Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 8
1.1. Физико-химические свойства активных форм кислорода и азота 12
1.1.1. Активные формы азота 13
1.1.2. Активные формы кислорода 14
1.2. Источники активньтх форм кислорода и азота в биологических системах 21
1.2.1. NO-синтазы 21
1.2.2. Образование активных форм кислорода митохондриями... 24
1.2.3. Ксантиноксидоредуктаза 27
1.3. Взаимодействие активных форм кислорода и азота 28
1.3.1. Активные формы азота в клетке 28
1.3.2. Пероксинитрит 31
1.4. Прооксидантные и антиоксидантные свойства активных форм кислорода и. азота 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Регистрация спектров ЭПР 39
2.2. Получение препаратов 40
2.3. Получение изолированных митохондрий 41
2.4. Индуцирование перикисного окисления митохондрий. Метод определения МДА 42
2.5. Экстракция коэнзимов Q9 и Qi0 из биологических образцов.. 43 Глава 3. Взаимодействие низкомолекулярных динитрозильных комплексов с
активными формами кислорода и гидропероксидами 44
Глава 4. Ферритиы и миоглобин как индукторы перекисного окисления 56
Глава 5. Деструкция белковых динитрозильных комплексов активными формами кислорода 67
5.1. Взаимодействие альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ с супероксидом 67
5.2. Взаимодействие альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ с пероксидом водорода и шдропероксидом трет-бутила 71
5.3. Антиоксидантное действие ДНКЖ 78
5.4. Взаимодействие альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ с пероксинитритом 80
Глава 6. Взаимодействие оксофферилмиоглобина с ДНКЖ 83
Глава 7. Взаимодействие убихинола-10 и GSNO в условиях моделирующих окислительный стресс 90
7.1. Защитное действие GSNO при деструкции убихинона в ходе перекисного окисления гомогената миокарда крыс 90
7.2. Влияние убихинола на антиоксидантное действие GSNO 92
Заключение 96
Выводы 98
Библиографический список 99
- Источники активньтх форм кислорода и азота в биологических системах
- Получение изолированных митохондрий
- Взаимодействие альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ с пероксидом водорода и шдропероксидом трет-бутила
- Влияние убихинола на антиоксидантное действие GSNO
Введение к работе
В настоящее время одной из актуальных задач в медицинской биофизике, физиологии и медицинской химии является изучение короткоживущих активных соединений, выполняющих функцию регуляторов на различных уровнях организации живых организмов. К таким молекулам, в первую очередь, относятся оксид азота (N0) и активные формы кислорода. В последние годы появляется все больше данных о новых физиологических функциях оксида азота и его метаболитов. Наряду с сигнальной ролью N0, важной областью исследований является взаимодействие оксида азота с активными формами кислорода. Возникающие в этих реакциях активные метаболиты азота - пероксинитрит, диоксид азота, N03C1 и. др. являются важным компонентами иммунного ответа в организме человека и животных. С другой стороны, активные формы кислорода и азота участвуют в развитии патологий, связанных с окислительным стрессом, в том числе атеросклероза, ишемической болезни сердца, нейродегенеративных заболеваний, катаракты, рака, диабета. В тоже время, процессы взаимодействия активных форм кислорода с такими производными N0 как S-нитрозотиолы (RSNO) [7] и динитрозильные комплексы железа остаются мало изученным. Существенно, что сам оксид азота и S-нитрозотиолы в некоторых модельных системах проявляют антиоксидантные свойства. Предполагается, что одним из механизмов антиоксидантного действия N0 является связывание свободных ионов железа в составе нитрозильных комплексов [8, 9]. При этом иигибируются реакции свободно-радикального окисления, катализируемые редокс-активными ионами железа. Перекисиое окисление липидов ингибируется также благодаря взаимодействию N0 с алкилпероксильными и алкоксильными радикалами [10]. Оксид азота может защищать другие биологические молекулы от окислительной модификации, нитрозилируя гем и восстанавливая оксоферрилформы гемопротеидов.
Во многих работах в качестве возможных белков-переносчиков N0 в кровотоке рассматриваются гемоглобин и альбумин [7]. Цистеиновые остатки этих белков могут нитрозилироваться, в случае гемоглобина N0 также связывается с железом гема. Показано, что при взаимодействии низ ко молекулярных ДНКЖ с гемоглобином и альбумином образуются ассоциированные с этими белками динитрозильные комплексы железа. Они, так же как и низкомолекулярные ДНКЖ могут играть важную роль в условиях окислительного стресса,
Известно, что супероксид влияет на образование S-нитрозо гемоглобина и стимулирует высвобождение N0 из S-нитрозоальбумина [16]. Редокс-реакции с участием гемоглобина играют важную роль в ходе окислительного стресса [11]. Установлено, что гемоглобин может стимулировать перекисное окисление белок-липидных комплексов. В ряде статей высказано предположение, что динитрозильные комплексы железа с белками могут участвовать в защите клеток от цитотоксического действия активных форм кислорода. Так как белковые динитрозильные комплексы ответственны за многие физиологические функции N0 в организме человека, большое значение имеет изменение их концентрации под действием активных форм кислорода.
В условиях окислительного стресса происходит истощение большинства эндогенных антиоксидантов. В связи с этим, несомненно, актуальным является выяснение влияния производных оксида азота на концентрацию важнейшего липофильного антиоксиданта убихинона (коэнзима Q). Высокая эффективность коэнзима Q связана с тем, что он может регенерировать витамин Е (токоферол) и сам восстанавливается ферментами дыхательной цепи митохондрий или аскорбатом. Однако убихинон может также способствовать генерации супероксидного радикала. Следовательно, взаимодействие убихинона с производными оксида азота может иметь неоднозначный характер. Таким образом, реакции активных форм кислорода с содержащими ион нитрозония производными оксида азота
(RSNO и динитрозильными комплексами железа) могут играть чрезвычайно важную роль как в нормальных условиях существования живого организма, так и в ходе патологических процессов возникающих в результате окислительного стресса. Исследование механизмов взаимодействия производных оксида азота и активных форм кислорода особо актуально, так как они могут определять баланс антиоксидантных и прооксидантных реакций в клетке, а также влиять на концентрацию оксида азота, который является универсальным регулятором многих метаболических путей и физиологических эффектов. Цель и задачи исследования.
Целью работы являлось изучение физиологических роли взаимодействия активных форм кислорода с производными оксида азота, содержащими ион нитрозония, и влияния на эти процессы коэнзима Q (убихинона).
Исходя из поставленной в диссертационной работе цели, решались следующие задачи:
Изучить взаимодействие низкомолекулярных динитрозильных комплексов с активными формами кислорода и органическими гидроиероксидами.
Исследовать особенности реакций ассоциированных с гемоглобином и альбумином динитрозильных комплексов с активными формами кислорода и пероксииитритом.
В системах, моделирующих окислительный стресс, исследовать влияние динитрозильных комплексов железа и S-нитрозоглутатиона на характеристики индуцированного железосодержащими белками перекисного окисления препаратов миокарда.
Изучить действие S-нитрозоглутатиона на окислительную деструкцию липофильных антиоксидантові коэнзима Q и р-каротина, а также взаимодействие в этих условиях коэнзима Q и S-нитрозоглутатиона.
Источники активньтх форм кислорода и азота в биологических системах
В отличие от супероксида, синтез которого может являться побочным результатом взаимодействия кислорода с различными редокс-агентами в клетках, N0 в биологических системах продуцируется ферментативным путем. На сегодняшний день известны четыре изоформы N0-cHHra3(NOS): нейрональная (nNOS), митохондриальная (mtNOS), эндотелиальная (eNOS) и индуцибельная (iNOS) NO-синтазы [33]. Все они осуществляют пятиэлектронное окисление L-аргинина до L-цитрулина с образованием свободного N0 . Все изоформы NOS представляют собой гомодимеры с молекулярным весом 130-180 kD. Основное различие между NO-синтазами заключается в месте их локализации и способах регуляции их ферментативной активности [34]. Эндотелиальная и нейрональная изоформы выявлены в эндотелеоцитах, нейронах, тромбоцитах, нейтрофилах и некоторых других клетках, регулируются преимущественно физиологическими факторами. Вместе с митохондриальной они являются кальций- и кальмодулин- зависимыми NO-сиитазами. Индуцибелно экспрессируемая NO-синтаза найдена в макрофагах, гепатоцитах, фибробластах, миоцитах и в некоторых других клеточных культурах. В отличие от остальных изоформ индуцибельная NO-синтаза не нуждается в ионах кальция для своей активации, так как кальмодулин жестко связан с этим ферментом, обеспечивая его постоянное функционирование [35, 36].
NO-синтазы существуют в клетке в виде димера и активны только в таком состоянии. В составе каждой субъединицы димера различают редуктазный, кальмодулинсвязывающий и оксигеназиый домены. Редуктазный домен содержит флавины ФАД и ФМН: ФАД является первичным акцептором электронов от НАДФЫ, а ФМН переносит электроны от ФАД па гем оксигеназного домена [33]. Оксигеназньтй домен содержит участки связывания гема, аргинина и тетрагидробиоптерина, NOH
Реакции ферментативного образования N0 из L-аргинина. Считается, что комплекс кальмодулииа с Са придает ферменту конформационное состояние, необходимое для внутреннего переноса электронов, Именно различия в прочности связывания кальмодулииа с димером NOS обуславливает каталитические различия изоформ: активность nNOS и eNOS сильно зависит от концентрации Са , в то время как с iNOS кальмодулин связан столь прочно, что она не нуждается в добавлении Са v [36]. Хотя удельные активности всех изоформ NOS одинаковы [37], при работе в организме оказывается, что конститутивно присутствующие в клетках NO-синтазы синтезирует небольшие концентрации N0 в течение короткого времени, a iNOS синтезирует значительно большие концентрации N0 в течение длительных периодов (до нескольких дней). Таким образом, экспрессия и активность той или иной изоформы может обуславливать способность N0 выступать в качестве физиологического регулятора или же токсического агента [38].
Изучение NO-опосредованноЙ цитотоксичности макрофагов [40], проводимое in vitro, отчетливо показало, что добавление в среду ингибиторов NOS, таких как аналог субстрата NG-монометил-L-аргинин , подавляет цитотоксический эффект макрофагов на опухолевые клетки, Это свидетельствует в пользу доминирующей роли N0 в опосредовании этого воздействия макрофагов на клетки-мишени, хотя следует помнить и об известном явлении дыхательной вспышки, играющей существенную роль в уничтожении патогенов фагоцитами. В частности появились данные, усложняющие схему макрофагальной цитотоксичности, обусловленной оксидом азота. Выяснено, что раневые макрофаги, способные к выработке N0, не являются цитотоксичними для NO-чувствительных клеток. Таким образом, встает вопрос о необходимости и достаточности N0 для проявления цитотоксичности макрофагов.
Следует упомянуть также о том, что производство N0 вызывает значительные отрицательные эффекты и в продуцирующих его макрофагах [39]. Показано, что фагоцитоз и выработка активных форм кислорода сильно подавляется у крысиных или перитонеальных макрофагов, культивируемых в условиях, позволяющих производить N0. Макрофаги, экспрессирующие JNOS или обработанные оксидом азота, имеют конденсированное ядро и цитоплазму. Таким образом, выделение N0 активированными макрофагами ведет к их функциональной супрессии, в конце концов, к апоптозу. Эти явления явно связаны с N0, поскольку предупреждаются добавлением ингибиторов NOS.
Конститутивные NO-синтазы, выделяемые из клеток разных типов, по структуре во многом схожи между собой, но отличаются от индуцибельных изоферментов [37]. Антисыворотка против NO-синтазы головного мозга взаимодействует с конститутивно экспрессируемыми ферментами из других клеток, в частности эидотелиоцитов, но не реагирует с иидуцибельной N0-синтазой, что указывает на их принципиальное различие. Кроме того, показано, что ингибиторы NO-синтазы обладают разной эффективностью в отношении различных изоферментов.
Получение изолированных митохондрий
Митохондрии выделяли из сердец крыс. Методика выделения митохондрий была стандартной [90, 91]. Животных усыпляли, используя 20% раствор уретана (1,8 мг/кг массы животного), который вводился в брюшную полость. Затем быстро извлекали сердце и помещали в охлажденную (4С) среду выделения. Состав среды выделения: 300 мМ сахароза, 10 мМ HEPES (Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы-2-этансульфоновая кислота), 0,5 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); р.-Н. 7.4. Сердце перекладывали в чашку Петри, освобождали от предсердий и надрезали с боков для лучшей отмывки от крови. После этого сердце измельчали ножницами, снова промывали раствором среды выделения и пропускали через сито из нержавеющей стали с диаметром отверстий 1 мм. Измельченную ткань переносили в гомогенизатор (стекло-тефлон), добавляли 25-30 мл среды выделения в соответствии с соотношением 1:8 и гомогенизировали 2-3 минуты до превращения суспензии в гомогенную. Осаждение митохондрий производили в два этапа на центрифуге К-24 (ГДР). Супернатант после первого центрифугирования (10 мин, 700 g) осторожно, чтобы не затронуть осадок, переливали через четырехкратно сложенный кусочек марли в новую пробирку и снова центрифугировали (10 мин, 14000 g). Супернатант сливали, пробирку промокали фильтровальной бумагой, вносили в нее 1 мл среды выделения с БСА (бычий сывороточный альбумин, 2 мг/мл) и несильным встряхиванием удаляли фракцию легких митохондрий. Полученный осадок митохондрий суспендировали в 150 мл среды выделения. Далее помещали в маленькую пробирку и хранили во льду или замораживая при -20С. Концентрация белка в митохондриальной суспензии, определенная по биуретовому методу [91], составляла 30-35 мг/мл.
Свободнорадикалы-юе окисление митохондрий индуцировали добавлением 400 мкМ гидропероксида трет-бутила и 100 мкМ метмиоглобина. В ряде экспериментов вместо метмиоглобина или совместно с ним добавляли ферритин (2,5 мг/мл). Образцы объемом в 1 мл инкубировались в течение 2 часов при 37С после чего в них определялось содержание малонового диальдегида (МДА). Для этого к 0,5 мл инкубационной смеси, содержащей препарат митохондрий, добавляли 1,5 мл 1%-ной фосфорной кислоты, 10 4 М ЭДТА, 10 5 М ВНТ и 1 мл 0,5%-ного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК), после чего инкубировали 45 мин при 100С. После охлаждения смеси, комплекс МДА с ТБК экстрагировали Н-бутанолом. В бутанольной фазе регистрировали спектр поглощения в области 515-550 нм. Концентрацию МДА рассчитывали по оптической плотности комплексов МДА-ТБК при 532 нм (є532= 1,56 " 105 М"1 см"1) [92]. Все оптические измерения проводили на спектрофотометрах Hitachi 557 (Япония) и Beckman Coulter Д 650 (США).
При исследовании взаимодействия ДНКЖ с супероксидным радикалом (02 ), последний генерировали добавлением к реакционной смеси свежеприготовленного раствора супероксида калия (К02) в диметилсульфоксиде или использовали систему ксантин-ксантиноксидаза для ферментативной генерации 02 [93, 94]. В этих экспериментах для связывания ионов железа возникающих при деструкции ДНКЖ в инкубационную среду вводили 0,2-0,5 мМ комплексом железа -диэтилентриаминопентауксусиой кислоты (ДТПА).
Экстракция коэнзимов Q и Qio из биологических образцов. Количественный анализ а-токоферола и коэнзимов Q9 и Q10 проводили по методике [148] с некоторыми модификациями. К 100 мкл надосадочной жидкости гомогената миокарда (или 100 мкл сыворотки крови) добавляли 220 мкл этанола и 550 мкл п-гексана, тщательно встряхивали в течение 10 мин, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 3 мин и верхний слой п-гексана отбирали в объеме 500 мкл. К остатку добавляли еще 550 мкл п-гексана и повторяли процедуру экстракции и отбора экстракта. Объединенный экстракт в n-гексане упаривали досуха, растворяли в 100 мкл этанола и восстанавливали окисленную форму коэнзимов Q9 и QU1 добавлением 10 мкл 5% раствора натрия тетрагидробората в этаноле. 11 мкл восстановленного экстракта анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием на оборудовании фирмы "ESA" (США): насос модели 580 и электрохимический детектор "Coulochem IT". Разделение проводилось в обращенно-фазовом изократическом режиме элюции на колонке С 1.8, 150x4.6 мм с размером частиц сорбента 5 мкм при скорости потока элюента 1.3 мл/мин. Подвижная фаза содержала 0,3% NaCl в смеси этанол:метанол:7% НСЮ«[ (970:20:10). Электрохимическое детектирование осуществлялось с помощью аналитической ячейки (model 5011) при напряжении на первой паре электродов - -50 мв и на второй - +350 мв. Время удерживания составило 6,5 и 8,5 мин для коэнзимов Q9 и Q!0 соответственно; для а-токоферола - 3,2 мин. Регистрация и обработка хроматографических данных велась с помощью компьтерной программы фирмы "ESA" (США).
Взаимодействие альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ с пероксидом водорода и шдропероксидом трет-бутила
Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы можно считать формами существования оксида азота в биологических системах. Они обнаруживаются в большинстве клеток и тканей животных. Включение N0 в RSNO и ДНКЖ обеспечивает не только его стабилизацию, но и транспорт на значительные расстояния [94, 107, 132].
В данной системе исследовалось взаимодействие белковых ДНКЖ с супероксидом, ферментативно генерируемым в системе ксантип-ксантиноксидаза. На рис. 14 и 15 представлены кинетики гибели альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ, соответственно, под действием супероксида. Время распада обоих ДНКЖ составляет минуты. Поэтому для получения хорошей воспроизводимости, раствор белковых ДНКЖ сразу после приготовления, делился на аликвоты и хранился в жидком азоте до приготовления экспериментальной смеси и регистрации спектра ЭПР. В течении первых 7 минут инкубации в растворе, содержащем ксантип-ксантиноксидазу, происходит падение концентрации гемоглобиновых ДНКЖ па 55% и альбуминовых ДНКЖ на 75%. При дальнейшей инкубации в этой реакционной системе кинетика гибели белковых ДНКЖ приближалась к кинетике деструкции этих комплексов в присутствии одной ксаптиноксидазы (спонтанной деструкции без ферментативной генерации супероксида) (рис, 14 и 15). На окислительную деструкцию белковых ДНКЖ помимо супероксида, генерируемого системой ксантин-ксантиноксидазы, могут влиять гидроксильный радикал и супероксид, образующиеся в результате реакций Фентона и Хабера-Вейса, катализируемых примесным железом.
Для защиты от этих артефактов в реакционную среду добавляли хелатор железа - диэтилентриаминопентауксусную кислоту (ДТПА).
Супероксиддисмутаза уменьшает наблюдаемое снижение концентрации ЭПР-детектируемых белковых ДНКЖ. Однако распад альбуминовых ДНКЖ ингибируется СОД значительно эффективней, чем ДНКЖ, связанных с гемоглобином (рис. 14 кривые 2 и 3, рис. 15 кривые 2 и 3). Добавление в среду каталазы, помимо СОД, значительно усиливает защитный эффект (рис. 15 кривая 4). Причем защитный эффект каталазы для гемоглобиновых ДНКЖ существенно более выраженный, чем для альбуминовых. Следовательно, можно предположить, что гибель гемоглобиновых ДНКЖ в наших экспериментах зависит не только от супероксида, но и от пероксида водорода, образующегося при дисмутации супероксида. Причем вклад пероксида водорода в разрушение гемоглобиновых ДНКЖ больше, чем вклад супероксида.
Представляется вероятным, что разница в кинетиках гибели альбуминовых и гемоглобиновых динитрозильных комплексах связана с взаимодействием гема с пероксидом водорода, в результате которого возникают активные интермедиа, способные внести свои вклад в деструкцию гемоглобиновых ДНКЖ. При взаимодействии пероксида водорода с гемом образуется феррилгемоглобин, являющийся сильнейшим окислителем [56, 133, 134]: Hb-heme-Fe3+ + Н202 - Hb-heme-Fe4 =0 + Н20 (36)
В то же время, известно что динитрозильные комплексы существуют в динамическом равновесии с компонентами, их составляющими, т.е. в растворе с ДНКЖ всегда будет существовать небольшая концентрация оксида азота. Феррилгемоглобин может реагировать с этим оксидом азота и через промежуточное соединение восстанавливаться до метгемоглобина [56]: Hb-heme-Fe4+=0 + NO - Hb-heme-Fe3+-ONO - - Hb-heme-Fe3+ + N02 (55) С другой стороны, представляется вполне вероятным, что аналогичным образом феррилгемоглобин может взаимодействовать и с дииитрозильными комплексами [105]: Hb-heme-Fe4+=0 + (RS Fe-(NO )2 -» - Hb-heme-Fe3" + (RS Fe2+-(NO+)ONO (56)
Таким образом, разницу в кинетиках деструкции гемоглобиновых и альбуминовых ДНКЖ можно объяснить взаимодействием гема с активными формами кислорода и азота. В данных условиях динитрозильные комплексы оказываются способными эффективно восстанавливать феррилгемоглобин, фактически выступая в роли антиоксидантов. Это может иметь большое значение для тканей с высоким содержанием гемопротеидов, находящихся в условиях окислительного стресса.
Влияние убихинола на антиоксидантное действие GSNO
При взаимодействии органических гидропероксидов с метмиоглобином могут возникать алкоксильные и алкилпероксильные радикалы и оксоферрилформа миоглобина.
Можно предположить, что убихинол окисляется оксоферрилгемом или липидными радикалами до убисемихинона, в реакции которого с кислородом образуется супероксидный радикал. Последний, как было отмечено ранее, реагирует с свободным N0, в результате чего возникает пероксинитрит. Известно, что супероксид может прямо взаимодействовать с GSNO [143]. Таким образом, противоположный синергическому (анергический) эффект сочетания убинола-10 и GSNO, может быть обусловлен генерацией супероксида. Действительно, супероксиддисмутаза и цитохром с. устраняя супероксид из реакционной среды, восстанавливают протекторное действие GSNO в отношении р-каротина (рис. 27, столбцы 3 и 4). Не исключено, что прооксидантпое действие убинола-10 связано с образованием нитроксильного аниона (N0") в реакции: UQ + NO - UQ + NO- (73) Следует отметить, что N0", реагируя с кислородом превращается в пероксинитрит, т.е. нитроксильный анион также относится к прооксидані ным метаболитам оксида азота. Оценить вклад супероксида и N0" в прооксидантное действие убинола-10, на данном этапе исследований достаточно трудно, так как супероксиддисмутаза и цитохром с могут взаимодействовать с нитроксильпым анионом.
Вышеизложенные данные свидетельствуют о том, что GSNO и различные типы ДНКЖ в большинстве исследованных модельных систем проявляют антиоксидантные свойства. Быстрая деструкция как низкомолекулярных так и белковых динитрозильных комплексов под действием активных форм кислорода и азота позволяет предположить, что эти соединения способны защищать другие биологические молекулы от деструкции в ходе окислительного стресса. Это подтверждается предотвращением окислительной модификацией гемоглобиновых ДНКЖ, J3-каротина, а также убихинона. Исходя из сходной кинетики деструкции гемоглобиновых и альбуминовых ДНКЖ под действием супероксида можно предположить, что механизм их защиты аналогичен. В тоже время характер взаимодействия белковых ДНТСЖ с гидропероксидами и пероксинитритом существенно различается, что обусловлено наличием гема в молекуле гемоглобина. Это может свидетельствовать о различной роли гемоглобиновых и альбуминовых ДНКЖ в организме. Представляется вероятным, что гемоглобиновые ДНКЖ являются локальными редокс-протекторами, защищающими в первую очередь сам белок. Тогда как взаимодействие альбуминовых ДНКЖ с кислородными радикалами может быть одним из механизмов регуляции сигнальной функции N0.
Интересным результатом работы является доказательство отсутствия прямого взаимодействия пероксида водорода с динитрозильными комплексами железа. Этот экспериментальный факт под і верждает высказанную в литературе гипотезу о связи антиоксидантного действия N0 с его способностью хелатировать ионы свободного железа [103].
Следует отметить, что в условиях генерации N0 возможна инверсия прооксидантных свойств ферритина и миоглобииа в антиоксидантные, так как первый является источником ионов железа для ДНКЖ, а второй может переходить в нитрозилированую форму. В этих условиях ДНКЖ и GSNO могут восстанавливать оксоферрил форму миоглобииа. Причем действие
ДНКЖ носит кооперативный характер, т.е. в восстановлении оксоферрилгема участвуют различные компоненты этих комплексов. Возможно так же, что ДНКЖ являются медиаторами восстановления оксоферрилгемопротеидов другими антиоксидантами, например, глутатиона. Такой механизм медиаторного действия ДНКЖ в ходе восстановления оксоферрилгема тиолами может лежать в основе антиоксидантных свойств N0 и S-нитрозотиолов при индуцированном гемопротеидами свободнорадикальном окислении. В этом случае оксид азота и S-нитрозотиолы могут быть предшественниками нитрозильных комплексов железа, способных эффективно восстанавливать оке оферрил формы гемопротеидов и взаимодействовать со свободными радикалами. Действительно, показано, что антиоксидантное действие N0 при инкубации культуры эритролейкемических клеток с гидропероксидом трет-бутила и гемоглобином сопровождается формированием нитрозильных комплексов железа [21, 136]. Аналогичные условия в организме человека и животных возникают при ишемии и последующей реперфузии, которая сопровождается усиленной генерацией активных форм кислорода, а также стимуляцией синтеза оксида азота [137]. Исходя из этого представляется вероятным, что взаимодействие N0, ионов железа и гемопротеидов может играть ключевую роль в поддержании тонкого равновесия в реакциях свободнорадикального окисления, от которого во многом зависит судьба клетки в условиях гипоксии и последующей рсоксигенации, особенно характерных для ишемического поражения мышечной ткани.
