Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 7
1.1 Модели и подходы, используемые при изучении процесса сворачивания белков 9
1.2 Конформационные состояния белков 14
1.3 Характеристика объекта исследования 23
ГЛАВА 2. Материалы и методы 27
2.1 Методы, применяемые в работе 27
2.2 Материалы, применяемые в работе 33
2.3 Приборы, параметры и условия измерений 34
2.4 Экспериментальные процедуры 35
2. 5 Расчет термодинамических параметров 38
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 43
3.1 Экспрессия генов мутантных форм апомиоглобина. Выделение и очистка белков 43
3.2 Построение и анализ диаграмм термодинамических состояний апомиоглобина 46
3.3 Исследование влияния точечных мутаций на стабильность нативного и промежуточного состояний при равновесном разворачивании мочевиной 64
3.4 Исследование влияния фосфолипидной мембраны на стабильность апомиоглобина кашалота 72
Выводы 81
Список литературы 82
- Конформационные состояния белков
- Материалы, применяемые в работе
- Расчет термодинамических параметров
- Построение и анализ диаграмм термодинамических состояний апомиоглобина
Введение к работе
Согласно современным представлениям для большинства белков характерно сворачивание не по принципу «все-или-ничего», при котором накапливаются лишь нативное (N) и развёрнутое (U) состояния, а сворачивание через образование промежуточных (I) состояний, которые проявляются в тех или иных условиях. В присутствии высоких концентраций сильных денатурантов (таких, как гуанидингидрохлорид или мочевина) белки чаще всего представляют собой практически полностью развернутые (клубкообразные) полипептидные цепи. Более мягкие денатурирующие условия (низкие рН или высокие концентрации некоторых солей) приводят только к частично денатурированным конформационным состояниям белковой молекулы [Ptitsyn, 1995; Bychkova and Ptitsyn 1993]. Физико-химические свойства таких состояний являются промежуточными между свойствами нативных и полностью развернутых белков. Образование таких промежуточных состояний является важным этапом на пути сворачивания белков. Кроме того, с образования таких состояний может начинаться агрегация белка и/или образование им амилоидных структур [Booth et al., 1997; Sharma et al 2010 ]. Можно сказать, что промежуточные состояния являются критическими в сети конформационных состояний белка, и поэтому их всестороннее изучение особенно важно.
Апомиоглобин кашалота является белком, для которого такое состояние наблюдается [Eliezer et al., 1998; Barrick and Baldwin, 1993]. Свойства этого белка достаточно хорошо изучены [Harrison and Blout, 1965; Griko and Privalov, 1994; Eliezer and Wright, 1996; Garcia et al., 2000; Cavagnero et ah, 2001; Bertagna and Barrick, 2004]. На пути его сворачивания выделяют нативное, развёрнутое и стабильное промежуточное состояния. Накопление низкотемпературного промежуточного состояния апомиоглобина было показано при разворачивании белка мочевиной или понижением рН. Имеются также косвенные данные, что при температурной денатурации белка тоже накапливается некое промежуточное состояние [Griko et al., 1988; Griko and Privalov, 1994]. По данным литературы эти состояния обладают несколько различными свойствами. Однако до сих пор не решен вопрос: насколько сильны различия между формами промежуточного состояния, накапливающимися при различных способах денатурации, и являются ли эти формы вариантами одного и того же термодинамического состояния или нет? Для ответа на этот вопрос необходимо определить область условий, где промежуточное состояние стабильно, и проследить изменение его свойств в переходе от одной формы к другой. Другими словами, необходимо построить диаграмму термодинамических состояний апомиоглобина и выяснить, является ли область промежуточного состояния непрерывной. Построение такой фазовой диаграммы целесообразно в координатах «рН - концентрация мочевины -температура», так как изменение этих условий по отдельности наиболее значимо и часто используется для исследования сворачивания белков. Для апомиоглобина такой диаграммы до настоящего времени построено не было. В литературе опубликовано много работ [Hughson et al., 1991; Barrick and Baldwin, 1993; Jennings and Wright, 1993; Eliezer et al., 1998; Jamin and Baldwin, 1998], посвященных исследованию структуры промежуточного состояния апомиоглобина. Однако вопрос о том, насколько сильны взаимодействия, удерживающие это состояние, до сих пор остаётся открытым. Для решения этого вопроса во второй части работы проведено исследование вклада ряда аминокислотных остатков в стабильность промежуточного и нативного состояний. Для этого, основываясь на равновесной денатурации мочевиной 12-ти мутантных форм апомиоглобина, были вычислены значения Ф-параметра для промежуточного состояния, характеризующего вклад боковых групп в стабильность этого состояния. Проведённый анализ показал относительную слабость взаимодействий боковых групп в промежуточном состоянии. Ранее такой анализ был проведён только для нестабильного переходного состояния на вершине энергетического барьера в переходе N-I, определяющего скорость сворачивания белка [Baryshnikova et al., 2005; Барышникова, 2005].
Переход белка в промежуточное состояние может вызывать и такой неклассический денатурирующий агент как фосфолипидная мембрана. Ранее в нашей лаборатории было показано [Басова и др., 2004], что свойства таких состояний сходны со свойствами промежуточного состояния, наблюдаемого при денатурации мочевиной или понижением рН. Кроме того, в литературе описана возможность инициации роста амилоидных структур на поверхности мембран []. Поэтому исследование взаимодействия глобулярного немембранного белка с фосфолипидной мембраной может помочь в понимании как процесса его сворачивания, так и процесса его амилоидной агрегации. Изучение влияния мембран на белки важно и с точки зрения медицины как важный компонент пищеварения и доставки лекарств в клетки [Уголев, 1967; Strollet al., 2000; Lennernas, 2007; Wawrezinieck et al., 2008]. В соответствии с этим исследование деталей процесса взаимодействия глобулярного водорастворимого белка с мембраной представляется достаточно интересным и необходимым. Согласно результатам, полученным нами в ходе этой работы, фосфолипидная мембрана стабилизирует промежуточное состояние белка, то есть может выступать как денатурирующий агент для его нативного состояния и как структурирующий для его развёрнутой формы. Взаимодействие апомиоглобина с мембраной происходит как минимум в две стадии, и скорость первой из них падает с увеличением стабильности нативной формы белка.
Конформационные состояния белков
Нативным называется состояние белка, структура и активность которого совпадают с таковыми в живой клетке. Особым случаем здесь являются белки, сконструированные de novo, либо мутантные формы природных белков. Для них показателем нативности (точнее свёрнутости) является наличие пика теплопоглощения при исследовании их тепловой денатурации методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. Нативное состояние является наиболее изученным состоянием белков. Это является следствием его высокой стабильности, упорядоченности и функциональной важности. Проблема заключается в том, что большинство современных методов видят совокупность свойств многих молекул в изучаемом образце. Поэтому, чем однороднее популяция молекул и чем меньше их динамика, тем однозначнее будет полученный результат. Именно поэтому столь популярен в настоящее время рентгеноструктурный анализ. Нативная структура белка определяет его функцию. Как правило, белки, обладающие строгой специфичностью, имеют и жёсткую стабильную нативную структуру [Финкелыптейн и Птицын, 2002]. Однако некоторые белки, особенно в организмах эукариот, в изолированном виде очень динамичны, мало структурированы и приобретают жёсткую структуру только при взаимодействии с лигандом (чаще всего ДНК или РНК), при этом их структура может отличаться при взаимодействии с различными лигандами [Dyson and Wright, 2005]. С точки зрения термодинамики стабильность нативного состояния белка по отношению к развёрнутому невелика и редко больше Юккал/моль при оптимальных значениях рН и температуры [Oxender and Fox, 1987].
Однако, эта небольшая стабильность является суммой больших по модулю, но действующих в противоположных направлениях энтропийной и энтальпиной составляющих, которые взаимно компенсируют друг друга. При изменении условий можно наблюдать значительные изменения в этих составляющих в отдельности, но изменение суммарной стабильности может быть малое [Финкелыптейн и Птицын, 2002]. Было показано, что при добавлении в раствор таких денатурантов, как мочевина или гуанидингидрохлорид, стабильность нативного состояния падает линейно с увеличением концентрации денатуранта [Tanford, 1968]. При изменении температуры зависимость стабильности имеет вид [Griko et al., 1988]: свободных энергий между состояниями, Т — абсолютная температура, AHt и Tt — энтальпия и температура середины перехода при тепловой денатурации соответственно, АСР — разница теплоёмкости нативного и денатурированного состояний. На графике эта зависимость имеет куполообразную форму и принимает нулевые значения в двух точках: холодовой- и тепловой денатурации. Для многих белков холодовая денатурация достигается при температурах ниже 0С, и в эксперименте она трудно достижима. Максимум стабильности большинства белков приходится на температуры около нуля и комнатные. При нагревании белок претерпевает переход первого рода, т. е. плавится по принципу «всё-или-ничего», целиком или отдельными кооперативными единицами - термодинамическими доменами, которые часто совпадают с доменами структурными.
Зависимость стабильности нативного состояния от рН для разных белков имеет различный вид. Это связано с различиями в структуре белков, в распределении заряженных групп по белку. Кроме того, разные группы могут иметь разную константу ионизации в нативном и в развёрнутом состояниях, что тоже может сказываться на стабильности белка. На противоположном краю пути сворачивания находится самое динамичное и наименее структурированное состояние белка - развёрнутое. Тэнфорд в 1968 году показал [Tanford, 1968], что в присутствии высоких концентраций сильных денатурантов (таких, как гуанидингидрохлорид или мочевина) большинство белков представляют собой полностью развернутые (клубкообразные) полипептидные цепи. В теории это состояние описывается
Материалы, применяемые в работе
Для экспрессии генов апомиоглобина и его мутантных форм использовали штамм Е.соН BL21(DE3). Бактерии культивировали на среде LB (на 1 л.: триптон - 10 г., дрожжевой экстракт - 5 г., NaCl - 10 г., 10 мМ NaOH- 100 мкл). В процессе извлечения телец включения из клеток Е.соН использовался лизисный буфер, содержащий 50мМ Трис, 1мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), 20мМ р-меркаптоэтанол, рН 7.5, который добавляли в количестве 10 мл на 1г клеток, а также лизоцим - 10мг на 1 г клеток. При выделении белков из телец включения обработкой ультразвуком использовали буфер: 0.1% TFA (трифторуксусной кислоты) в воде, ЮмМ DTT (дитиотрейтола), 1 ОмМ ЭДТА, а при очистке буфер для обратнофазной хроматографии: 10%-ацетонитрил, 0.1%FA. Все реактивы для равновесных исследований были марки «ОСЧ» и использовались без дополнительной очистки. Все растворы готовились на бидистиллированной, деионизованной воде. В качестве буфера, где белок находится в нативном состоянии, использовали раствор ЮмМ NaAc рН 6.2. В экспериментах по сворачиванию и разворачиванию апомиоглобина и его мутантных форм денатурирующим агентом являлась мочевина. В работе использовали сверхчистую мочевину фирмы "ICN". Концентрацию мочевины определяли по коэффициенту преломления на длине волны 589 нм с помощью рефрактометра ИРФ-454Б (Россия). Для равновесного разворачивания понижением рН готовился раствор белка в ЮмМ Na-ацетатном буфере при рН 6.2. Аликвоты стокового раствора подкислялись до необходимого значения рН 1М соляной кислотой. Растворы перед использованием фильтровались при помощи фильтров Corning (Германия), с диаметром пор 0.20 мкм. Для приготовления малых бислойных фосфолипидных везикул использовали два типа фосфолипидов: отрицательно заряженный POPG - 1 пальмитоил-2-олеилфосфатидилглицерин и нейтральный РОРС 1 пальмитоил-2-олеилфосфатидилхолин ("Avanti Polar Lipids, Inc.", США). Малые бислойные везикулы получали путем выпаривания раствора фосфолипидов в хлороформе с последующей гидратацией пленки в водном буфере, используя ультразвуковое облучение.
В качестве буферной системы использовали ЮмМ NaAc с рН 6.2. Размеры везикул, получаемых таким методом, были оценены ранее методами динамического светорассеяния и макроскопической свободной диффузии, которые дали сходные значения диаметра везикул в пределах 250-400 А. В качестве буферной системы был использован ЮмМ раствор NaAc. Необходимое значение рН в буферных и белковых растворах достигалось добавлением соответствующего количества 1М СН3СООН или ЮМ NaOH. Значения рН измерялись с помощью цифровых рН-метров: Thermo Orion 720 (США) и Элит-3305 (Россия). Спектры поглощения регистрировали с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-1601 (Япония). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по поглощению на длине волны 281 нм. Коэффициент экстинкции был принят равным А1с\мг/мл = 0.8 для апомиоглобина дикого типа и для всех его мутантных форм, кроме белка с заменой TrpHAla, для которого А1смімг/мл = 0.56. Коэффициенты экстинкции для апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм были определены в лаборатории физики белка, Института белка РАН, микрометодом по азоту [Jaenicke, 1974]. Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре Shimadzu RF-5301PC (Япония). Использовали стандартные кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см. Длина волны возбуждающего света была выбрана 293 нм, где триптофановые аминокислотные остатки вносят основной вклад в спектр флуоресценции. Регистрация спектров испускания триптофановой флуоресценции проводилась в интервале 300-500 нм. Рабочая концентрация белка составляла 0.03 мг/мл. Спектры кругового дихроизма (КД) измеряли на спектрополяриметре JASCO-600 (Япония). Для измерений КД в дальней ультрафиолетовой (УФ) области использовали кюветы с длиной оптического пути 0.01 см. Молярная эллиптичность [0] вычислялась по формуле [0]х.=0ь-МВО / 1 с, где х - измеряемая величина эллиптичности (в миллиградусах) на длине волны X; МВО - средний молекулярный вес остатка, вычисленный из аминокислотной последовательности; 1 - длина оптического пути (длина кюветы в миллиметрах); с - концентрация белка в мг/мл.
Рабочая концентрация белка составляла 1 мг/мл. Для проведения экспериментов по равновесному разворачиванию структуры белка мочевиной, растворы белка готовились в буфере без мочевины и в буфере с концентрацией мочевины 8 М (0.03 мг/мл для измерения флуоресценции и 1 мг/мл для измерения КД). Для получения конечных концентраций мочевины от 0.0 М до 8.0 М приготовленные исходные растворы смешивались в различных пропорциях. Для установления равновесия между разными конформационными состояниями белка полученные растворы выдерживались не менее часа, после чего проводились измерения.
Расчет термодинамических параметров
Расчет термодинамических параметров из равновесного эксперимента. Для отдельных переходов при денатурации путем понижения рН расчет термодинамических параметров проводили, используя метод линейной экстраполяции, предложенный ранее [Расе, 1986]. Разность свободных энергий (AG) нативного и развернутого состояний при разворачивании белка можно рассчитать по формуле: где /и - доля белка в развернутом (или денатурированном) состоянии при определенной концентрации денатуранта, a /N - доля белка в нативной (или свернутой) конформации, которые рассчитывались по формулам: где fN и /и - доли нативного и денатурированного состояний, соответственно; AN и Аи — значения молярной эллиптичности (или интенсивности флуоресценции) для нативного и развернутого состояния, соответственно; А - значение молярной эллиптичности (или интенсивности флуоресценции) при данной концентрации денатуранта. Значения AN и Аи были взяты из экстраполяции базовых линий для соответствующих состояний в область перехода. Величина AG белка линейным образом зависит от концентрации денатуранта [Jeffrey, 1995; Santoro andBolen, 1998]. где AG - экстраполированное к нулевой концентрации денатуранта значение свободной энергии белка в воде, D - молярная концентрация денатуранта, m - наклон линейной зависимости, который отражает степень экспонированности аминокислотных остатков на растворитель. Кривые равновесного разворачивания, в которых нельзя выделить переходы между отдельными состояниями, анализировались с применением модели двухстадийного разворачивания описанной в литературе [Tanford, 1968, Расе, 1986].
Для этого базовые линии нативного и развёрнутого состояния линейно экстраполировались в область перехода. Кривая разворачивания аппроксимировалась с применением формул, основанных на модели трёх состояний N -»I - U: где A — экспериментально наблюдаемая интенсивность флуоресценции или эллиптичность; А;, /,-, и AGt — интенсивность флуоресценции (или эллиптичность), доля и стабильность состояния / при данной концентрации денатуранта, соответственно; AG-X и mt — стабильность состояния і в отсутствие денатуранта и наклон зависимости стабильности белка от концентрации денатуранта; Аі и Ь{ — интенсивность флуоресценции (или эллиптичность) в отсутствие денатуранта и наклон базовой линии состояния /; Т - абсолютная температура; R - универсальная газовая постоянная. Термодинамические параметры переходов из нативного в промежуточное состояние и из промежуточного в развернутое состояние рассчитывались как из данных по КД, так и из данных по триптофановой флуоресценции с использованием формул для модели трех состояний. Для уменьшения погрешностей используется процедура совместной аппроксимации. Суть этой процедуры состоит в одновременной аппроксимации нескольких денатурационных кривых, полученных с использованием как триптофановой флуоресценции, так и метода КД. В результате мы получаем единые термодинамические параметры, описывающие все эти переходы. Для применения этой процедуры были построены денатурационные кривые на 10 длинах волн по флуоресценции и 10 длинах волн по КД. В ходе аппроксимации для каждой из 20 денатурационных кривых подгонялись собственные базовые линии нативного, промежуточного и развёрнутого состояний. Параметры, отражающие середины переходов и их ширину, подгонялись общими для всех кривых. Аппроксимация проводилась в программе IGORpro при помощи стандартной процедуры global fit. Зависимости стабильности структуры белка от температуры по данным литературы [Privalov and Potekhin, 1986; Griko et al., 1988] имеют вид: свободных энергий между разными состояниями, Т - абсолютная температура, AHt и Tt - энтальпия и температура середины перехода тепловой денатурации, соответственно, АСР - разница теплоёмкости нативного и денатурированного состояний.
Параметры AHt, Tt и АСР в нашем приближении не зависят от температуры, и поэтому мы можем переписать эту формулу в более простом виде: где AG — разность свободных энергий между состояниями; Т - абсолютная ЛТТ температура; С; = AHt - АСр Tt; С2 = L + АСр (1 + ln(Tt)); С3 = АСр. t Такое упрощение позволило нам снизить количество подгоняемых параметров при аппроксимации при сохранении общего вида зависимости стабильности от температуры. Учитывая, что нами принята линейная зависимость стабильности от концентрации денатуранта, и комбинируя формулы (15) и (4), можно для расчёта свободной энергии в зависимости от температуры и концентрации денатуранта использовать выражение:
Построение и анализ диаграмм термодинамических состояний апомиоглобина
Надосадочную жидкость наносили на обратнофазную колонку HPLC с носителем Cig. Элюцию проводили в градиенте ацетонитрила от 10% до 100%. Общее содержание белка определялось спектрофотометрически по поглощению на длине волны 281 нм. Фракции анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в градиентном ПААГ 9-25% (рис. 6). Фракции, содержащие белок достаточной чистоты, собирались и лиофильно высушивались. Из 2 литров культуры получали 5-7 г клеток, из которых, в свою очередь, получали 70-130 мг чистого белка. Рисунок 4. Промыв клеток после лизиса. 1, 2 и 3 слоты - 1-й, 2-й и 3-й промывы, соответственно, 4 - маркер мол. массы апомиоглобина. Рисунок. 5. Обработка ультразвуком. 1- маркер мол. массы апомиоглобина, 2, 3, 4, 5 - после 10, 20, 30 и 40 минут обработки, соответственно. Рисунок 6. Профиль элюции HPLC хроматографии на обратнофазной колонке. Первый слот - маркер мол. массы апомиоглобина. Рисунок 7. Оценка чистоты лиофильно высушенных белков. й.,- J 3.2 Построение и анализ диаграмм термодинамических состояний апомиоглобина Для определения границ фазовых областей нативного, промежуточного и развёрнутого состояний проводилось равновесное разворачивание белка различными денатурантами: рН, температура и мочевина. Такого рода эксперименты были проведены в различных условиях. Примеры экспериментально полученных денатурационных кривых приведены на рисунках 8-12. За изменением вторичной структуры белка при изменении рН раствора следили по изменению молярной эллиптичности на длине волны 222нм. Наличие перегиба в районе рН 4.0 свидетельствует о накоплении в этой области рН промежуточного состояния (рис. 8). При умеренных температурах и значениях рН около 4.2 наблюдается стопроцентное накопление промежуточного состояния, что проявляется в наличие перегиба для белка дикого типа или плато для мутантных белков. Поэтому возможно анализировать переходы между состояниями как по отдельности, применяя модель двух состояний для каждого перехода, так и применяя модель трёх состояний для аппроксимации всей кривой. Оба подхода дают сходный результат. Перед построением диаграммы необходимо ответить на ряд важных вопросов. На первом месте стоит вопрос обратимости процессов, происходящих с белком при проведении эксперимента. На втором месте стоит вопрос правомерности применения выбранной модели сворачивания белка. Обратимость денатурации при разворачивании апомиоглобина мочевиной и низким рН была описана ранее. Обратимость при тепловой денатурации апомиоглобина заслуживает отдельного рассмотрения. В условиях нашего эксперимента наиболее критичным фактором, способным повлиять на результат, является агрегация белка при повышенных температурах. Чтобы избежать его влияния, концентрация белка была достаточно низкой (0.03 мг/мл), а растворы перед экспериментом центрифугировались и фильтровались.
Обратимость была проверена при различных значениях рН и концентрации мочевины. Результат приведён на рисунках 13-15. На основании полученных данных можно сделать вывод об обратимости тепловой денатурации как минимум до прохождения белком точки середины перехода. Холодовая денатурация в условиях нашего эксперимента является полностью обратимой. Таким образом, мы можем построить диаграмму термодинамических состояний, исследуя сворачивание/разворачивание апомиоглобина и считая эксперименты равновесными. 1.8 Такая модель часто применяется при исследовании апомиоглобина кашалота. Чтобы убедиться в её применимости к нашим условиям, было проведено несколько экспериментов. В первую очередь необходимо выяснить, являются ли изменения параметров триптофановой флуоресценции и кругового дихроизма симбатными при разворачивании белка или нет. Несовпадение переходов, получаемых разными методами, свидетельствовало бы о присутствии дополнительных промежуточных состояний. Сравнение переходов было проведено при помощи процедуры глобальной аппроксимации. Суть этой процедуры состоит в одновременной аппроксимации большого количества денатурационных кривых. При этом для каждого перехода подбираются индивидуальные базовые линии, а значения положения середин переходов и их ширины являются общими. Такой процедуре были подвергнуты денатурационные кривые на 10 длинах волн, полученные с использованием триптофановой флуоресценции, и денатурационные кривые на 10 длинах волн, полученные с использованием метода КД. Такой анализ был применён экспериментальных точек от рассчитанных линий не наблюдалось, так же как и расхождения кривых. Это подтверждает правильность выбранной модели.
