислотных остатков и одной жирной кислоты. Положительный заряд молекулы полимиксина определяется наличием пяти или шести катионных остатков Dab в составе ее пептидной части (Suzuki et al., 1963).
В фармакологической практике широко используется антибиотическая активность полимиксинов по отношению к ряду грам-отрицательных бактерий. В больших дозах полимиксины оказывают нефротоксическое действие, что ограничивает их фармакологическое применение. Основной мишенью полимиксинов в поражаемых клетках являются плазматические мембраны (Mestres et al., 1998). Поэтому для изучения молекулярных механизмов активности полимиксинов был использован метод БЛМ. К настоящему времени лучше всего исследована мембранная активность полимиксина Б (ПМБ) - наиболее типичного продуцента штаммов В. polymixa.
Показано, что осуществление мембранной активности ПМБ зависит от липидного состава и поверхностного заряда модельных мембран. Добавление ПМБ в концентрации 1 мМ к мембранам, состоящим из незаряженных фосфолипидов (например, фосфатидилхолина), не вызывало изменений мембранной проводимости. Частичная замена незаряженного мембранообразующего липида отрицательно заряженной фосфатидной кислотой вызывала рост проводимости бислоев при введении ПМБ, начиная уже с 3 мкМ концентрации антибиотика (Antonov, Korepanova, 1976). В дальнейшем, с применением метода ядерно-магнитного резонанса было установлено, что ПМБ специфически взаимодействует с анионными липидами (фосфатидилглицеролом и фосфатидной кислотой), образуя стабильные комплексы в соотношении 1 молекула антибиотика на 5-6 липидных молекул. Необходимо отметить, что для ряда других фосфолипидов, в число которых входит и отрицательно заряженный фосфатидилсерин, комплексообразования в присутствие ПМБ обнаружено не было (Teuber, Bader, 1976).
Увеличения проводимости мембран в присутствии ПМБ можно было достигнуть и в случае использования незаряженных бислоев, при условии их модификации детергентами, создающими отрицательный поверхностный заряд (Антонов, 1981). Полученные данные позволили заключить, что электростатическое связывание катионных групп антибиотика с отрицательно заряженными группами на поверхности бислоя является ключевым этапом в реализации взаимодействия ПМБ с бислоем.
Установлено, что характер ПМБ-зависимой проводимости мембран зависит от наличия в их составе свободных жирных кислот. Так индуцируемая ПМБ проводимость мембран, содержащих фосфатидную кислоту, является следствием детергентного действия антибиотика, нарушающего упаковку мембранных липидов и образующего короткоживущие дефекты бислоях (Антонов, 1981). Регистрация ПМБ-зависимой проводимости в БЛМ, модифицированных свободными жирными кислотами (лауроиловой, маргариновой) обнаруживает флуктуации тока с четко выраженными уровнями проводимости, которые, по-видимому, отражают формирование устойчивых ионных каналов. ПМБ-каналы, регистрируемые в бислоях, содержащих лауроиловую кислоту, характеризуются слабой анионной селективностью, а также наличием нескольких проводящих состояний, которые могут отражать формирование каналов-кластеров. Добавление жирных кислот в мембранообразующий липидный раствор также повышало чувствительность модельных мембран к антибиотику примерно на два порядка (Орлов и др., 1991). Влияние жирных кислот и заряженных фосфолипидов на активность полимиксина в модельных мембранах, может определять специфичность биологического действия этого антибиотика, т.к. указанные соединения являются типичными компонентами мембран грам-отрицательных бактерий - основных клеток-мишеней полимиксинов. Для проверки предположения о специфичности действия структурных компонентов бактериальных мембран на активность ПМБ, было изучено поведение антибиотика в БЛМ, модифицированных бактериальными липополисахаридами. Присутствие указанных соединений в БЛМ также многократно усиливает мембранную активность ПМБ. На основании полученных данных, было сделано предположение, что молекулы липополисахаридов выступают как центры специфической сорбции молекул антибиотика на мембране (Schroder et al., 1992; Wieseetal., 1998).
Мембранная активность токсинов цшнобактерий Другим примером низкомолекулярных пептидных соединений, обладающих способностью формировать ионные каналы в БЛМ, являются токсины цианобактерий - микроцистин и нодуларин, продуцируемые представителями рода Microcystis Lemm. и Nodularia Mert. Подобно фитотоксинам P. syringae и полимиксинам, они состоят из пептидного кольца, содержащего полярные аминокислотные остатки, и связанного с ним гидрофобного участка - бензольного кольца. В состав пептидной части микроцистина входит пять, а нодуларина - семь аминокислотных остатков. При нейтральных значениях рН молекулы токсинов являются отрицательно заряженными (Krishnamurthy et al, 1989; Sandstrom et al., 1990). Каналоформерная активность токсинов цианобактерий была охарактеризована в модельных мембранах, сформированных из незаряженного фосфолипида дифитаноилфосфатидилхолина (Petrov et al., 1991; Spassova et al., 1995). Как и в случае фитотоксинов P. syringae, для образования.ионных каналов было достаточно односторонней добавки к БЛМ микроцистина или нодуларина. Активность одиночных ионных каналов в бислоях регистрировалась в диапазоне концентраций токсинов от 5 до 20 нг/мл в околомембранном растворе, повышение концентрации свыше 200 нг/мл, как правило, вызывало разрушение БЛМ.
Каналы, образуемые токсинами цианобактерий, примерно в 10 раз более проницаемы для ионов калия, чем для хлорид-ионов, селективность для ионов щелочного ряда (Li+, Na+, К+) оказалась слабо выраженной. Анализ трансмембранных токов, протекающих через БЛМ под действием малых доз микроцистина и нодуларина, показал, что одиночные ионные каналы, образуемые этими соединениями, могут находится в различных проводящих состояниях - от 3 пСм до 1.8 нСм в случае микроцистина и от 150 пСм до 1.8 нСм - нодуларина (состав омывающего мембраны водного раствора - 0.15 М KaCl, рН 7.2). Всего авторами было зарегистрировано свыше тридцати уровней проводимости одиночных каналов (Petrov et al., 1991; Spassova et al., 1995).
Формирование бислойных липидных мембран и измерение их электрических характеристик
БЛМ формировали по методу Монтала и Мюллера (1972), путем сведения конденсированных липидных монослоев на отверстии в тефлоновой пленке, разделяющей два водных отсека экспериментальной камеры (цис и транс). Объем каждого отсека камеры составлял 1.6 мл, толщина пленки - 10 мкм, диаметр отверстия - 50-100 мкм. Отверстие в пленке делали раскаленной иглой. Для обеспечения адгезии монослоев, до формирования мембран отверстие обрабатывали скваленом либо гексадеканом. Для получения мембран использовали ДФФХ либо различные липидные смеси, содержащие ДОФС, ДОФЭ, ДОФХ и 6-кетохолестанол. Мембраны формировали из 0.1 % липидных растворов в пентане. О формировании БЛМ судили по скачкообразному увеличению емкости системы.
Дипольный потенециал БЛМ модифицировали при помощи флоретина, RH-421 и- 6-кетохолестанола. Флоретин и RH-421, предварительно растворенные в этаноле (10-50 мМ), вносили в электролитные растворы цис-и транс- отделений камеры до формирования мембран, 6-кетохолестанол добавляли непосредственно в мембранообразующие липидные растворы (10-50 % по молярной массе). Эксперименты проводили при симметричном ионном составе разделяемых мембраной водных растворов (0.01-2.5 MNaCl). Кислотность растворов (рН 2-6) поддерживали буферной смесью MOPS (5 мМ) / NaOH. Фитотоксины добавляли к водной фазе z/wc-отделения экспериментальной камеры.
Нативный глобулярный (G) или инактивированный актин вносили в отсеки экспериментальной камеры до конечной концентрации 4 мкг/мл из базового раствора в G-буфере (0.2 мМ АТФ, 0.1 мМ СаС12, 5 мМ Tris/HCl, рН 8.2) с концентрацией 4.5-7 мг/мл, после формирования БЛМ и модификации бислоев сирингомицином Е. Полимеры - поли-Ь-лизин (ПЛ), полй-L глутаминовую кислоту (ПГ) и полианион Кенига (ПК) вносили в цис- или транс-отделение камеры после модификации бислев СМЕ, до конечной концентрации полимеров 90 нМ, 67 нМ и 100 нМ соответственно.
Регистрацию токов через бислойные мембраны проводили согласно методике фиксации потенциала при помощи операционного усилителя, собранного в лаборатории на базе микросхемы КР544УД1А, с дискретным диапазоном сопротивлений обратной связи от 107 до 1010 Ом. Схема экспериментальной установки изображена на рис. 4. Для регистрации трансмембранных токов (7) и приложения разности потенциалов (V) к мембранам использовали хлорсеребряные электроды (Ag/AgCl), введенные в водные растворы обоих отделений камеры. Нулевым потенциалом считали потенциал i/wc-отделения камеры. Электрическую емкость системы контролировали по измерениям амплитуды тока, протекающего через БЛМ при наложении на нее синусоидальных импульсов напряжения, подаваемых от генератора сигналов ГЗ-120. Для уменьшения вибрационных помех и защиты от внешних электрических шумов экспериментальная установка располагалась на массивном кронштейне и была окружена заземленным экраном. Эксперименты проводили при комнатной температуре.
Сигнал с выхода усилителя оцифровывался при помощи платы АЦП (Adalab Inc.) и записывался на жесткий диск персонального компьютера (IBM PC, 486 DX-12-100). Измерения амплитуд токов, протекающих через одиночные каналы, а также интегральных трансмембранных токов осуществляли при помощи программного пакета pClamp6.0.2 (Axon Instruments, США). Анализ данных по проводимости мембран осуществляли с использованием программы Origin версий 5.0 и 7.1 (Microcal Software, США). Для каждого трансмембранного потенциала строили гистограмму распределения проводимостей одиночных каналов и проводили ее аппроксимацию функцией Гаусса. Из максимума гауссовой кривой находили величину средней проводимости одиночного канала с погрешностью, определяемой среднеквадратичным отклонением.
Кровь здоровых доноров инкубировали в присутствии изотопа 86Rb (аналога калия) в течение 1.5 ч при 37 С. После центрифугирования эритроциты отмывали 3 раза и затем ресуспензировали в буферном растворе следующего состава: 3.2 мМ КС1, 138 мМ NaCl, 1 мМ СаС12, 1 мМ MgCl2, 27 мМ сахарозы, 5 MM MOPS (рН 6.8).
СП22А или СТБ при тщательном перемешивании добавляли к суспензии эритроцитов в диапазоне концентраций (0.5 ч- 2)-106 молекул на клетку. Значения гематокритного числа в суспензии эритроцитов находились в диапазоне 0.3ч-0.4. Образцы суспензии отбирали в определенные промежутки времени и затем центрифугировали. После этого измеряли радиоактивность аликвот супернатанта. О транспорте 86Rb через эритроцитарные мембраны судили по увеличению радиоактивности супернатанта во времени. Это увеличение, пропорциональное количеству вышедшего из клеток изотопа, определяли как "выход 86Rb". Количество изотопа в супернатанте выражали в виде процентной доли от общей активности суспензии (Nt). Выход изотопа из клеток представляли в виде зависимости Nt от времени.
Кроме транспорта 86Rb измеряли выход гемоглобина из эритроцитов, обусловленный действием фитотоксинов. Для этого в аликвотах супернатанта измерялась концентрация гемоглобина. Его выход из клеток представляли в виде зависимости концентрации гемоглобина во внешнем растворе от времени.
Концентрацию эритроцитов, гемоглобина, число гематокрита в суспензии клеток, а также средний объем эритроцитов определяли при помощи автоматизированного гематологического анализатора (Cobas Micros ОТ 18, Roche, France).
Влияние липидного состава мембран и концентрации электролита на проводимость фитотоксиновых каналов
Как показано в нашей работе (Малев и др., 2001) причины нелинейности и асимметрии в(Р)-кривых исследуемых каналов в отрицательно заряженных мембранах можно объяснить, предположив, что в состав их проводящей структуры входят заряды различного знака -положительные заряды каналоформера (со стороны его введения в БЛМ) и отрицательные - мембранообразующих липидов. Проведенный расчет эффективных концентраций проникающих ионов показал, что в зоне отрицательных значений V кривая проводимости СМЕ-каналов должна быть близка к экспоненциальной, в то время как при V 0 - практически линейной. При увеличении концентрации электролита в окружающем отрицательно заряженные мембраны растворе до 1 М наблюдается пропорциональное повышение проводимости каналов и сохранение формы их Сг(Р)-кривых (рис. 8, А). В рамках предложенного подхода такое изменение проводимости каналов может быть объяснено влиянием экранирующего эффекта соли на величину поверхностного заряда мембраны и заряда стенок канала, имеющих различный знак. С ростом ионной силы раствора экранирование отрицательного поверхностного заряда мембраны приводит к увеличению концентрации анионов на входе в канал. В тоже время экранирование положительного заряда каналоформера приводит к снижению концентрации проникающих анионов.
Характер зависимости проводимости каналов от приложенного потенциала в незаряженных мембранах (рис. 7, Б и рис. 8, Б) позволяет предполагать наличие неких неучтенных компонентов в составе проводящей структуры исследуемых каналов. Вероятной причиной нелинейности и асимметрии С(Р)-кривых в незаряженных мембранах может быть влияние дипольных моментов липидных молекул, входящих в состав канала.
Одна из характеристик ионного канала, связанная с его размером, а, следовательно, и с проводимостью - число молекул каналоформера, участвующих в формировании канала (п). Для определения величины п были проведены измерения зависимости стационарной проводимости (числа открытых каналов при постоянном значении трансмембранной разности потенциалов) от концентрации токсина в водной фазе. Наклон двойной логарифмической кривой (проводимость - концентрация) дает величину п (Latorre, Alvares, 1981).
Величины п для ССА- и СП22А-каналов равны 4.15 ± 1,3 и 3.95 ± 0.2 соответственно (рис. 9). Значение п, полученное ранее для СМЕ-каналов в БЛМ, оказалось равным 6 (Feigin et al., 1996; Щагина и др., 1998; Малев и др., 2000). Величины п, равные 4-6 были также получены для СМЕ, СТБ и СП22А и СП25А из измерений выхода кальцеина из липосом различного липидного состава (Dalla Serra et al., 1999a). В отличие от СМЕ-, ССА- и СП22А-каналов обнаружено, что СТБ-каналы инактивируготся во времени при комнатной температуре как в модельных липидных бислоях, так и в мембранах эритроцитов человека (Szabo et al. 2002). Это обстоятельство не позволяет измерить зависимость проводимости модифицированных СТБ мембран от концентрации токсина в этих условиях. Измерения зависимости проницаемости изотопа Rb для модифицированных СТБ эритроцитарных мембран от температуры показали, что при 8 С СТБ-каналы не инактивируготся. Из зависимости коэффициента проницаемости для 86Rb от концентрации токсина при 8 С было получили n = 5.5±0.5 (Szabo et al., 2002). Таким образом, для токсинов, различающихся химической структурой молекул (длиной гидрофобных углеводородных "хвостов", аминокислотным составом гидрофильных "голов" и интегральным зарядом (см. рис. 1)) наблюдается нелинейная зависимость проводимости БЛМ и проницаемости эритроцитарных мембран от концентрации каналоформера. Эти результаты говорят об участии от 4 до 6 молекул каналоформеров в образовании СП22А, СМЕ, ССА или СТБ-каналов.
Вышеприведенные данные позволяют заключить, что исследуемые токсины формируют ионные каналы со сходной структурой, как в БЛМ, так и в эритроцитарных мембранах. Это подтверждается близостью их проводящих характеристик, кратностью проводимости больших и малых каналов и числом мономеров токсина, входящих в состав проводящей единицы. Различия в проводимости и кратности отдельных проводящих состояний каналов, образуемых ССА, СТБ, и СМЕ, метил-СМЕ, и СП22А могут быть обусловлены влиянием параметров пептидного кольца молекул каналоформеров, в частности, локализации в нем заряженных аминокислотных остатков. Влияние липидного состава мембран на проводимость каналов может быть следствием участия мембранообразующих молекул в образовании проводящей структуры исследуемых каналов.
