Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 2. Обзор литературы 10
2.1 Эмбриональные стволовые клетки мыши, происхождение, способы получения. Тератокарциномы 10
2.2 Транскрипционные факторы, маркеры мЭСК 12
2.2.1 Oct-4 12
2.2.2 Sox2 14
2.2.3 Foxd3 14
2.2.4 Nanog 14
2.2.5 Влияние Nanog и Oct-4 на транскрипцию, роль белков группы Polycomb 16
2.3 Сигнальные пути, участвующие в поддержании недифференцированного состояния
ЭСКмыши 19
2.3.1 LIF/STAT3 путь 19
2.3.2 BMP/SMAD сигнальный путь 21
2.3.3 MEK/ERK- зависимые пути 23
2.3.4 Р13-киназный путь 23
2.3.5 Путь через киназу cYes 25
2.4 Особенности регуляции клеточного цикла мЭСК 27
2.5 Вклад структуры хроматина в поддержании высокопролиферативного статуса мЭСК. 30
2.6 Структура Wnt-сигнального пути позвоночных. Роль (ї-катенина в адгезии клеток и регуляции транскрипции 33
2.7 Нарушение регуляции Wnt-сигнального пути при канцерогенезе. Роль Wnt-пути в регуляции функций стволовых клеток 36
2.8 Роль Writ-сигнального пути в дифференцировке клеток 38
2.9 Баланс клеточной адгезии и Writ сигналинга. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) 39
2.10 Транскрипционный фактор АР-1- участник ЭМП и дифференцировки клеток 45
2.10.1 Состав димеров АР-1 и консенсусные последовательности 45
2.10.2 Партнеры АР-1 по образованию комплексов с элементами ДНК. Изменение консенсусних последовательностей АР-1 фактора 46
2.10.3 Гены раннего ответа c-fos и c-jun и их регуляция на уровне транскрипции и посттрансляционных модификаций, структура регуляторных областей генов c-fos и с-jun , 49
2.10.4 Участие транскрипционного фактора АР-1 в дифференцировке клеток 51
2.11 Роль р-катенина в сохранении плюрипотентности и дифференцировке мЭСК 53
ГЛАВА 3. Материал и методика 58
3.1 Культивирование клеток 58
3.2МТТ-тест 59
3.3 Анализ активности каспаз в клеточных экстрактах 60
3.4 Однопараметрическии анализ распределения клеток методом проточной цитометрии. 60
3.4.1 Мечение CFSE для оценки интенсивности пролиферации 60
3.5 Анализ активации транскрипции репортерной плазмиды e2f-Iuc 61
3.6 Выявление активности SApGal в клетках 61
3.7 Изучение локализации белков методом иммунофлюоресценции 61
3.8 Выявление олигонуклеосомной фрагментации ДНК 62
3.9.Вестерн-блотинг 62
3.10. Анализ киназной активности in vitro 63
3.12 Анализ транскрипции генов методом RT-PCR . 64
ГЛАВА 4. Результаты 66
4.1 Влияние ингибиторов деацетилаз гистонов (HDAC) на пролиферацию и выживание мЭСК 66
4.1.1 Скорость прироста популяции и клоногенпая выживаемость мЭСК 66
4.1.2 Распределение мЭСК по фазам клеточного цикла 66
4.1.3 Индукция клеточной гибели после воздействия ингибиторов HDAC 67
4.1.4 Активация каспаз в мЭСК после воздействия ингибиторов HDAC 68
4.1.5 Замедление пролиферации мЭСК после воздействия TSA подтверждается с помощью мечения CFSE 69
4.1.6 Подавление Е2Р-зависимой транскрипции в мЭСК после обработки ингибиторами HDAC 69
4.1.7 Экспрессия генов, кодирующих регуляторы клеточный цикл после воздействия ингибиторов HDAC 70
4.1.8 Обработка мЭСК TSA не вызывает индукции ускоренного клеточного старения и транскрипции генар16'пШ 71
4.2. Внутриклеточная локализация р-катенина, Е- и N-кадгеринов и актина в недифференцированных мЭСК . 72
4.3 Признаки эпителиально-мезенхимального перехода, наблюдаемые при дифференцировке 73
4.3.1. Активность транскрипционного фактора АР-1 увеличивается в ходе дифференцировки клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9 73
4.3.2 Уровень транскрипции генов c-fos и c-jun увеличивается в ходе дифференцировки клеток F9 75
4.3.3 В недифференцированных клетках F9 транскрипция гена c-fos находится под негативной регуляцией деацетилаз гистонов 76
4.3.4 Дифференцировка мЭСК сопровождается экспрессией генов и проявлением морфологических признаков эпителиально-мезенхимального перехода 77
4.3.5 Воздействие TSA не вызывает признаков ЭМП в мЭСК 78
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 99
5.1 Влияние ингибиторов HDAC на клеточный цикл мЭСК 99
5.2 Влияние ингибиторов HDAC на жизнеспособность мЭСК 101
5.3. Признаки дифференцировки и ускоренного клеточного старения после воздействия ингибиторов HDAC 103
5.4. Признаки эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) при дифференцировке клеток эмбриональной карциномы и эмбриональных стволовых клеток мыши 105
5.4.1. Активность транскрипционного фактора АР-1 увеличивается при дифференцировке клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9... 105
5.4. Локализация р-катенина в быстроделящихся недифференцированных мЭСК 106
5.5. Необходимость Wnt-сигнального пути для реализации (ЭМП) в ранних эмбриональных клетках 108
ГЛАВА 6. Заключение 111
Выводы 113
Список работ, опубликованных по теме диссертации 114
Список цитированной литературы 116
- Влияние Nanog и Oct-4 на транскрипцию, роль белков группы Polycomb
- Баланс клеточной адгезии и Writ сигналинга. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП)
- Замедление пролиферации мЭСК после воздействия TSA подтверждается с помощью мечения CFSE
- Необходимость Wnt-сигнального пути для реализации (ЭМП) в ранних эмбриональных клетках
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В настоящее время, изучение механизмов пролиферации эмбриональных стволовых клеток представляет важное направление клеточной и молекулярной биологии. Эмбриональные стволовые клетки мыши (мЭСК) являются ценным объектом для изучения процессов раннего эмбрионального развития благодаря своей доступности и относительной простоте культивирования. Сохранение плюрипотентности в течение многих пассажей позволяет создавать химерные особи мышей и благодаря этому изучать функции генов in vivo. Способность к дифференцировке в различные типы клеток in vitro делает эмбриональные стволовые клетки перспективным объектом для разработки подходов направленной дифференцировки и их будущего использования в качестве материала для терапии поврежденных тканей (Brook, Gardner, 1997; Smith, 2001). Для создания и применения таких методов необходимо детально исследовать механизмы, обеспечивающие сохранение недифференцированного состояния эмбриональных стволовых клеток. Ряд морфологических и молекулярных признаков сближает недифференцированные мЭСК с трансформированными клетками. Можно отметить следующие признаки: высокий пролиферативный потенциал мЭСК и независимость пролиферации от экзогенных ростовых факторов (Schratt et al., 2001). Отличительной особенностью мЭСК является также их неспособность к длительной блокам G1/S или G2/M клеточного цикла при действии ДНК-повреждающих агентов и стресс-факторов, что говорит об отсутствии полноценных сверочных точек клеточного цикла (Малашичева и др., 2002). По-видимому, как в опухолевых клетках, так и в мЭСК постоянно функционируют эндогенные митогенные сигналы, которые стимулируют продвижение мЭСК по клеточному циклу.
Активность деацетилаз гистонов (HDAC) может быть связана как с поддержанием автономной пролиферации, так и трансформированного фенотипа, поскольку репрессия некоторых негативных регуляторов пролиферации и индукторов дифференцировки происходит с участием этих ферментов (Dokmanovic, Marks, 2005). Есть данные, позволяющие предполагать, что активность HDAC необходима для пролиферации ранних эмбриональных клеток. Изучение эмбрионов мышей, нокаутных по HDAC1, показало снижение числа клеток внутренней клеточной массы и раннюю летальность зародышей. Кроме того, мЭСК, полученные из таких эмбрионов, имеют более низкую скорость прироста популяции (Lagger et al., 2002). Есть данные, показывающие, что активность HDAC необходима для дифференцировки мЭСК (Lee et al., 2004). В настоящее время, ингибиторы HDAC рассматриваются как перспективные противоопухолевые агенты и активно используются в научных исследованиях. В зависимости от тканевой принадлежности и функционального состояния, различные клетки обладают разной чувствительностью к ингибиторам HDAC, реализуя как длительные блоки клеточного цикла с признаками дифференцировки и клеточного старения, так и кратковременные остановки с последующим запуском программы апоптоза. Изучение эффекта ингибиторов HDAC на мЭСК является актуальной и интересной задачей, поскольку это позволит получить информацию об особенностях системы регуляции клеточного цикла в этих клетках.
Механизмы автономной пролиферации мЭСК пока изучены недостаточно, в частности, нет четких данных о сигнальных путях, вовлеченных в этот процесс. Недавно было показано, что активация Wnt/p-катенинового пути способствует поддержанию плюрипотентного состояния мЭСК даже в отсутствии фактора LIF (Sato et al., 2004). Как
известно, Р-катенин выполняет в клетке разнообразные функции в разных компартментах: вместе с Е-кадгерином он участвует в образовании межклеточных контактов, в составе комплексов с транскрипционными факторами семейства LEF/TCF Р-катенин функционирует в качестве ко-активатора транскрипции генов в ядре, а в составе цитоплазматических комплексов с белками CKI, GSK3P, АРС и аксином Р-катенин фосфорилируется для последующей протеасомной деградации (Bienz, 2004). Поскольку Р-катенин-зависимая транскрипция, отмечается в быстроделящихся клетках-предшественниках тканей (Не et al., 2004; Reya et al., 2003) и в различных типах опухолевых клеток (Fukuchi et al., 1998; Sparks et al., 1998; Koch et al., 1999), а экспрессия Е-кадгерина может модулироваться на уровне структуры хроматина (Peinado et al., 2004), большое интерес представляет исследовать внутриклеточную локализацию Р-катенина в недифференцированных быстроделящихся мЭСК и при их дифференцировке. Учитывая, что сигнальная функция Р-катенина важна в ходе гаструляции при реализации эпителиально-мезенхимального перехода (Kemler et al., 2004), важно выяснить, как меняется экспрессия генов, характерных для эпителиальных и мезенхимных клеток при дифференцировке мЭСК.
Цели и задачи исследования.
Целями данного исследования являлось:
Изучение зависимых от структуры хроматина механизмов регуляции клеточного цикла и пролиферации мЭСК in vitro с использованием ингибиторов гистон-деацетилазной активности.
Исследование внутриклеточной локализации белков межклеточной адгезии и изменения активности Wnt-сигнального пути при действии ингибиторов HDAC и при дифференцировке мЭСК.
Для реализации этих целей были поставлены следующие задачи:
а) исследовать эффект ингибиторов HDAC на скорость прироста популяции и
параметры клеточного цикла недифференцированных мЭСК;
б) оценить уровень экспрессии генов, кодирующих позитивные и негативные
регуляторы клеточного цикла, после обработки мЭСК ингибиторами HDAC;
в) исследовать влияние ингибиторов HDAC на жизнеспособность мЭСК и индукцию
апоптотической гибели;
г) выяснить, приводит ли обработка ингибиторами HDAC к индукции
преждевременного клеточного старения или к дифференцировке клеток;
д) исследовать внутриклеточную локализацию Р-катенина в недифференцированных
мЭСК при обработке ингибиторами HDAC и при активации Wnt-сигнального пути
ингибитором киназы GSK3P 6-Bromoindirubin-3'-oxime (BIO);
е) исследовать экспрессию генов-маркеров эпителиально-мезенхимального перехода
при дифференцировке мЭСК, а также другие признаки этого процесса: особенности
организации актинового цитоскелета и внутриклеточную локализацию белков
межклеточных контактов Р-катенина, Е-кадгерина и N-кадгерина.
Основные положения, выносимые на защиту.
Ингибиторы HDAC подавляют пролиферацию эмбриональных стволовых клеток мыши, вызывают остановку в фазе G1/S или G2/M клеточного цикла и последующую апоптотическую гибель.
Эмбриональные стволовые клетки мыши не способны реализовать долговременные блоки клеточного цикла при действии ингибиторов HDAC, которые сопровождались бы признаками ускоренного старения или дифференцировки.
Для быстроделящихся эмбриональных стволовых клеток мыши не характерна ядерная локализация Р-катенина.
Дифференцировка мЭСК, индуцированная ретиноевой кислотой (RA), сопровождается активацией Wnt-сигнального пути и индукцией эпителиально-мезенхимального перехода.
Научная новизна работы.
Впервые показано, что ингибиторы деацетилаз гистонов (HDAC) оказывают негативное влияние на пролиферацию мЭСК, вызывают блок клеточного цикла и снижают транскрипцию позитивных регуляторов клеточного цикла, таких как циклин D1 и циклин А, фосфатаза cdc25A, с-тус, и e2fl и индуцируют транскрипцию негативных регуляторов клеточного цикла p21wq' и р57 ip . Показано, что остановка клеточного цикла мЭСК, вызванная ингибиторами HDAC, не сопровождается признаками ускоренного клеточного старения и дифференцировки, но приводит к массовой апоптотической гибели. Несмотря на сходство мЭСК с трансформированными клетками (опухолей), многие из которых демонстрируют дерегуляцию Wnt-сигнального пути, для быстроделящихся недифференцированных мЭСК не характерна внутриядерная локализация Р-катенина, который имеет в этих клетках исключительно мембранную локализацию Напротив, при дифференцировке мЭСК ретиноевой кислотой наблюдается релокализация Р-катенина в ядро, индукция экспрессии генов-маркеров эпителиально-мезенхимального перехода и замена Е-кадгерина на мембране на N-кадгерин.
Теоретическое и практическое значение работы
Результаты данной работы могут быть использованы для дальнейшего углубленного изучения механизмов регуляции клеточного цикла ранних эмбриональных клеток; дают важную информацию о сигнальных процессах, необходимых для самообновления мЭСК. Данные работы могут быть использованы при исследовании процессов, происходящих при дифференцировке мЭСК. Кроме этого, результаты работы служат иллюстративным практическим материалом в учебном спецкурсе по регуляции клеточного цикла и биологии опухолевых и стволовых клеток, читаемом на кафедре биохимии биолого-почвенного факультета СПбГУ.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 4 статьи. Основные положения доложены и обсуждены на Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2003, 2004), на международной студенческой конференции (Берлин, Германия, 2003), на 3-й международной конференции международного общества по изучению стволовых клеток (Сан-Франциско, США, 2005), на Всероссийской конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2005).
Финансовая поддержка работы
Работа была поддержана грантами РФФИ (06-04-49058), CRDF (RB1-2511-ST-03) и Программой РАН «Молекулярная и клеточная биология», Научная школа (Госконтракт:
02.445.11.7337), Договор НОЦ РИ-16.0/0010-3. Работа была выполнена с использованием оборудования ЦКП «Материаловедение и диагностика в передовых технологиях».
Объем и структура диссертации
Влияние Nanog и Oct-4 на транскрипцию, роль белков группы Polycomb
В ходе развития эмбриона Oct-4 предотвращает первую дифференцировку в клетки трофобласта, Nanog подавляет дифференцировку в направлении эндодермы, совместно эти факторы необходимы для сохранения плюрипотентности мЭСК (схема 1). После открытия Oct-4 и Nanog исследователи задались следующими вопросами. Какие гены регулируют Oct-4 и Nanog, есть ли гены, регулируемые Oct-4 и Nanog совместно, обуславливают ли эти факторы привлечение эпигенетических регуляторов, формирующих специфическую структуру хроматина ЭСК. Большой прогресс в поиске ответов на эти вопросы был сделан в работе Loh и сотрудников, в которой с применением метода иммунопреципитации хроматина и анализа фрагментов ДНК на микрочипах, были выявлены и картированы в геноме сайты связывания Nanog и Oct-4, проведено исследование экспрессии генов, содержащих сайты связывания. Выяснилось, что Nanog и Oct-4 регулируют гены как независимо, так и совместно. Среди совместно регулируемых генов есть rcor, esrrb, phc2. Ген dkkl кодирует антагонист Wnt-пути и регулируется негативно Oct-4 и Nanog в мЭСК, Факторы Oct-4 и Nanog негативно регулируют гены-маркеры трофэктодермы - ddx-2, cldn4. Среди генов-мишеней, позитивно регулируемых Nanog, наиболее примечательны oct-4, sox2, гІ/l и rest. Кроме генов, кодирующих белки, Oct-4 и Nanog также регулируют гены некоторых микро-РНК.
Используя алгоритм для обнаружения сайтов связывания, удалось выявить сайт связывания Oct-4 и Sox-2, а также новый мотив связывания для Nanog (САТТ), который перекрывается с сайтом АТТА, идентифицированным ранее биохимически. Чтобы подтвердить роль сайтов связывания Oct-4 и Nanog с регуляцией транскрипции конкретных генов авторы индуцировали мЭСК к дифференцировке тремя разными способами и исследовали транскрипцию 16 тыс. генов на микрочипах. Затем ранжировали экспрессию генов на индуцированные и репрессированные в ходе дифференцировки и проверили в них наличие сайтов связывания Oct-4 и Nanog. Обнаружилось, что именно среди подавляемых и индуцированных при дифференцировке генов находятся те, что содержат сайты связывания Oct-4 и Nanog, что подтверждает предположение о специфической активации или репрессии этих генов Oct-4 и Nanog (или обоими факторами совместно) в недифференцированных клетках. Поскольку известно, что Nanog способен предотвращать дифференцировку, вызванную ретиноевой кислотой, исследовали уровень транскрипции генов в клетках, обработанных ретиноевой кислотой (РК), контрольных и с повышенной транскрипцией Nanog. Транскрипция генов Pou5fl, Sox2, Esrrb, Rifl, FoxD3, Tcfcp2ll, Salll, REST, Jarid2, Тс/3 и ЫгОЫв меньшей степени снижается при воздействии РК в клетках с повышенной экспрессией Nanog, чем в контрольных клетках. Также установлены новые гены, важные для сохранения плюрипотентности ЭСК. При обработке мЭСК siRNA к мРНК генов esrrbl и rifl клетки теряют черты недифференцированного фенотипа, начиная дифференцироваться (Loh et al., 2006).
Система регуляции транскрипции генов в ЭСК должна быть весьма лабильна, и с одной стороны должна функционировать для сохранения статуса недифференцированных клеток при сохранении постоянных условий, а с другой стороны запускать экспрессию генов, регулирующих процессы развития при попадании в специальное микроокружение. Поэтому в ЭСК весьма вероятно ожидать наличие обратимых механизмов репрессии генов.
Белки группы Polycomb (PcG) играют роль в самообновлении эмбриональных клеток в ходе развитии многоклеточных, однако у млекопитающих количество известных мишеней транскрипционных факторов PcG невелико. PcG функционируют в 2-х репрессорных комплексах Polycomb repressor complex (PRC), PRC1 и PRC2, коровые компоненты которых консервативны от дрозофилы до человека (Ringrose, Раго, 2004). Чтобы выяснить их роль в мЭСК, Воуег и сотрудники идентифицировали гены, оккупированные PcG, проведя анализ мест связывания в геноме с использованием антител против коровых компонентов PRC1, белков Phcl и Rnf2, и PRC2, белков Suzl2 и Eed. ДНК, связанную с PcG, и тотальную ДНК гибридизовали на микрочипах. Авторы обнаружили, что около 90 % сайтов связывания обнаруживаются в пределах 1 kb от старта транскрипции генов. Учитывая, что компоненты PRC1 и PRC2 взаимодействуют с перекрывающимся набором генов, в мЭСК идентифицировано 512 генов, причем для этих генов обнаружен повышенный уровень метилирования гистона НЗ по лизину 27 (что обычно коррелирует с репрессией транскрипции). Оказалось, что в списке генов, регулируемых PcG, много регуляторов транскрипции и морфогенеза, паттерн-спецификации, нейрогенеза, дифференцировки клеток. В дополнении к Нох-генам, являющимися классическими мишенями PcG белков, PcG связывают около 100 генов, кодирующих белки, содержащие гомеодомен, включая члены семейств Dlx, Irx, Lhx, Рои, Pax, Six. PcG также взаимодействуют с генами семейств Fox, Sox, Gata, Tbx. Чтобы установить прямую функциональную связь между взаимодействием PcG и репрессией генов-мишеней, авторы оценили уровень транскрипции генов-мишеней PcG в мЭСК дикого типа и мЭСК, нокаутных по Eed, поскольку делеция этого гена приводит к отсутствию активности PRC2 и нарушению метилирования (Montgomery et al., 2005). Показано, что в клетках Eed-/- повышен уровень транскрипции генов семейств Нох, Fox, Lhx, Pax, Sox и Fgf. В ходе дифференцировки наблюдается увеличение транскрипции большого числа (около 93 %) генов, регулируемых PcG, что подтверждает важность PcG белков для сохранения недифференцированного состояния. У дрозофилы PcG привлекаются к промоторам с помощью сиквенс-специфических факторов транскрипции (Ringrose, Раго, 2004). В настоящее время нет данных о том, каким образом PcG привлекаются к промоторам, однако ряд генов регулируемых PcG, взаимодействуют также с Nanog и Oct-4.
Недавно для мЭСК был описан новый паттерн модификации хроматина (Bernstein et al., 2006). В работе исследовали паттерн метилирования высококонсервативных некодирующих элементов (highly conservative non-coding elements, HCNE), вблизи некоторых из этих последовательностей расположены кластеры Нох генов. Новый паттерн модификации хроматина был назван бивалентным доменом (bivalent domain), который состоит из протяженных последовательностей метилирования лизина-27 НЗ (уже упомянутый маркер репрессии транскрипции), в пределах которых обнаруживаются менее протяженные участки метилирования лизина-4 гистона НЗ (маркер, характерный для активно транскрибируемых генов). Авторы предположили, что бивалентные домены сохраняют гены, кодирующие регуляторы развития, в молчащем состоянии, в то же время в определенной готовности к активации. Авторами описано 95 бивалентных доменов в HCNE, 9 в кластерах генов Нох, 5 в районах, не содержащих последовательностей HCNE. Три четверти бивалентных доменов HCNE располагаются вблизи сайтов инициации транскрипции известных генов, причем К4 сайты располагаются прямо на сайтах инициации. Из них 93 % располагаются на генах, кодирующих транскрипционные факторы семейств Sox, Fox, Pax, Irx, POU. 26 бивалентных доменов, не расположенных на сайтах инициации транскрипции, также представляют интерес; 4 находятся в З -области генов развития npas3, meis2, рах2, wnt8b. Среди не-транскрипционных факторов, регулируемых бивалентными доменами - гены fg/S иргокі, В регионах Нох бивалентные домены особенно велики, покрывая сайты инициации транскрипции генов, все из которых кодируют факторы транскрипции. Бивалентная природа этого нового эпигенетического паттерна предполагает, что гены, регулируемые таким образом, находятся в равновесии между состояниями активации и репрессии, а при дифференцировке окончательно определится, произойдет их активация или репрессия. Самое интересное, что около 50 % бивалентных доменов содержат сайты связывания Oct-4, Nanog, Sox-2, что позволяет предполагать связь этих белком с эпигенетическим статусом ЭСК (Bernstein et al., 2006).
Баланс клеточной адгезии и Writ сигналинга. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП)
Для мЭСК характерна высокая скорость деления и поддержание недифференцированного фенотипа при соблюдении условий культивирования. Уникальная черта клеточного цикла мЭСК - способность продолжать делиться при удалении сыворотки, что, в свою очередь, может быть обусловлено сокращением раннего G1, периода клеточного цикла, в котором клетка чувствительна к митогенным стимулам (Jones, Kazlauskas, 2001). Пролиферация, независимая от ростовых факторов, характерна для многих опухолевых клеток, а значит, механизмы регуляции клеточного цикла трансформированных и эмбриональных клеток могут быть похожи, и отличаются от нетрансформированных соматических клеток, у которых период G1 является наиболее протяженной частью клеточного цикла (Schratt et al., 2001; Burdon et al., 2002). В настоящее время множество данных свидетельствует о том, что регуляторные механизмы обеспечивают непрерывное продвижение мЭСК по клеточному циклу. В подтверждение можно привести следующие данные.
Установлено, что белок Rb, негативный регулятор активности транскрипционного фактора E2F, находится в мЭСК преимущественно в гиперфосфорилированном состоянии, то есть, не способен взаимодействовать с E2F и подавлять его трансактивирующую функцию (Savatier et al., 1994). Показано, что комплексы циклина A/CDK2, циклина E/CDK2, которые фосфорилируют Rb и стимулируют переход из периода G1 в фазу S клеточного цикла, постоянно активны в ходе всего клеточного цикла мЭСК (Stead et al., 2002). Транскрипционные факторы E2F, в свою очередь, активируют транскрипцию генов, необходимых для продвижения по клеточному циклу, в частности гены циклинов Е, Л, е2/1, и другие (Blais, Dynlacht, 2004), Есть данные, показывающие, что ингибиторы циклин-киназных комплексов, негативные регуляторы пролиферации, не участвуют в контроле клеточного цикла мЭСК. Установлено, что действие агентов, повреждающих ДНК, не вызывает длительных блоков клеточного цикла; уровень белка р21Wa , который вовлечен в ответ на стресс, находится на низком уровне в мЭСК (Aladjem et al., 1998; Малашичева и др., 2002). Количество р27кф1 в мЭСК также невелико, и методом иммунопреципитации p27klpI выявляется с циклин-киназными комплексами только в дифференцированных клетках (Bryja et al., 2004). Интересен также тот факт, что мЭСК не прекращают делиться при экспрессии ингибитора комплексов циклинЕ)/СВК4,6 белка pl6ink4a (Savatier et al., 1996). В клетках с продолжительным периодом G1 ингибитор р161П 4а может вызывать блок клеточного цикла за счет подавления комплексов циклинов D/CDK4, 6 (Sherr, Roberts, 1999). Нечувствительность мЭСК к повышенной экспрессии р]6 может быть связана с конститутивной активностью комплексов циклинов Е, A/CDK2. У клеток, в которых регуляция клеточного цикла зависит от ростовых факторов, в частности фибробластов, переход в фазу S начинается с активации комплексов циклинов D/CDK4,6, от которых зависит дальнейшая активация комплексов циклинов Е, A/CDK4, 6 (Jones, Kazlauskas, 2001). Поскольку активность комплексов циклинов Е, A/CDK2 остается высокой в ходе всего клеточного цикла мЭСК, ингибирование комплексов циклинов D/CDK4, 6 ингибитором pl6ink4a не сказывается на эффективности перехода клеток в фазу S. Также установлено, что мЭСК содержат комплексы циклин D3/CDK6, которые не ингибируются pl6,NK4 (Faast et al., 2004).
ВКМ дает начало всем клеткам эмбриона, в том числе и первичным половым клеткам, поэтому сохранение стабильности генетического материала как у клеток ВКМ, так и у полученных из ВКМ мЭСК имеет важное значение. Частота спонтанных мутаций в мЭСК является значительно более низкой по сравнению с соматическими клетками (Cervantes et ah, 2002). Воздействия, приводящие к нарушению первичной структуры ДНК, вызывают апоптотическую гибель, но не продолжительные блоки клеточного цикла. Одним из механизмов реализации блока клеточного цикла в результате воздействий, повреждающих ДНК, является последовательная активация киназ ATM и Chk2. Киназа Chk2 фосфорилирует и подавляет активность позитивного регулятора клеточного цикла, фосфатазы CDC25A, а также фосфорилирует р53, что может приводить к долговременному блоку клеточного цикла. Фосфатаза CDC25A стимулирует прохождение мЭСК в фазу S клеточного цикла, удаляя ингибирующее фосфорилирование CDK2 по тирозину-15, Киназа Chk2 инактивирует фосфатазу CDC25A фосфорилированием по серину-123 (Abraham, 2001). В работе авторов Hong и Stambrook было установлено, что в мЭСК киназа Chk2 гиперфосфорилирована, локализуется в области центросом и функционально неактивна. Ионизирующее излучение не приводило к снижению уровня белка CDC25A, фосфорилированию р53 по серину-23 и накоплению ингибитора циклин-киназных комплексов p21wafl, что характерно для большинства соматических клеток. Эктопическая экспрессия Chk2 в мЭСК придает клеткам способность останавливаться в фазе G1 клеточного цикла после облучения, параллельно снижая долю клеток, гибнущих апоптозом, и наряду с этим вызывает дестабилизацию CDC25A и накопление фосфорилированной по тирозину-15 (неактивной) формы CDK2 (Hong, Stambrook, 2004). Данные, полученные в этой работе, показывают, что Chk2 функционально инактивирована в мЭСК, а введение экзогенной Chk2 дает возможность не только осуществить G1 блок клеточного цикла после ионизирующего облучения, но и спасает клетки от апоптотической гибели. По-видимому, система регуляции клеточного цикла мЭСК настроєна на постоянную пролиферацию и неспособна к реализации сверочных точек (checkpoints) клеточного цикла (схема 3). В настоящее время не известны агенты, способные блокировать деление мЭСК, не вызывая одновременно апоптоз и/или запуск дифференцировки. Возможно, запуск клеточной гибели является главным способом сохранения генетической стабильности мЭСК, предотвращая накопление ошибок ДНК в потомстве быстроделящихся мЭСК.
Баланс ацетилирования и деацетилирования гистонов, регулируемый группами ферментов гистонацетилтрансфераз (HAT) и гистондеацетилаз (HDAC), имеет большое значение в регуляции транскрипции. Характерная для мЭСК система регуляции клеточного цикла может быть связана с постоянной активацией позитивных и подавлением негативных регуляторов клеточного цикла. Ферменты семейства HDAC могут привлекаться к промоторам и обуславливать репрессию ряда генов-участников дифференцировки и негативных регуляторов пролиферации. Активность HDAC важна для сохранения недифференцированного состояния клеток эмбриональной карциномы мыши F9. В ходе дифференцировки клеток F9 активация транскрипции c-jun является одним из ключевых событий. В недифференцированных клетках F9 HDAC3 привлекается к промотору гена c-jun через репрессор транскрипционного фактора АР-1 JDP2 и подавляет транскрипцию c-jun. В процессе дифференцировки клеток F9, вызванной ретиноевой кислотой, происходит замена HDAC3 на комплекс, содержащий ацетилтрансферазу СВР/рЗОО (Jin et al., 2002). Высокая скорость пролиферации клеток может быть связана с активностью HDAC. Ферменты HDAC взаимодействуют с онкогенами некоторых типов лейкемий и лимфом, например, образуют корепрессорный комплекс с белком-продуктом транслокации миелоидной лейкемии PML-RARa. Повышенная экспрессия HDAC1 обнаруживается в клетках рака желудка, простаты и карцином пищевода (Dokmanovic, Marks, 2005). Известно, что ферменты HDAC участвуют в репрессии гена p21Wa , который кодирует ингибитор циклин-киназных комплексов - негативный регулятор клеточного цикла. Транскрипция гена p2iWafl может увеличиваться в результате обработки ингибиторами HDAC (Xiao et al., 1997; Burgess et al., 2000; Richon et al., 2001; Gui et al., 2004).
Замедление пролиферации мЭСК после воздействия TSA подтверждается с помощью мечения CFSE
Функции Р-катенина, адгезионная и сигнальная, строго скоординированы и нарушение баланса в пользу последней может приводить к изменению фенотипа клетки. Экспрессия стабилизированного р-катенина в фибробластах NIH3T3 приводила к трансформации клеток (Whitehead et al., 1995). Дерегуляция Wnt-сигнального пути отмечается при канцерогенезе и встречается в опухолевых клетках кишечника, кожи, матки, яичников, головного мозга и в меланомах. Дерегуляция Wnt-сигнального пути в опухолевых клетках выражается в стабилизации Р-катенина и повышенной транскрипционной активности комплексов TCF/p-катенина. До 80 % опухолей кишечника содержат мутации гена опухолевого супрессора АРС. В ядрах клеток, не содержащих АРС дикого типа, присутствуют комплексы ТСР4/р-катенин, которые активируют активность репортерной конструкции (Korinek et al., 1997). Многие опухоли приобретают мутации, стабилизирующие Р-катенин, и наиболее часто мутации происходят в сайтах фосфорилирования сериновых и треониновых аминокислотных остатков на N-конце молекулы, которые в норме являются сигналом, направляющим р-катенин на деградацию (Morin, 1999; Polakis, 2000).
Многочисленные литературные источники свидетельствуют о необходимости Wnt-сигнального пути для самообновления стволовых клеток тканей и/или делящихся клеток-предшественников тканей. Под стволовыми клетками обычно подразумевают популяции клеток, существующие в определенных участках тканей длительное время и способных к делению с сохранением своих свойств (самообновлению = "self-renewal"). Под клетками-предшественниками понимают делящиеся клетки, потомки стволовых клеток, вставших на путь дифференцировки. Мыши, нокаутированные по TCF4, характеризуются отсутствием стволовых клеток в тонком кишечнике (Korinek et al., 1998). Мыши, экспрессирующие в тонком кишечнике стабилизированный р-катенин без N-концевого домена, содержащего сайты фосфорилирования, демонстрируют усиленную пролиферацию клеток в стенке тонкого кишечника (Wongetal., 1998). Тканеспецифическая экспрессия стабилизированного р-катенина в коже приводила ко второй волне формирования волосяных луковиц после рождения мышей, в то время как у животных дикого типа наружное корневое влагалище, сосочек волоса и сальная железа формируются только в ходе эмбриогенеза (Gat et al., 1998). Исследование кератиноцитов кожи человека в культуре показало, что увеличение не связанного с Е-кадгерином пула р-катенина отмечается именно в делящихся клетках (Zhu, Watt, 1999).
Активация Wnt-сигнального пути стимулирует пролиферацию стволовых клеток крови. Повышенная экспрессия Р-катенина увеличивает пул гематопоэтических стволовых клеток, пригодных для трансплантации, а сверхэкспрессия Axin (негативного регулятора Wnt-сигнального пути) подавляет пролиферацию этих клеток. Растворимые лиганды Wnt-пути влияли на пролиферацию клеток-предшественников крови из эмбриональной печени и костного мозга человека. Результатом активации Wnt сигналинга является усиление экспрессии Notch 1 и НохВ4, которые необходимы для самообновления гематопоэтических стволовых клеток (Austin et al., 1997; Van Den Berg et al., 1998; Reya et al., 2001, Reya et al., 2003). Wnt-сигнальный путь участвует в развитии центральной нервной системы. Экспрессия конститутивно активного Р-катенина стимулировала пролиферацию нейрональных клеток-предшественников и вызывала увеличение размера головного мозга мышей (Chenn, Walsh, 2002).
Участие Wnt-пути в поддержании стволовых клеток тканей и экспансии клеток-предшественников позволяет понять, почему нарушение регуляции Wnt-пути связано с развитием нескольких форм рака. Вероятно, опухолевые клетки могут образовываться при нарушении механизмов регуляции клеточного цикла и дифференцировки стволовых клеток (Reya et al., 2001; Kleber, Sommer, 2004). Поскольку мЭСК имеют черты опухолевых клеток, можно предположить, что их автономная пролиферация обеспечивается участием Wnt-сигнального пути.
Кроме участия в пролиферации Wnt/p-катениновый путь определяет направление дифференцировки клеток-предшественников. При повреждении мышц Wnt-путь запускает миогенную дифференцировку и вовлечен в регенерацию мышц (Polesskaya et al., 2003). В коже Р-катенин необходим для формирования волосяного фолликула в ходе эмбриогенеза, а также определяет направление специализации стволовых клеток кожи. В отсутствие р-катенина, стволовые клетки кожи неспособны образовывать фолликулярные кератиноциты, и дифференцируются только в клетки эпидермиса (Huelsken et al., 2001). Wnt-путь определяет специализацию клеток нервного гребня. Для исследования роли р-катенина в дифференцировке в клетках нервного гребня подавляли экспрессию р-катенина, или напротив, экспрессировали стабилизированный р-катенин. Ни подавление ни усиление экспрессии р-катенина не влияли на пролиферацию клеток, однако приводили к реализации различных программ дифференцировки. В отсутствие Р-катенина стволовые клетки нервного гребня пролиферировали и сохраняли способность к миграции, но были неспособны образовывать сенсорные нейроны и меланоциты. Напротив, продолжительная активация р-катенина приводила к формированию сенсорных нейронов, но не других производных нервного гребня (Dorsky et al., 1998; Dunn et al., 2000; Hari et al., 2002; Lee et al., 2004b; Kleber, Sommer, 2004).
В ходе эмбрионального развития клетки приобретают способность по-разному реагировать на активацию Wnt-пути. Специфический ответ клетки на активацию Wnt-пути зависит и от влияния других сигнальных путей. Показано, что совместное взаимодействие с промотором комплексов TCF/LEF/p-катенин и SMAD4 активирует транскрипцию гена етх2 при стимуляции фактором ВМР2 и эктопической экспрессии стабилизированного р-катенина (Hussein et al., 2003).
Необходимость Wnt-сигнального пути для реализации (ЭМП) в ранних эмбриональных клетках
Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) - процесс, в ходе которого клетки эпителия теряют контакты, меняют морфологию и приобретают способность к миграции. ЭМП происходит многократно в ходе эмбрионального развития, а мезенхим ал ьные клетки, в свою очередь, могут претерпевать обратный, мезенхимально-эпителиальный переход при формировании различных органов. ЭМП происходит в ходе гаструляции, закладке сердца, скелетно-мышечной системы, черепно-лицевых структур и пр.
Метастазирование опухолей происходит в результате приобретения клетками инвазивных свойств. Проследить этот процесс при канцерогенезе в опухолях человека не представляется возможным, однако in vitro клетки карцином претерпевают частичный или полный ЭМП. Общие черты ЭМП обнаруживаются в ходе эмбриогенеза, в опухолях и детально этот процесс можно исследовать в некоторых модельных клеточных линиях (Thiery, 2002). Контакты клеток, опосредованные Е-кадгерином являются характерной чертой эпителиальных клеток, а разрушение этих контактов является одним из определяющих событий при ЭМП. Добавление антител против Е-кадгерина может нарушить контакты и привести к мезенхимальному фенотипу. Некоторые типы клеток в результате ЭМП начинают экспрессировать другую молекулу межклеточной адгезии, N-кадгерин. Экспрессия Е-кадгерина сохраняется в большинстве дифференцированных опухолей, и нарушение Е-кадгериновых контактов происходит на более поздних стадиях развития рака, коррелируя с приобретением инвазивных свойств опухоли и означая неблагоприятный прогноз для пациента. В некоторых типах опухолей наблюдаются мутации гена, приводящие к отсутствию или экспрессии не функционального Е-кадгерина (Behrens et al., 1989; Frixen et al., 1991; Berx et al., 1995; Thiery, 2002).
Потеря контактов с участием Е-кадгерина может обуславливаться разными сигнальными событиями: активацией Wnt-сигналинга, появлением негативных регуляторов транскрипции Е-кадгерина, в частности, факторов Snail, Slug. ЭМП может индуцироваться действием на клетку ростовых факторов, приводящих к активации тирозинкиназ, которые дестабилизируют контакты р-катенина и Е-кадгерина и активируют ряд сигнальных путей, влияющих на организацию актинового цитоскелета. Кроме того ЭМП может обуславливаться активацией МАР-киназного пути через киназу ERK, Р13-киназного пути, а также ряда транскрипционных факторов, например АР-1.
Wnt-сигнальный путь участвует в гаструляции морского ежа: (3-катенин накапливается в ядрах клеток-предшественников энтодермы и мезодермы (Logan et al., 1999). У мышей Wnt-путь участвует в негативной регуляции транскрипции гена Е-кадгерина и индукции ЭМП, что было показано при исследовании процесса закладки волосяной луковицы в ходе эмбриогенеза. При развитии волосяной луковицы происходит врастание эпителия, изменение полярности клеток, и нарушение их контактов. Процесс инициируется двумя сигналами: Wnt и Noggin (ингибитор BMP-сигнального пути). Оба лиганда необходимы для стабилизации 0-катенина и индукции экспрессии LEF1. Комплексы Р-катенин/LEF осуществляют репрессию промотора Е-кадгерина. Подавление транскрипции Е-кадгерина необходимо для этого процесса; если в эксперименте индуцировали экспрессию Е кадгерина, то происходило подавление инвагинации и закладки луковицы не происходило (Jamora et al., 2003).
В экспериментах с созданием мышей, нокаутных по р-катенину, было показано, что в при гаструляции эмбрионов мыши, которая сопровождается ЭМП, р-катенин необходим для закладки мезодермы и участвует в формировании передне-задней оси эмбриона (Haegel et al., 1995; Huelsken et al., 2000).
Снижение экспрессии Е-кадгерина на определенных этапах развития зародыша и при канцерогенезе связано с репрессией промотора гена (кроме случаев мутации Е-кадгерина в некоторых типах опухолей). В подавление транскрипции Е-кадгерина вовлечены транскрипционные факторы, содержащие домен «цинковый палец» (Zn-finger domain). Первым из них был обнаружен фактор Snail, участвующий в индукции гаструляции у дрозофилы (Leptin, 1991). У позвоночных Snail и белок того же семейства, Slug, участвуют в ЭМП в ходе эмбриогенеза. Фактор Snail необходим для процесса гаструляции мыши, а нокауты по этому гену блокируют эмбриональное развитие на стадии гаструлы (Nieto et al., 1994; Carver et al., 2001; Ciruna et al., 2001). Уровень белка Snail и других транскрипционных факторов, подавляющих транскрипцию Е-кадгерина (SIP1, Е2А), часто увеличен в опухолевых клетках, и эктопическая экспрессия Snail в позитивных по Е-кадгерину клетках карциномы может приводить к ЭМП и экспрессии маркеров мезенхимы (Batlle et al., 2000; Сапо et al., 2000; Thiery, 2002). Репрессия транскрипции Е-кадгерина может быть обусловлена эпигенетическими механизмами; известно, что в некоторых типах опухолей промотор гена Е-кадгерина может подвергаться метилированию (Peinado et al., 2004).
Е-кадгерин может оказывать негативное воздействие на Wnt-путь, привлекая Р-катенин в адгезионные комплексы и исключая, тем самым белок из сигнального пула. В работе на клетках рака кишечника человека было показано, что активность Wnt-пути в этих клетках зависит от плотности клеточной культуры, и, соответственно, кадгериновых контактов. При низкой плотности клетки имели инвазивный фенотип, экспрессия Е-кадгерина находилась на низком уровне, а уровень белка Slug (негативного регулятора Е-кадгерина), был напротив, повышен. При достижении высокой плотности культуры экспрессия Slug снижалась, а Е кадгерина возрастала и увеличивалась доля Р-катенина, включенного в примембранные комплексы (СопассІ-Sorrell et al., 2003).
ЭМП может вызываться действием ростовых факторов, таких как HGF, FGF, IGF, TGFp и других лигандов, вызывающих активацию рецепторов-тирозинкиназ и тирозинкиназ, не связанных с рецепторами, например Src, Fer, cYes, которые фосфорилируют р-катенин и нарушают взаимодействия Е-кадгерина и Р-катенина (Thiery, 2002; Brembeck et al., 2004; Nelson, Nusse, 2004). Классический пример ЭМП - разрушение контактов и приобретение подвижности клетками эпителия почки линии MDCK при воздействии HGF и активации рецептора-тирозинкиназы c-Met (Stoker, Perryman, 1985). Для реализации ЭМП в разных по происхождению клетках большое значение имеют различные сигнальные пути, специфически действующие в данном типе клеток. В линии NBTII эпителиально-мезенхимальныи переход, вызываемый разными ростовыми факторами, требует активации путей, опосредованных Ras/ERK и Src (Boyer et al., 1997). Racl является одним из эффекторов Ras, необходимым для завершения программы ЭМП в клетках NBTII. Racl фосфорилирует киназу РАК, которая, в свою очередь, фосфорилирует и подавляет активность киназы легких цепей миозина MLCK, что может приводить к изменению структуры актиновых филаментов. Racl противостоит действию малой ГТФазы Rho, которая активирует киназу RHOCK, а последняя фосфорилирует легкие цепи миозина, благоприятствуя формированию стресс-фибрилл (Sanders et al., 1999).
Похожие диссертации на Механизмы антипролиферативного действия ингибиторов деацетилаз гистонов на эмбриональные стволовые клетки мыши
