Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 13
2.1. Общие сведения об образовании и метаболизме БР в организме человека 13
2.2. Структура и физико-химические свойства БР 16
2.2.1. Строение молекулы БР 16
2.2.2. Растворимость БР в различных средах 18
2.2.3. Комплексные соединения БР с биологически значимыми молекулами и свойства этих комплексов 19
2.2.4. Взаимодействие БР с липопротеидами и липидами мембран 23
2.2.5. Окислительно-восстановительные превращения БР 26
2.2.6. Антиоксидантные свойства БР в системах in vitro 30
2.2.7. Альтернативные пути метаболизма БР 36
2.3. Роль БР в защите организма от окислительного стресса 38
2.3.1. Г01 - белок, индуцируемый окислительным стрессом 38
2.3.2. Влияние БР на апоптоз и пролиферацию 42
2.3.3. БР и канцерогенез 44
2.3.4. Патологии, возникающие при недостаточности БР 45
2.3.5. Желтуха новорожденных как защита от окислительного стресса 46
2.3.6. Цитопротекторное действие БР на головной мозг 47
2.3.7. Изменения в системе ГО-БР при стрессе 49
2.3.8. Защитное действие БР при ишемии-репрефузии 50
2.3.9. БР и атеросклероз 51
2.3.10. Иммуномодулирующее и противовоспалительное действие БР 53
2.3.11. Неизученные аспекты защитного действия БР 55
3. Объекты, материалы и методы исследования 58
3.1. Биофизические и биохимические методы 58
3.2. Работа с животными 60
3.3. Исследование сыворотки крови больных 61
3.4. Статистическая обработка результатов 63
4. Результаты исследования 64
4.1. Исследование ингибирующей активности БР в реакциях свободнорадикального окисления 64
4.1.1. Определение константы скорости реакции БР с пероксильными радикалами на модели инициированного окисления этил бензола
4.1.2. Исследование антиокислительной активности БР на модели термического окисления метилового эфира олеиновой кислоты 74
4.2. Влияние экспериментальной желтухи на интенсивность ПОЛ у подопытных животных 79
4.2.1. Патогенез и моделирование различных видов желтухи 79
4.2.2. Изменение содержание продуктов ПОЛ в в органах подопытных животных при введении им БР 82
4.2.3. ПОЛ при повышении содержания липидов в печени
4.2.4. Роль БР в регуляции ПОЛ при холестатических поражениях печени 94
4.3. Антиапоптотическое действие БР, обусловленное его влиянием на функционирование сигнальной системы сфингомие линового цикла 113
4.3.1. Влияние БР на активность нейтральной СФМазы - ключевого фермента сфингомиелинового цикла 119
4.3.2. Влияние гипербилирубинемии, вызванной перевязкой общего желчного протока на содержание ФНО-а в печени крыс 129
4.3.3. Влияние БР на апоптоз, индуцированный сфингозином и УФ-облучением 133
4.4. Роль БР как природного антиоксиданта в регуляции ПОЛ при заболеваниях печени и желчевыводящих путей 140
4.4.1. Интенсивность ПОЛ и его связь с изменениями состава и антиокислительных свойств липидов в сыворотке крови практически здоровых доноров 140
4.4.2. Влияние БР на интенсивность ПОЛ при остром вирусном гепатите 147
4.4.3. Роль БР в изменении интенсивности ПОЛ при хронических хронических гепатитах и циррозах печени 178
4.4.4. Интенсивность ПОЛ в сыворотке крови при синдромеЖи-льбера, жировом гепатозе хроническом носительстве/ffis антигена и опухолях печени 189
4.4.5. Роль БР в регуляции ПОЛ при холестатических поражениях печени 199
Заключение 227
Выводы 243
Список аббревиатур 247
Литература 248
- Структура и физико-химические свойства БР
- Роль БР в защите организма от окислительного стресса
- Влияние экспериментальной желтухи на интенсивность ПОЛ у подопытных животных
- Антиапоптотическое действие БР, обусловленное его влиянием на функционирование сигнальной системы сфингомие линового цикла
Введение к работе
Актуальность работы. В течение длительного времени продукт катаболизма гемсодержащих соединений билирубин (БР), наравне с другими продуктами жизнедеятельности, рассматривался исключительно как своего рода «промышленный отход», подлежащий выведению из организма. Несмотря на то, что в 50-х годах прошлого века исследователями-химиками была обнаружена способность БР ингибировать реакции сво-боднорадикального окисления органических веществ [Bernhard et ah, 1954], этот факт в течение долгого времени не привлекал должного внимания биологов и медиков. Повышение уровня БР в организме традиционно расценивалось как негативное явление и интерпретировалось как проявление патологии (при заболеваниях печени и желчевыводящих путей), либо как потенциально опасный фактор (при «ядерной желтухе», вызванной резус-несовместимостью матери и ребенка).
Впервые физиологическая роль БР как эффективного эндогенного антиоксиданта была показана нами в 1985 году. Начиная с этого времени, в литературе стали появляться работы, посвященные цитопротекторному действию БР, обусловленному его антиоксидантными свойствами, и количество доказательств защитной роли БР при различных патологиях стремительно возрастает с каждым годом. Тем не менее, механизм инги-бирующего действия БР в реакциях свободнорадикального окисления и в настоящее время остается во многом неизвестным.
Несмотря на общепринятую концепцию о ведущей роли процессов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в патогенезе заболеваний печени и желчевыводящих путей, сопровождаемых желтухой, роль и значение БР в формировании защитных механизмов при этой патологии до сих пор остаются неизученными. Среди клиницистов по-прежнему доминирующим является мнение о токсичности данного пигмента. В норме стационар- ность процессов ПОЛ на уровне мембран и клеток поддерживается физико-химической системой регуляции, основными параметрами которой являются антиокислительная активность (АОА), состав липидов и структурная организация мембран [Бурлакова, 1975, 1992]. В случае если аналогичная регуляция существует на организменном уровне, ее интегральными характеристиками должны являться параметры липидов сыворотки крови, а ключевую роль в ее функционировании будет играть печень, поскольку именно она является органом, ответственным за поддержание липидного гомеостаза. Роль нарушений липидного обмена при патологии печени общеизвестна, однако данные о влиянии БР на соотношение между интенсивностью ПОЛ, уровнем антиокислительной активности (АОА) липидов и показателями липидного обмена сыворотки крови при патологии печени и желчевыводящих путей в литературе отсутствуют. Нет и сведений о том, какое действие на протекание ПОЛ в органах и тканях оказывает повышение содержания БР в крови.
Известно, что при заболеваниях печени и желчевыводящих путей гепатоциты гибнут преимущественно по механизму апоптоза [Ziol et al.,2001; Vanlandschoot, 2003]. Пути, по которым проходит сигнал апоптоза, наряду с другими возможностями, включает активацию сфингомиели-нового цикла, функционирование которого зависит от интенсивности реакций ПОЛ. Данные о влиянии БР на активность сфингомиелинового цикла и на апоптотическую гибель клеток, индуцированную его продуктами, до публикации наших работ в литературе отсутствовали. Между тем, данный вопрос может представлять дополнительный интерес, поскольку при взаимодействии с клеточной поверхностью БР избирательно связывается со сфинголипидами.
Исследование механизма антиоксидантного действия БР и его ци-топротекторных свойств является актуальным - во-первых, оно может быть полезным для понимания патогенеза и разработки новых методов терапии ряда распространенных заболеваний. Во-вторых, знание закономерностей протекания процессов ПОЛ при гипербилирубинемии может способствовать выработке критериев дифференциальной диагностики заболеваний, протекающих с желтухой. И, наконец, знание механизма антиоксидантного действия БР может способствовать синтезу новых лекарственных средств из класса антиоксидантов, поскольку, в отличие от большинства из них, БР не принадлежит к классу экранированных фенолов.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение механизма ингибирования билирубином реакций свободноради-кального окисления, его действия на процессы, сопровождающие повреждение и апоптотическую гибель клеток, а также влияния на интенсивность пероксидного окисления липидов при патологии печени и желчевы-водящих путей в эксперименте и клинике.
Для достижения намеченной цели исследования были поставлены следующие задачи:
Исследование механизма ингибирующего действия БР в реакциях свободнорадикального окисления, определение константы скорости его реакции с пероксильными радикалами и измерение его антиокислительной активности; изучение параметров ПОЛ и липидного обмена при моделировании патологии печени и желче выводящих путей в экспериментах на животных, а также путем внутрибрюшинного введения им БР; установление характера действия БР на процессы, связанные с апоптотической гибелью клеток: исследование действия БР на апоптоз тимоцитов, индуцирован ный in vitro УФ-облучением, а также продуктам сфингомиелино- # вого цикла, сфингозином; изучение влияния желтухи (внутрибрюшинного введения БР подопытным животным или перевязки у них общего желчного протока) на активность ключевого фермента сфингомиелинового цикла, генерирующего вторичные посредники сигнала апоптоза, - сфингомиелиназы (СФМазы); определение связи между активностью СФМазы и содержанием продуктов ПОЛ в норме и при моделировании патологии печени; исследование влияния желтухи, вызванной перевязкой общего желчного протока у животных на экспрессию проапоптотическо-го цитокина, фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-а);
4, определение параметров ПОЛ и влияния на них концентрации БР в сыворотке крови больных с патологией печени и желчевыводящих путей.
Основные положения, выносимые на защиту
БР является эффективным антиоксидантом, ингибирующее действие которого осуществляется в реакции с пероксильными радикалами. Одна молекула БР может обрывать больше двух цепей окисления за счет образования продуктов превращения, также обладающих ингибирующи-ми свойствами.
Между активностью ключевого фермента сфингомиелинового цикла (генератора вторичных посредников сигнала апоптоза) - нейтральной СФМазой и интенсивностью ПОЛ существует прямая взаимосвязь. БР как антиоксидант может не только защищать липиды клеточных мем- # бран от пероксидного окисления, но и, воздействуя на сфингомиелиновый цикл, защищать клетки организма от апоптоза.
3. В сыворотке крови существует взаимосвязь между изменением скорости окислительных реакций в липидах, их составом и антиокислительными свойствами, что является доказательством существования физико-химической системы регуляции ПОЛ на организменном уровне. Ключевую роль в функционировании этой системы играет печень, синтезирующая липопротеиды, в составе которых липиды циркулируют в сыворотке крови. Повышение уровня БР является компенсаторным механизмом, позволяющим регулировать протекание реакций ПОЛ при патологии печени и желчевыводящих путей.
Научная новизна. Впервые изучен молекулярный механизм антиоксидантного действия БР. Показано, что ингибирующее действие БР осуществляется в реакции с пероксильными радикалами. Продукты превращения БР также обладают ингибирующими свойствами. Константа скорости реакции БР с пероксильными радикалами близка к таковой ио-нола, активность продуктов превращения несколько ниже. АО А БР в два раза превышает активность ионола.
Впервые показано наличие тесной взаимосвязи между изменением скорости окислительных реакций в липидах, их составом и антиокислительными свойствами сыворотки крови, что является доказательством существования физико-химической системы регуляции ПОЛ на организменном уровне. Обнаружено, что желтуха может являться компенсаторным механизмом, позволяющим регулировать протекание реакций ПОЛ при патологии печени и желчевыводящих путей, когда функциональные способности гепатоцитов снижены.
Впервые обнаружено, что гипербилирубинемия при остром вирусном гепатите сопровождается выраженным снижением уровня продуктов ПОЛ и нарастанием АО А липидов крови больных. Расчетным путем показано, что повышение уровня АОА при остром вирусном гепатите (ОВГ) происходит за счет БР. При сопоставлении содержания БР с активностью маркерных ферментов в крови больных выявлена обратная зависимость между степенью лабилизации мембран гепатоцитов и уровнем гиперби- лирубинемии. Обнаружено качественное отличие ком ато генных форм ОВГ от неосложненных форм этого заболевания, состоящее в том, что накопление продуктов ПОЛ в крови больных с энцефалопатией является результатом свободнорадикального окисления липидов и происходит одновременно с разбалансировкой систем, регулирующих интенсивность ПОЛ. Впервые выявлено, что нормальное содержание продуктов ПОЛ в крови больных хроническими гепатитами и циррозами свидетельствует о наличии у них «скрытого» окислительного стресса. Впервые обнаружено, что при внутрипеченочном холестазе происходит угнетение реакций ПОЛ в сыворотке крови больных и в печени экспериментальных животных.
Впервые определен характер влияния БР на активность СФМазы при введении его подопытным животным, при этом выявлена взаимосвязь между интенсивностью ПОЛ и активностью СФМазы. Продемонстрировано, что, помимо ингибирования ПОЛ, дополнительным механизмом ин-гибирования СФМазы может являться избирательное связывание БР со сфинголипидами. Проведено исследование изменения активности СФМазы, содержания ФНО-а и интенсивности ПОЛ в печени крыс при экспериментальной механической желтухе. Обнаружен двухфазный характер изменения исследованных показателей. Их выраженное снижение на ранних сроках холестаза может быть обусловлено цитопротекторными и антиоксидантными свойствами БР.
Впервые исследовано влияние БР на апоптоз, индуцированный одним из продуктов сфингомиелинового цикла, сфингозином, и УФ-облучением. Показана биохимическая связь между БР и окислительным стрессом с одной стороны и БР, сфингомиелиновым циклом и апоптозом - с другой. Полученные данные показывают, что БР, воздействуя на сфингомиелиновый цикл, может защищать клетки организма от апоптоза вызванного не только непосредственно активацией ПОЛ, но и другими стимулами.
Совокупность проведенных исследований позволяет сформулировать создание нового научного направления «физико-химическая регуляция процессов ПОЛ в организме конечным продуктом обмена -билирубином».
Научно-практическая значимость. Показано наличие физико-химической системы регуляции стационарного режима окислительных реакций в липидах сыворотки крови, В норме эту гомеостатическую функцию выполняет печень путем модификации количественного содержания и состава липопротеидов сыворотки крови. При патологии органа, когда нарушаются функции гепатоцитов, дополнительным способом регуляции интенсивности ПОЛ может являться повышение уровня БР. Знание закономерностей протекания процессов ПОЛ у больных с желтухой необходимо для определения критериев применения гепатопротекторов, поскольку большинство из них относится к классу антиоксидантов.
Факт наличия у БР антиоксидантных свойств, в сочетании с имеющимися данными о потенциальной опасности светотерапии желтухи новорожденных (канцерогенное и мутагенное действие, повреждение сосудистых стенок), должен, на наш взгляд, повлиять на критерии применения этого метода.
Практическим следствием из проведенной работы явилась возможность использования показателей ПОЛ для дифференциальной диагностики первичного билиарного цирроза и подпеченочных желтух опухолевого генеза. Диагностика данных заболеваний часто представляет трудности для клиницистов, поскольку проявления холестаза однотипны при всех его формах. Определение содержания продуктов ПОЛ в сыворотке крови больных оказалось также информативным для выявления сопутствующего панкреатита при осложненных формах желчнокаменной болезни. Использование этих показателей представляется целесообразным для выбора лечебной тактики и оптимального времени хирургического вмешательства.
Выявленное нами ингибирование БР апоптотической деградации ДНК может быть полезным при разработке тактики лечения заболеваний, сопровождающихся желтухой. В частности БР может оказывать серьезное влияние на эффективность противораковой радио-, хемо- и фото динамической терапии (направленной на индукцию апоптоза клеток опухоли) у больных с опухолями в гепатопанкреадуоденальной области.
Диссертационная работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН в соответствии с планами научно-исследовательских работ Института в рамках грантов РФФИ № 95-04-12209, 98-04-48256-а, 02-04-48048-а, 02-04 48228, Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине», Всесоюзной программы «Биоантиок-сидант».
Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в разработке методологии исследования, определении задач и выборе методов их решения, проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследований - от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.
Апробация диссертации и публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 45 печатных работах.
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на различ ных Международных, Всесоюзных, Всероссийских и Республиканских я симпозиумах, конференциях, съездах: Всесоюзн. Конф. «Острая ишемия органов и ранние постишемические расстройства», Москва, 1978; «Структура, биосинтез и превращения липидов в организме животного и человека», Ленинград, 1978; «Физико-химические процессы в газовой и конденсированной фазах» Черноголовка, 1979; VII Intern. Symp. on Med. Chem., Malaga, Spain, 1980; VI Всесоюзн. конф. по клинической биохимии, морфологии и иммунологии инфекционных болезней. Рига, 1983; «Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека», Москва, 1985; II и III Рес-публ. конф. ученых-медиков Латв. ССР, Рига, 1985, 1988; II-VI Всесоюзн. (впоследствии - Всеросс. с международным участием, Москва, 1986, 1989, 1991, 1998, 2002) конф. «Биоантиоксидант»; V Всесоюзн. съезде биохимиков, Киев, 1986; «Актуальные вопросы диагностики, эпидемиологии и профилактики острого вирусного гепатита А», 1987, Ленинград; «Биохимия - медицине», Ленинград, 1988; II Всесоюзн. съезде токсикологов. Ростов-на-Дону, 1988; Всесоюзн.симп. "Реконструкция, стабилизация и репарация биологических мембран", Благовещенск, 1989; VII биохим. конф. Прибалт, респ. «Теоретические и практические аспекты современной биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии", Вильнюс, 1990; Vispas. latv. zin. kongr., Riga, 1991 (Всемирн. Конгрессе латвийских ученых); Конф ЮНЕСКО, посвященной 100-летию академика Н.Н.Семенова, Москва, 1998; X Междунар. конф. «Химия органических и элементоорганических пероксидов», Москва, 1998; Всеросс. конф. «В грядущем столетии - к новому качеству жизни больных ишемической болезнью сердца». Москва, 2000; «Свободные радикалы, антиоксидантні и болезни человека», Смоленск, 2001; III Съезде биохимического общества, С.-Петербург, 2002; XII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Казань, 2003; EMBO Conference, Bologna, Italy, 1999; XI Intl. Congr. liver diseases, Basel, Switzerland, 1999; 3rd and 4rd ISSFAL Congr., Lyon, France, 1998 and Tsukuba, Japan, 2000; FEBS Conference, Birmingham, England, 2000; Intl. Congr. "Fortschritte in Gastroenterologie und Hepatologie 2001", Hannover, Germany, 2001; 42-44 ICBL Conf., Bergen, Norway, 2001, Graz, Austria, 2002, Oxford, England, 2003; Intl. Congr. "Gastroenterologie-woche Freiburg 2002", Germany; EASL Conf., Madrid, 2002, Spain; XI1h Bien. SFRR Meet., Paris, France, 2002; 5th Intl. EFAE Congr., Taipei, Taiwan, 2002; VIII Interl. Congr. on Phospholipids, Vienna, Austria, 2002; 25th World ISF Congr., Bordeaux, France, 2003.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 335 стр., включая 78 рисунков, 24 таблицы, и список литературы. Диссертация состоит из введения, описания объектов, материалов и методов исследования, 3-х глав, заключения, выводов и библиографического указателя (776 источников, из них 680 опубликованы в зарубежных изданиях).
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Структура и физико-химические свойства БР
Вероятно, увеличение концентрации МДА является следствием усиления процессов ПОЛ. Аналогичные результаты были получены при заражении личинок Galleria mellonella, капустной белянки Pieris brassicae и хлопковой совки Spodoptera littoralis бактериями БТ [Штерн ши с, 1995; Boctor, Salama,1983]. В частности, было обнаружено уменьшение общего числа липидов и количества мононенасыщенных жирных кислот при увеличении количества полиненасыщенных жирных кислот, а также увеличение концентрации МДА и диеновых коньюгатов, что свидетельствовало об изменении состава мембран, характерного для перекисного окисления липидов и накоплении конечных продуктов ПОЛ. Возможно, действие активированного 5-эндотоксина на клетки эпителия кишечника при развитии бактериоза может приводить к усилению реакции ПОЛ, которая является источником АКМ. Неконтролируемое усиление радикальных окислительных процессов может вызвать разобщение процессов окислительного фосфорилирования, нарушение ионного транспорта, образование литических пор в плазматической мембране и как следствие гибель клеток [Travers et al„ 1976; Harvey et al., 1983; Knowles, Ellar, 1987]. На вторые сутки развития бактериоза концентрация МДА достоверно (р 0,01) снижалась в 2 раза по сравнению с контрольными значениями, с последующей нормализацией до контрольного уровня на третьи сутки (Рис. 6). Не исключено, что данные изменения возможны за счет действия антиоксидантной системы, которая может играть значительную роль в поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза в кишечнике при развитии бактериоза на фоне усиления реакции ПОЛ и индукции АКМ. Для подтверждения этого предположения было изучено изменение активности ферментативных антиоксидантов (СОД, Кат, ГТ), а также неферментативных (тиолы) во время бактериоза. В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что при инфицировании личинок G. mellonella высокопатогенным штаммом БТ 69-6 происходит достоверное (р 0,05; р 0,01) увеличение активности СОД в течение всего опыта (Рис. 7). Установлено, что на первые сутки после контролем)
Активность этого специализированного антиоксиданта зависит от концентрации в среде супероксидного анион-радикала, продукция которого может увеличиваться при нарушениях в цепи транспорта электронов митохондрий и микросом, сопутствующих развитию деструктивных процессов в клетках кишечника [Зенков и др., 2001]. СОД катализирует реакцию дисмутации супероксидного анион-радикала (О ) в перекись водорода (Н2О2) [Felton, Summers, 1995]. В наших опытах, активность каталазы, разлагающей Н202, существенно снижалась (в 3,3-9 раз) на 1, 2 и 3 сутки после заражения (Рис. 8). В немногочисленных исследованиях антиоксидантной системы при патогенезах насекомых супероксиддисмутазы рассматриваются как один из основных компонентов ферментативных антиоксидантов [Wang et al., 2001а; Лозинская и др., 2003]. Отмеченное нами увеличение активности СОД может свидетельствовать о накоплении О2", который является индуктором большинства радикальных окислительных процессов. СОД и каталаза преимущественно работают в комплексе, специализируясь на поэтапном восстановлении кислорода [Munday, Winterboume, 1989; Sies, 1991], поэтому мы предположили, что увеличение активности СОД приведет к наработке большего количества Нг02, а, следовательно, и к повышению активности каталазы, специализирующейся на инактивации этого вещества. Однако, в наших экспериментах активность каталазы оказалась достоверно (р 0,01) ниже контрольной в течении всего опыта (Рис.8). Сходные результаты были получены при изучении активности СОД и каталазы у личинок Lymantria dispar, питающихся на неблагоприятном для них растении [Peric-Mataruga et aL, 1997]. Авторы зафиксировали на фоне 1,5-2 кратного увеличения активности СОД снижение активности каталазы. Следует отметить, что в некоторых работах [Kono, Fridovich, 1982; Pritsos et al., 1988] зарегистрировано ингибирование каталазы супероксид анионом, который может накапливаться при нарушениях в процессах метаболической регуляции вследствие развития деструктивных процессов в кишечнике. Кроме того, в многочисленных исследованиях антиоксидантной системы животных обнаружено снижение активности этих ферментативных антиоксидavантов при
Роль БР в защите организма от окислительного стресса
Впервые ГО была описана Tenhunen et al. в 1968 г. как фермент, разлагающий гем эритроцитов и локализованный в селезенке. ГО катализирует первый и лимитирующий по скорости этап деградации гема, в результате образуются эквимолярные количества биливердина 1Ха, СО, и свободного железа. Было показано, что фермент индуцируется своим субстратом - гемом. В организме человека ГО представлена тремя изофер-ментами - индуцибельной ГОІ и двумя конституциональными формами -Г02 и ГОЗ. Все три фермента - продукты разных генов [Kutty et al., 1994; Xia et al., 2002]. Г02 была идентифицирована и описана в 1986 г. Maines et al. как неиндуцибельный фермент, локализованный в головном мозгу, эндотелии и тестикулах и имеющий активность приблизительно на поря док ниже, чем ГОІ. В отличие от ГОІ, Г02 активируется протеинкиназой С. ГОЗ, также неиндуцибельный фермент, был изолирован и охарактеризован McCoubrey et al., 1997. ГОЗ имеет такое же распределение в тканях организма, как и Г02, однако активность ее еще ниже. Свойства этой изоформы ГО изучены мало. Хотя сначала ГО не вызывала особого интереса у исследователей, но после того как выяснилось, что индуцибельная форма этого фермента является одним из стрессовых белков, количество посвященных ей исследований стало стремительно возрастать [см. напр., обзоры Tyrrell, 1997; Lane, 1998; Galbraith, 1999; Dong et al.,2000; Otterbein, Choi, 2000; Ryter, Tyrrell, 2000; Snyder, Baranano, 2001; Ryter et al., 2002; НШ-Kapturczak et al., 2002; Cornelussen, Knowlton, 2002; Zuckerbraun, Billiar, 2003]. Типичным индуктором ГОІ является гем, но продемонстрировано, что ее активность может усиливаться и рядом других стимулов - ультрафиолетовыми лучами, эндотоксином, тяжелыми металлами и пероксидом водорода [Keyse, Tyrrell, 1989; Camhi . et al., 1995; Maeshima et al., 1996]. Общей особенностью этих воздействий является их способность индуцировать свободнорадикальное окисление, что и привело исследователей к мысли о том, что ГО-1 может функционировать как цитопротекторная молекула.
Одним из механизмов реализации этих цитопротекторных функций, является генерация БР - мощного эндогенного антиоксиданта. Замечательна степень эволюционной сохранности ГО - фермент присутствует в тканях не только млекопитающих, но и беспозвоночных, а также в растениях и сине-зеленых водорослях, то есть, по всей видимости, является необходимым для аэробной жизни ферментом [Shibahara et al., 2002]. В настоящее время накопилось достаточно доказательств, что ГО играет ключевую роль в адаптивном ответе [см., например, обзор Tyrrell, 1997]. ГО экспрессируется в коже и глазах в ответ на ультрафиолетовый свет; в сердце в ответ на сердечно-сосудистые заболевания, в печени, легких и почках в ответ на бактериальные инфекции или токсины. Одним из ее замечательных свойств оказалась способность бороться не только с влияниями текущего стрессогенного фактора, но и защита организма от последующих стрессов любого вида. В таблице 2 суммированы данные о воздействиях, вызывающих экспрессию ГОІ (разумеется, не претендующие на полноту, так как количество публикаций непрерывно растет). Чрезвычайно красноречивы заголовки публикаций посвященных БРи ГО: «Гемоксигеназа - цвета антистрессовой защиты», «Семейство молекул с сомнительной репутацией помогает жертвам малярии, рака и болезней сердца», «Полезен ли Вам билирубин?», «Гемоксигеназа-1 - универ сальный воин», «Гемоксигеназа-1 - внутриклеточный Геркулес», «Тетра-пирролы - молекулы жизни», «Биливердинредуктаза - главный физиологический цитопротектор» «Молекула «скорой помощи»» и т.п. Как оказалось, два других продукта ГО также выполняют важные функции в жизнедеятельности организма.
Обнаружено, что оксид углерода играет значимую роль в нейротрансмиссии и регуляции тонуса сосудов, (осуществляющуюся, как и в случае с NO, через гуанилатциклазу), а железо - в индукции ферритина (см. вышеперечисленные обзоры). Существует мнение, что ГО является абсолютно необходимым компонентом для нормального метаболизма железа и регулирует его выход из клетки с 9+ помощью неидентифицированной пока Fe -АТФазы [Ferris et al., 1999; Snyder, Baranano, 2001]. И, хотя авторами не всегда разграничиваются роли разных продуктов ГО, по-видимому, основой цитопротекторное действие фермента в большинстве случаев можно отнести за счет антиокси-дантных свойств БР. Так, например, Ossola et al., 1997, 1998 продемонстрировали, что введение БР, полностью ингибирует как индукцию ГО, так и накопление продуктов ПОЛ при ультрафиолетовом облучении или воздействии сульфата меди. Вместе с тем, не стоит забывать, что все продукты гемоксигеназной реакции являются потенциально токсичными и в высоких концентрациях могут оказывать на организм повреждающее действие - оксид углерода может нарушать работу всех гемсодержащих молекул, железо - вызывать окислительный стресс, а БР - повреждение головного мозга. В связи с этим, ГО часто сравнивают с фармацевтической фабрикой, производящей препараты, которые являются лекарствами в адекватной дозировке и ядами - при превышении необходимых доз (рис.13). Названия многих работ, посвященных этой проблематике, также достаточно красноречивы: «Ге-моксигеназа-1: Инь и Янь», «Гемоксигеназа - защитный ген или Троянский конь», «Билирубин - проклятие и благо» и т.п. [Piatt, Nath, 1998; Dong et al., 2000; Ryter, Tyrrell, 2000; Dennery et al., 2003]. 2.3.2. Влияние билирубина на апоптоз и пролиферацию Влияние БР на пролиферацию, дифференцировку и гибель клеток во многом обусловлено его антиоксидантными свойствами. В последнее время обнаружено, что активные формы кислорода и продукты окисления липидов выступают в качестве посредников в сигнальных каскадах клетки.
В частности, продемонстрировано их участие в апоптозе (запрограммированной клеточной смерти) [Ren et al., 1998; Simon et al., 2000; Chandra et al., 2000]. Интенсивно изучается и роль антиоксидантов в регуляции этого процесса [Hentze et al., 2000; Ohyama et al., 2001; Owuor, Kong, et al., 2002]. Данные о влиянии БР жизненный цикл клетки пока еще весьма немногочисленны. Так, при повышеной экспрессии ГО в клетках выявлено возрастание их устойчивости к проапоптотическому действию ишемии-реперфузии. Снижение же активности ГО, напротив, сопровождалось пониженной резистентностью клеток к апоптозу при этом воздействии [С1а-vien et al., 2000; Zamora et al., 2002; Vulapalli et al., 2002; Katori et al., 2002; Hirai et al., 2003]. Показано также [Petrache et al., 2000; Kushida et al., 2002; Zampetaki et al., 2003], что ГО защищает клетки от апоптоза, индуциро
Влияние экспериментальной желтухи на интенсивность ПОЛ у подопытных животных
Повышение в крови уровня БР (гипербилирубинемия) наблюдается при поражениях печени, желчевыводящих путей и системы эритропоэза. Повышение общего содержания БР в сыворотке крови является лабораторным эквивалентом желтухи. Нормальный показатель общего содержания БР в крови -4-17 [ІМОЛЬ/Л, из них большая часть (3-17 цмоль/л) приходится на свободный пигмент [Блюгер, Новицкий 1984].
При всех видах желтухи гипербилирубинемия является результатом нарушения динамического равновесия между скоростью образования и выделения БР. Образовавшийся в результате распада гемоглобина свободный БР соединяется с альбумином и в таком виде транспортируется в печень. В эндоплазматическои сети гепатоцитов происходит соединение БР с глюкуроновой кислотой, что делает его растворимым в воде и обеспечивает переход его в желчь и далее - в кишечник.Желтушность кожи и видимых слизистых оболочек становится заметной тогда, когда уровень сывороточного БР достигает 50 цмоль/л и выше. Выделяют три типа желтух: надпеченочная, печеночная и подпече-ночная. Главное патогенетическое звено надпеченочной желтухи - повышение продукции желчного пигмента. Гиперпродукция БР в подавляющем большинстве случаев связана с повышенным распадом эритроцитов. Печень способна метаболизировать и выделять в желчь БР в количестве, в 3-4 раза превышающем его продукцию в физиологических условиях [Блюгер, Новицкий 1984]. Если резервная способность печени метаболизировать БР превышена, развивается надпеченочная желтуха. Этот вид желтухи наблюдается при гемолизе, синдроме Жильбера, Криглера Наджара, при рассасывании больших посттравматических гематом. Желтуха при этом - умеренная, сывороточный БР редко превышает 90 цмоль/л, неконъюгированный. В экспериментах на животных надпече-ночную желтуху часто моделируют путем инфузий раствора БР.
В основе печеночной желтухи лежит изолированное или комбинированное нарушение захвата, конъюгации и экскреции БР клетками печени, а также его регургитация. Этот вид желтухи встречается при острых хронических вирусных гепатитах, циррозах и токсических поражениях печени. В лабораторных условиях печеночную желтуху воспроизводят отравлением животных различными гепатотропными токсикантами, однако при этом на первый план выходят специфические проявления действия ядов. Адекватной модели острого вирусного гепатита на мелких лабораторных животных не существует, так как заболеванию подвержены только высшие приматы.При подпеченочной желтухи происходит нарушение выделения связанного БР через внепеченочные желчные протоки, а также его регур-гитация. Последняя происходит прежде всего на уровне внутрипеченоч-ных желчных протоков, а затем - и на уровне гепатоцитов. При развитии и прогрессировании желтухи уровень БР в сыворотке крови достигает 350-550 цмоль/л и выше, гипербилирубинемия обусловлена преимущественным подъемом содержания связанного пигмента. В лаборатории под-печеночную желтуху воспроизводят путем интоксикации а-нафтилизотиацианатом (обструкция на уровне внутрипеченочных желчных путей, характерная для холангитов или первичного били арного цирроза) или перевязки общего желчного протока (ситуация, характерная для механического препятствия желчетоку при желчнокаменной болезни или опухолях гепатопанкреадуоденальной области). В клинике наибольшие трудности возникают при дифференциальной диагностике печеночной и подпеченочной желтух, поскольку основные клинико-биохимические проявления каждой из них сводятся к симптомам холестаза. Между тем их разграничение чрезвычайно важно, так как подходы к лечению различны [Блюгер, Новицкий 1984; Виленский, 1987].
Несмотря на то, что в настоящее время антиоксидантные свойства БР известны широкому кругу исследователей-биологов и химиков, цито-протекторное действие БР при заболеваниях, сопровождаемых желтухой, до сих пор не изучено. По-видимому, это объясняется тем, что среди клиницистов по-прежнему доминирующим является мнение о токсичности билирубина, а гипербилирубинемию рассматривают исключительно как проявление патологии печени.
Простейшей моделью надпеченочной желтухи является введение БР подопытным животным. При этом увеличению содержания пигмента в организме носит преходящий кратковременный характер, т.к. избыток БР подвергается быстрому выведению с желчью после перевода в водорастворимую форму путем конъюгации с глюкуроновой кислотой в гепато-цитах.Эксперименты по изучению влияния введения БР на интенсивность ПОЛ в органах животных проводились под нашим руководством и совместно с А.Н. Цюпко [Дудник с соавт, 2001; Цюпко с соавт., 2001]. При внутрибрюшинном введении мышам БР в дозе, соответствующей желтухе средней степени в сердце у подопытных животных резко снижалось содержание продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и диенкетонов), соответственно в 2,8 и 1,6 раза через 15 мин и 3,1 и 2,5 раза через 30 мин эксперимента (рис. 23А) по сравнению с контрольными мышами. Количество обоих продуктов ПОЛ изменялось синхронно и к 1 ч после начала эксперимента достигало контроля. Такая динамика находится в полном соответствии с антиоксидантными свойствами БР и достаточно быстрым выведением его из организма.
Если рассматривать изменение абсолютных величин исследованных показателей (см. табл.4), то обращает на себя внимание резкое увеличение содержания продуктов ПОЛ, вызванное стрессом от инъекции у контрольных животных на ранних сроках эксперимента. Введение БР не только предотвращало стрессовые изменения, но и вызывало достоверное
Антиапоптотическое действие БР, обусловленное его влиянием на функционирование сигнальной системы сфингомие линового цикла
Для патологии печени характерны выраженные структурно-функциональные повреждения и гибель гепатоцитов, которая происходит посредством некроза или апоптоза (программируемой клеточной смерти) и наблюдается одновременно с повышением уровня БР в организме. Некроз - это неконтролируемый процесс, он характеризуется повреждением цитоплазматической сети, набуханием митохондрий, увеличением объема клеток, нарушением целостности плазматической мембраны и выходом наружу внутриклеточного содержимого с последующим воспалительным ответом. В клинике степень некротических повреждений обычно коррелирует с активностью в сыворотке крови больных активности ферментов, содержащихся в цитоплазме гепатоцитов - аланин- и аспарагинами-нотрансферазы (АлАТ и АсАТ) [Ziol et al., 2001]. Отличительным признаком апоптоза является, напротив, сжатие клетки, конденсация хроматина в ядре, межнуклеосомная деградация ДНК и образование мембранных пузырьков с заключенным внутри них содержимым клеток (апоптотических телец). Важная особенность апоптоза - отсутствие воспалительного ответа, поскольку при нем не происходит высвобождения внутриклеточного содержимого. Термин «апоптоз» был введен Kerr et al., 1972 для описания повреждения клеток при ишемии печени. Интересно, что формирование так называемого коугаляционного некроза или ацидофильных телец Мал-лори и Каунсильмена (одного из этапов апоптотического процесса) было описано за десятилетия до того, как в гепатологию было введено понятие «апоптоз». Апоптоз и некроз могут происходить параллельно, а большое количество апоптотических клеток - приводить к вторичному некрозу [Kanzler, Galle, 2000].
Многочисленные литературные данные указывают на тесную взаимосвязь между физиологическим состоянием клетки и уровнем окислительных процессов в ней [Ryter, Tyrrell, 1998; Chisolm, Chai, 2000; Hensley et al., 2000]. Окислительный стресс способен индуцировать гибель клеток по механизму апоптоза, чрезмерная неконтролируемая интенсификация реакций ПОЛ вызывает некроз [Buttke, Sandstrom, 1994; Simon et al., 2000; Cucuianu, 2001]. Антиоксиданты, например, N-ацетилцистеин, ионол, ко-энзим Q, подавляют апоптоз [Kamata, Hirata, 1999; Voehringer, 1999; Chandra et al., 2000]. Возрастание количества продуктов ПОЛ может являться не только причиной, но и следствием разрушения или повреждения клеток [Buttke, Sandstrom, 1994; Rosser, Gores, 1995].
Генератором участвующих в регуляции апоптоза вторичных посредников липидной природы является сфингомиелиновый цикл [Schutze et al., 1991; Hannun,, 1996; Levade, et al., 1999]. Сигнальная система сфин-гомиелинового цикла взаимодействует с другими сигнальными системами [Hannun, 1996; Mathias et al., 1998; Garcia-Ruiz et al., 1998; Алесенко, 1998, 1999; Hannun et al., 2001], включая такие, как система генерации активных форм кислорода (в том числе и NO) [Escargueil-Blanc et al., 1998; Takeda et al., 1999; Andrieu-Abadie et al., 2001; Yamada et al., 2001]. Это взаимодействие может приводить к усилению действия на клетки тех повреждающих факторов, основным звеном цитотоксического действия которых является окислительный стресс.образованием фосфохолина и церамида, который в свою очередь при участии церамидазы превращается в сфингозин (рис.32). СФМаза обнаружена практически во всех клетках, но наибольшее количество ее содержится в клетках мозга (в миелине) [Spence, 1993]. Впервые фосфолипаза С со специфической активностью по отношению к сфингомиелину была описана Gatt, 1975. В современной литературе известно восемь типов сфин-гомиелиназ, которые отличаются внутриклеточной локализацией, оптимумом рН, зависимостью от катионов и ролью в клеточной регуляции [Liu et al., 1998; Levade, Jaffrezou, 1999; Goni, Alonso, 2002]. Продукты гидролиза сфингомиелина СФМазой и церамида церамидазой - церамид и сфингозин, могут имитировать клеточные эффекты цитокинов, лшгополи-сахарида и других биологически активных соединений в дифференциров-ке, апоптозе или остановке клеточного цикла. В процессах пролиферации и апоптозе наиболее значимыми являются две изоформы фермента - кислая СФМаза и Мд2+-зависимая нейтральная СФМаза. Кислая форма фермента находится в лизосомах, а нейтральная СФМаза локализована в плазматической мембране [Levade, Jaffrezou, 1999].
Нейтральная СФМаза является мембраносвязанным и Mg2+, Мп +-зависимым ферментом [Bartolf, Franson, 1986]. Ядра клеток также содержат нейтральную сфингомиелиназу [Алесенко, 1998]. На ее активность оказывают действие димети л сульфоксид, летучие анестетики, фосфоли-пиды [Liu et ah, 1998; Bernardo et al., 2000]. Из фосфолипидов наибольшим активирующим действием обладает фосфатидилсерин [Tamiya-Koizumi, Kojima, 1986; Hostetler KJ., Yazaki P.J., 1979] несколько меньшим — фосфатидная кислота и фосфатидилинозит. Фосфатидилэтанола-мин оказывает слабое активирующее действие, а фосфатидилхолин вообще не влияет на активность нейтральной СФМазы [Tamiya-Koizumi, Kojima, 1986]. Ионы ртути, сульфидгирильные соединения являются сильными ингибиторами нейтральной СФМазы [Bartolf, Franson, 1986].
На клеточных культурах, в экспериментах in vitro показано, что окислительный стресс, вызванный как непосредственно прооксидантньь ми агентами (УФ-облучением, перекисью водорода), так и опосредованными воздействиями (цитокинами, липополисахаридом, ишемией-реперфузией) вызывает активацию сфингомиелинового цикла. Механизм этой активации до сих пор не изучен полностью, однако в настоящее время в литературе появились многочисленные сведения о зависимости активности основного фермента сфингомиелинового цикла - СФМазы - от уровня окислительных процессов в клетке, (табл.10).трации GSH - одного из основных компонентов антипероксидной защиты - практически полностью ингибируют активность СФМазы. Работы, демонстрирующие влияние GSH на активность СФМазы, были выполнены на клеточных культурах или на частично очищенных ферментах. Показано, что ингибирующий эффект проявляют как восстановленная, так и окисленная формы глутатиона [Liu, Hannun, 1997; Liu, Andrieu-Abadie, et al., 1998; Liu et al., 1998; Hannun et al., 2001], причем экспериментально обнаружено, что данным эффектом обладает у-глутамил-составляющая GSH. То есть ингибирующее действие GSH на СФМазу, по-видимому, непосредственно не связано с его антиоксидантными свойствами. Инги-бирование фермента GSH является обратимым и не приводит к каким-либо необратимым изменениям в СФМазе. Обработка клеток ингибиторами синтеза GSH сопровождается усиленным гидролизом сфингомиели-на и продукцией церамидов [Liu, Hannun, 1997; Liu et al., 1998; Yoshimura etal., 1999].
Следует отметить, что прямое ингибирующее действие GSH на фермент рядом авторов подвергается сомнению [Bernardo et al., 2000; Tomiuk et al., 2000; Martin et al., 2001]. Относительно влияния других ан-тиоксидантов на активность фермента в литературе существуют весьма противоречивые данные. Так, при индукции апоптоза в клетках, лишенных сыворотки, показано одновременное ингибирование ПОЛ, нейтральной СФМазы и апоптоза добавлением аскорбата, токоферола или коэнзи-ма Q [Lopez-Lluch,1999; Navas et al., 2002]. Показано при этом, что инги-бирующей активностью обладает как окисленная, так и восстановленная форма CoQIO, но фенольная форма активнее, чем хинонная [Martin et al., 2002]. Продемонстрировано, что синтетический антиоксидант ионол и СОД предотвращают апоптоз, вызванный активацией СФМазы окисленными липопротеидами низкой плотности [Harada-Shiba et al., 1998]. SH
