Введение к работе
Актуальность темы
Исследование механизмов сворачивания полипептидных цепей в нативную структуру, остается одной из фундаментальных проблем физико-химической биологии.
Существует большое число теорий фолдинга белков: теория каркасной модели (Kim P.S. et al. 1990), теория гидрофобного коллапса (Dill К.А. et al. 1990), теория нуклеации-конденсации (Ferst A.R. et al. 1997) и другие. Все эти предложения основаны на том, что информации, содержащейся в аминокислотной последовательности вполне достаточно для формирования нативных структур белков (Anfinsen СВ.). Вместе с этим в настоящее время, большинство исследователей направляют свои силы в основном на изучение укладки уже сформированных вторичных образований в нативные структуры пептидов и белков. При этом, нет четкого видения необходимости исследования механизма начальной стадии организации регулярной структуры полипептидньгх цепей. Считается, что вторичные структуры формируются путем минимизации энергии полипептидов из определенных аминокислотных последовательностей. Как следствие, в настоящее время различные методики предсказьгеашія функциональных, нативных структур белков и пептидов надежно работают, примерно на 50 - 60%, что, конечно же, является не вполне удовлетворительным результатом. С помощью таких методик довольно сложно моделировать функциональные свойства биомолекул (в том числе и лекарственных препаратов) с «нужными» для исследователей характеристиками.
На наш взгляд изучение механизма фолдинга белков необходимо начинать с истоков зарождения регулярной структуры. А именно, с аминокислотной последовательности и того, как именно олигопептидная цепь начинает приобретать сперва вторичную, а затем и третичную структуры.
Выявление факторов способствующих зарождению «нативности» в пептидах одна из основных задач в данной области. Такие исследования остаются до сих пор актуальными для правильного понимания процессов самоорганизации структуры природных полипептидов. Успешное решение этого вопроса тормозится в некоторой степени как наличием большого разнообразия самих аминокислот, так и встречаемым значительным количеством видов самих вторичных структур.
Ключевым моментов в многолетней истории структурных исследований полипептидов явилось сформулированные Л.Полингом с соавторами в 1951 году ряда постулатов строения вторичных структур белков (Pauling L. el al. 1951), которыми пользуются и поныне. В частности - постулатов о строго плоском и жестком строении пептидной группы, а также о неизменности валентных углов и длин связей аминокислотных остатков при вращениях вокруг одиночных связей. Согласно представлениям молекулярной биофизики полагалось, что различные вторичные структуры образуются, в основном, за счет вариации торсионных ір, у и ш-углов пептидного остова (рис.1).
Рис. 1. Дипептид аланина. Стрелками указаны двугранные углы tp, \j/ и со, отвечающие за формирование вторичных структур пептидов и белков.
При этом, постулирование плоского строения пептидной группы позволяет существенно упростить теоретический анализ белков, поскольку вместо изучения поведения трех углов ф, у и ш, в моделировании фактически можно было использовать вариации только двух торсионных углов - ф и у, а угол со приравнивать либо 0, либо 180. Обосновывается это тем, что барьер вращения вокруг полуторной связи пептидной группы ОС - NH составляет, согласно оценкам, примерно 18 Ккал/моль, что практически невозможно реализовать с точки зрения термодинамики связей в такого типа соединениях (см., например, Финкильштейн А.В., Птицин О.Б. 2002). Так, что каждому аминокислотному остатку теперь можно было сопоставить пару торсионных углов ф и \|i при С-атоме на графике поверхности потенциальной энергии. При этом считалось, что в структуре белков могут наблюдаться только значения углов ф и V|/, обеспечивающие наименьшее отталкивание между боковыми группами аминокислот в полипептиде.
Возникающие «разрешенные» и «запрещенные» зоны значений торсионных углов позволяли таким образом выделять аминокислоты, исходно тяготеющие к образованию тех или иных типов вторичных структур: а-спиральных, р-слоистых или Р-петлевых. Были исследованы моно-, ди- и трипептиды всех встречающихся в природе 20 L-аминокислот (Ramachandran G.N. et al. 1966, Шайтан K.B. 1997 - 2002). Были построенны конформационные карты (рис. 2), так называемые карты Рамачандрана этих структур
Рис. 2. .Карта Рамачандрана углов ф и м/
вторичных структур пептидов.
aR и aL - области параметров правых и левых а-спиралей;
(It) - область р-слоя с параллельными и
(t|) - антипараллельными цепями;
(II) - область полиглицина;
(С) - область коллагена;
pi и рП - координаты Р-изгибов полипептидов
(Brant D.A. J.Mol.Biol. 23, 47-65,1967).
<р, градусы
Выполненные таким образом работы дали многим исследователям основание полагать, что дальнейшее детальное изучение структурообразования вторичных форм олигопептидов не является столь актуальным, по сравнению с важностью исследования механизма фолдинга белков в целом на базе уже сформировавшихся вторичных форм.
Вместе с тем, с развитием современных методов исследования строения молекул появились новые экспериментальные данные, указывающие на необходимость уточнения или пересмотра устоявшихся представлений, исходных постулатов по организации структуры пептидных образований.
Тезис о плоском строении -лавного элемента полипептидных цепочек -пептидного фрагмента 0=C'-NH, как раз остался нетронутым.
Имеющиеся экспериментальные данные указывают на некоторые неточности в оценке этого постулата при моделировании полипептидов:
во-первых - наблюдаетя широкое колоколообразное, а не узкое распределение углов со наряду с существованием большого количества гош-конформеров пептидных групп, согласно структурным базам белков (MacArthur M.W.,Thornton J.M. 1996;
Carugo О. 2003). На наш взгляд этот факт скорее можно объяснить не столько возможностью поворота вокруг С—N связи на некоторый угол со, как многие полагают, сколько выгодностью наклона всей плоскости NHCa на угол р, относительно остова пептидной группы. Потери в энергии при этом, как показывают микроволновые данные, не превышают значения 1 ккал/моль;
во-вторых - наблюдаемые различные радиусы кривизны экспериментальной и теоретически полученных a-спиралей у олигопептидов (Zagrovic В et al. 2005). У теоретической а-спирали радиус кривизны оказывается больше, из-за использования в модельных построениях именно постулата жесткого плоского строения пептидной группы;
в-третьих - наблюдаемое систематическое и довольно большое, порядка 10-15, отклонение от прямой линии геометрии строения C=0"H-N водородного связывания пептидных групп, при исходной планарной модели строения этих фрагментов в структуре белков. Другими словами, жесткая пептидная группа не позволяет атому водорода связи N-H гибко подстроиться под энергетически более выгодную структуру водородной связи (Alan G.Walton 1981).
Наконец, поскольку сам фоддинг олигопептидов происходит в реальной клеточной среде, то естественно нельзя оставлять без внимания оценку влияния хотя бы ближайшего гидратного окружения на пептидные группы и в целом на механизм организации вторичных структур.
Все это дает нам основание заключить: - для корректного исследования механизмов фолдинга белков, важно не только исходное знание величин двугранных углов ф и у различных областей вторичных структур на карте Рамачандрана, но и более глубокое понимание лимитирующих физических факторов в организации канонической конформации конкретных монопептидов, в регуляризации пространственных форм олигопептидных цепочек.
Поэтому дальнейшее всестороннее исследование механизма инициирования вторичных структур олигопептидов, на базе учета специфических особенностей электронного строения как модельных, так и природных пептидов, с привлечением адекватных квантово-химических подходов, представляется крайне важными, носит приоритетный характер и тем самым определяет актуальность данной темы диссертации. Цель и задачи работы
Основная цель работы заключалась в обосновании ключевой роли торсионной лабильности пептидной группы и нековалентных взаимодействий боковых радикалов аминокислот в организации вторичной структуры олигопептида.
Поскольку гидратация является важнейшим элементом, обуславливающим стурктурно-динамическую организацию пептидов и белков в клетке, то в работе теоретически была проведена оценка роли водного окружения в оптимизации структуры пептидной группы и стабилизации спиральных и слоистых форм олигопептидов
Для достижения сформулированных целей вырабатывался, прежде всего, единый квантово-химический подход в непротиворечивом описании информационных, спектроскопических и термодинамических особенностей как простейших модельных пептидных молекул, так и более сложных комплексов аминокислотных последовательностей с учетом влияния слабых нековалентных внутри- и межмолекулярньгх взаимодействий.
Для решения поставленных проблем были сформулированны следующие задачи:
исследование торсионной лабильность пептидной группы в структуре
простейших молекул амидов (формамиде, ацетамиде, трансметилацетамиде и
других амидов);
о анализ полиморфизма непланарности пептидной группы в структуре моно- и дипептидов природных L-аминокислот;
исследование влияния непланарности пептидной группы на локализацию
«разрешенных» областей значений двугранных углов ф- и у- молекулярного
остова моно- и дипептидов;
оценка роли нековалентяых взаимодействий аминокислотных боковых групп в организации предпочтительных вторичных структур олигопептидов;
исследование пирамидализации валентных связей пептидной группы в области атома азота в структуре гидратированных молекул амидов;
анализ влияния водного окружения на термодинамическую стабильность а-спиральных и р-слоистых форм олигопептидов.
Конкретное личное участие соискателя в получении результатов, изложенных в диссертации.
Все необходимые теоретические расчеты были проведены Самченко А.А. самостоятельно. Были выполненны выбор и обоснование использования методов квантовой химии: РМЗ-метода (программного пакета МОРАС) и ab initio методов (программный пакет GAUSSIAN) для адекватного воспроизведения экспериментальных структурных данных простейших молекул аминов и амидов, природных L-аминокислот, моно-, ди- и олигопептидов. Проведена интерпретация результатов, подготовка публикаций и докладов по теме диссертационной работы. Научная новизна работы
В работе впервые дано обоснование существования полиморфизма непланарного строения пептидной группы в белковых молекулах. До настоящего момента пептидная группа всегда считалась жестким плоским молекулярным образованием.
Рассмотрена нетривиальная роль невалентньгх взаимодействий аминокислотных остатков друг с другоми и с пептидными группами в организации структуры олигопептидов. Показано, что возможность образования внутримолекулярных нековалентных связей выступает важнейшим инициирующим фактором направленной дифференцировки моно- и дипептидов к организации определенных форм их вторичной структуры.
Впервые было выявленно, что водное окружение при определенных условиях увеличивает неплоский характер пептидной группы, облегчая формирование остовом олигопептида наиболее термодинамически устойчивых структур и, тем самым, усиливая нековалентные внутримолекулярные обменные взаимодействия аминокислотных остатков в моно- и дипептидах. Научная и практическая значимость работы
Полученные результаты имеют как фундаментальное значение - для понимания биофизических механизмов ранних стадий сворачивания белков и пептидов - так и прикладное, поскольку могут быть успешно использованы в биоинженерии при рациональном дизайне новых биомакромолекул с заданной пространственной структурой. Апробация работы и публикации
Результаты работы были представлены на Международной конференции «Математика.Компьютер.Образование», (Пущино, Дубна 2007 - 2011), Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука
XXI века», (Пущино, 2006 г., 2010 г.), XIII Симпозиуме по межмолекулярным взаимодействиям и конформациям молекул, (19 -23 июня, 2006, Санкт-Петербург), III Российском симпозиуме «Белки и-пептиды», (16 - 21 сентября, 2007, Пущино), XIV Симпозиуме по межмолекулярным взаимодействиям и конформациям молекул, (15 -21 июня, 2008, Челябинск), II Международной конференции «Моделирование нелинейных процессов и систем» (Москва, МГТУ «СТАНКИН», 6-Ю июня 2011 г).
Результаты работы опубликованны в 24 печатных работах, в том числе 9 статьях в отечественных и зарубежных периодических изданиях.
Структура и объем работы
