Введение к работе
Актуальность проблемы.
Меланома, высоко агрессивное неопластическое заболевание, поддается лечению на начальных стадиях. По мере прогрессии заболевания эффективность лечения снижается. На стадии метастазирования меланома характеризуется высокой лекарственной устойчивостью и высокой летальностью. Ведущее место среди терапевтических процедур, применяемых при меланоме, занимает цитотоксическая химиотерапия. Монофункциональные алкилирующие агенты дакарбазин, прокарбазин а также нитрозомочевины, кармустин и ломустин, входят в состав стандартного протокола лечения меланомы. Однако частота положительного ответа больных в случае терапии только дакарбазином или комбинацией дакарбазина с кармустином и ломустином не превышает 20%. Две исследовательские стратегии направлены на преодоление низкой эффективности химиотерапии: разработка новых терапевтических подходов и поиск маркеров, позволяющих прогнозировать индивидуальную устойчивость/чувствительность больных к химиотерапии.
Наиболее часто используемыми показателями для прогноза меланомы кожи являются максимальный вертикальный размер опухоли, глубина инвазии и наличие или отсутствие изъязвлений.
Однако до сих пор отсутствуют неинвазивные маркеры, позволяющие с приемлемой вероятностью прогнозировать индивидуальный терапевтический ответ, хотя потребность в них высока.
Актуальным является исследование новых маркеров прогноза заболевания, основанных на изучении механизмов устойчивости клеток к химиотерапии. Таковыми являются эффективность удаления повреждений ДНК и связанная с ней способность к предотвращению апоптоза.
С большим основанием предполагается, что толерантность опухоли к химиотерапии связана с дефектами в одном из механизмов репарации ДНК -коррекции неспаренных оснований (mismatch repair, MMR). Это предположение было подтверждено экспериментально в работах, выполненных на культивируемых клетках, полноценных и дефицитных по MMR. Совокупность полученных данных позволила сделать вывод о том, что вторичные разрывы ДНК в пролиферирующих клетках в ответ на действие метилирующего агента формируются в результате функционирования механизма MMR. В таком случае эти «отсроченные» вторичные разрывы могут быть показателем активности системы MMR. Это позволяет предположить, что вторичные разрывы, индуцированные в геноме стимулированных лимфоцитов, могут быть биофизическим маркером как самого заболевания (ассоциированного с дефицитом MMR), так и эффективности терапии.
Часто из-за невозможности получения образцов ткани опухоли лимфоциты крови больных представляются удобным и репрезентативным объектом исследований с целью прогноза развития заболевания и клинического ответа на химиотерапию.
В настоящей работе проводилось изучение эффективности MMR в сочетании с другими показателями, такими как активность экспизионной репарации оснований (BER), экспрессия проапоптотического рецептора FasR и ключевых белков системы MMR, MLH1 и MSH2, в лимфоцитах крови больных меланомой в ходе одного цикла химиотерапии. Протокол химиотерапии включает ломустин, дакарбазин, цисплатин, ингарон (ЛДЦИ-протокол). Клинический ответ больных сопоставляли с полученными значениями маркеров лимфоцитов и оценивали степень корреляции между ними.
Цель работы.
Оценить значение некоторых молекулярно-клеточных маркеров лимфоцитов крови больных диссеминированной меланомой кожи (эффективности репарации ДНК, уровней экспрессии белков MLH1, MSH2, FasR и гибели лимфоцитов) в прогнозе индивидуальной чувствительности к химиотерапии.
Задачи исследования.
- Определить типы повреждений ДНК в лимфоцитах в результате 1-го
цикла химиотерапии (XT).
- Изучить эффективность механизмов репарации ядерной ДНК в лимфоцитах
крови больных меланомой.
- Сравнить показатели ответа лимфоцитов на химиотерапию и тест-
воздействие метилнитрозомочевины (МНМ).
Определить зависимость между скоростью удаления однонитевых (single-stranded, ss) разрывов ДНК в лимфоцитах после химиотерапии и эффективностью системы экспизионной репарации оснований (BER).
Определить связь между скоростью накопления двунитевых (ds) разрывов ДНК в лимфоцитах после химиотерапии и эффективностью системы MMR.
Оценить возможность использования повреждения ДНК, эффективности репарации (BER и MMR) как прогностических показателей химиотерапии больных диссеминированной меланомой.
Оценить возможность использования экспрессии белков MLH1, MSH2, FasR и гибели лимфоцитов как прогностических показателей химиотерапии больных меланомой кожи.
Научная новизна.
- Показано, что межиндивидуальные вариации эффективности BER не
влияют на цитотоксический ответ лимфоцитов и клинический ответ больных
на химиотерапию.
- Показано, что повреждения однонитевой ДНК вносят незначительный
вклад в цитотоксический эффект химиотерапии.
Разработан метод оценки эффективности пострепликативного механизма MMR в лимфоцитах с помощью BrUdR-меченых сІзДНК-комет.
Показана корреляция количества индуцированных вторичных ds-разрывов ДНК в ФГА-стимулированных лимфоцитах больных с эффективностью MMR в них.
Впервые показана достоверная корреляция между количеством вторичных ds-разрывов ДНК, индуцированных химиотерапией в лимфоцитах больных, и клиническим ответом этих больных на химиотерапию.
Впервые обнаружена достоверная корреляция между ответом лимфоцитов больных меланомой на химиотерапию и на тест-воздействие метилнитрозомочевиной in vitro, что делает возможным определение неинвазивных маркеров, прогнозирующих клинический ответ до начала химиотерапии.
Научно-практическая значимость.
Установлено, что функциональная эффективность системы MMR и связанное ней накопление dsДHK разрывов являются прогностическими маркерами клинического ответа опухоли и могут быть использованы в качестве дополнительного фактора прогноза с учетом клинико-гистологических параметров. Применение данного критерия в клинической практике позволяет стратифицировать больных с учетом потенциального развития заболевания и может использоваться для назначения адъювантной терапии.
Положения, выносимые на защиту.
- Разработаны методы оценки эффективности в лимфоцитах больных меланомой дорепликативного механизма BER и пострепликативного механизма MMR.
Межиндивидуальные вариации эффективности BER не влияют на питотоксический ответ лимфоцитов и клинический ответ больных на химиотерапию. Вместе с тем, не исключается антиапоптотическое влияние BER, снижающее эффективность химиотерапии.
Уровень вторичной деградации dsДHK в лимфоцитах пациентов, подвергнутых химиотерапии, является независимым прогностическим маркером ЛДЦИ-протокола химиотерапии. Этот показатель включает в себя как эффективность MMR, так и частично эффективность механизма экспизионной репарации нуклеотидов (NER).
Апробация результатов.
Основные результаты работы были представлены на:
7-ом Международном симпозиуме по таргетнои противоопухолевой терапии (7th International Symposium on Targeted Anticancer Therapies, Amsterdam, The Netherlands, March 23-25, 2009),
8-ой Международной конференции «Биохимическая физика», Москва, 11-13 ноября, 2008,
8-ой Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21-22 апреля 2009,
10-ой международной летней школе по биофизике (10-th International Summer School on Biophysics "Supramolecular Structure and Function", Sept. 19 - Oct.01, Rovinj, Croatia, 2009),
9-ой Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Н.Новгород, 21 мая 2010,
III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010», Москва, 21-25 июня 2010,
10-ой Международной конференции «Биохимическая физика», Москва, 8-10 ноября, 2010.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Объем и структура диссертации
Похожие диссертации на Молекулярно-клеточные маркеры лимфоцитов больных меланомой как прогностический показатель клинического ответа на химиотерапию
