Содержание к диссертации
Введение
Глава 1
1. Обзор литературы 13
1.1 Эпидемиология, заболеваемость, смертность при КРР 13
1.2 Наследственная предрасположенность к возникновению КРР 16
1.3 Патогенез рака ободочной и прямой кишки 17
1.4 Традиционные методы лечения рака ободочной и прямой кишки 20
1.4.1 Хирургическое лечение 20
1.4.2 Лучевое лечение 21
1.4.3 Химиотерапевтическое лечение 22
1.5 История химиотерапии рака ободочной и прямой кишки 22
1.6 Молекулярно-генетические исследования для определения предиктивных маркеров чувствительности к цитостатикам 29
1.7 Применение иммуногистохимического анализа для определения прогностических факторов 32
1.8 Интерпретация результатов молекулярно-генетического и иммуногистохимического исследований опухолевой ткани 34
1.9 Опыт проведения индивидуализированной химиотерапии на основе предиктивных маркеров к цитостатической терапии 41
Глава 2 50
2.1 Материалы и методы 50
2.2 Панель молекулярно-генетических маркеров 62
2.3 Индивидуализация химиотерапии в зависимости от молекулярно-генетического профиля опухолевой ткани 63
2.4 Статистическая обработка результатов 64
2.5 Характеристика пациентов контрольной и исследуемой групп 65
2.6 Оценка эффективности проводимого лечения 66
Глава 3 68
3.1 Результаты собственных исследований 68
3.1.1 Клинические факторы, определяющие прогноз течения опухолевого процесса 68
3.1.1.1 Оценка «естественной истории» опухолевого процесса у пациентов дКРР, не получавших XT 69
3.1.1.2 Течение опухолевого процесса у пациентов получавших лечение 5-ФУ с модификаторами биологического ответа 74
3.1.1.3 Течение опухолевого процесса у пациентов получавших лечение 5-ФУ с оксалиплатином или иринотеканом 78
3.2 Изучение гетерогенности молекулярно-генетического статуса у пациентов дКРР 82
Глава 4 87
4.1 Оценка эффективности эмпирической и индивидуализированной, на основе предиктивных маркеров, противоопухолевой терапии 87
4.1.1 Сравнительная характеристика двух- и трехкомпонентных схем лекарственной терапии больных с дКРР в зависимости от молекулярно генетических характеристик опухоли 89
4.2 Эффективность лечения отдельными противоопухолевыми препаратами в зависимости от молекулярно-генетических предиктивных маркеров 98
4.2.1 Включение митомицина в схемы полихимиотерапии для лечения пациентов с дКРР в зависимости от экспрессии СОХ-2 в опухолевой ткани 98
4.2.2 Молекулярно-генетический профиль опухолевой ткани и назначение капецитабина 104
4.2.3 Молекулярно-генетический профиль опухолевой ткани и назначение оксалиплатина 105
4.3 Гиперэкспрессия 5-ти опухолевых маркеров и ответ на стандартные схемы химиотерапии 109
4.4 Изменчивость Егсс-1 опухолевой ткани на фоне проведенного химиотерапевтического лечения 114
Обсуждение 116
Выводы 127
Практические рекомендации 129
Список работ, опубликованных по теме диссертации 129
Список литературы
- Традиционные методы лечения рака ободочной и прямой кишки
- Индивидуализация химиотерапии в зависимости от молекулярно-генетического профиля опухолевой ткани
- Течение опухолевого процесса у пациентов получавших лечение 5-ФУ с модификаторами биологического ответа
- Молекулярно-генетический профиль опухолевой ткани и назначение капецитабина
Традиционные методы лечения рака ободочной и прямой кишки
Принципы хирургического лечения не изменились за много лет и состоят в удалении опухоли с проксимальным и дистальным запасом неизмененной кишки для элиминации подслизистого лимфатического распространения опухолевых клеток, удалении регионарных брыжеечных лимфатических узлов, визуальном интраоперационном стадировании болезни. По современным данным, резектабельность рака ободочной кишки составляет 70 - 80 %, послеоперационная летальность достигает 5%. Результаты хирургической операции при колоректальном раке в первую очередь зависят от вовлечения в опухолевый процесс лимфатических узлов и стадийности по Dukes. При негативных лимфатических узлах и Dukes А- пятилетняя выживаемость достигает 90%. При отсутствии метастазов в лимфатических узлах, но опухоль прорастает в мышечный слой Dukes В-пятилетняя выживаемость составляет 80%. Если во время операции были удалены пораженные раковой опухолью лимфатические узлы, пятилетняя выживаемость различается в зависимости от степени инвазии опухоли в стенку кишки: 74% при Dukes А, 48% при Dukes В, 30% при Dukes С. [Cohen А. М., Shank В., Friedman М. А. 1989].
Лучевая терапия у больных раком ободочной и прямой кишки не относится к основным видам первичного лечения. Предпринимаются экспериментальные попытки снизить частоту местных рецидивов с помощью интраоперационного и послеоперационного облучения больных в случае прорастания опухоли в окружающие ткани и органы, при неуверенности хирурга в радикальности вмешательства.
В настоящее время лучевая терапия рекомендуется при колоректальном раке с симптоматической и паллиативной целью. Она проводится на гамма-терапевтических аппаратах или линейных ускорителях с граничной энергией квантов 5 МэВ, средними фракциями 3 Гр до 30 - 35 Гр суммарно через прямоугольные поля РИП - 75-100 см.
Основным методом лечения больных с диссеминированным раком ободочной и прямой кишки является химиотерапия. Данный метод лечения сохраняет чрезвычайную актуальность на сегодняшний день в связи с неуклонным ростом заболеваемости этой патологией. Растет выявление распространенных форм колоректального рака, как в России, так и во всем мире. Применение стандартных режимов химиотерапии позволило увеличить медиану выживаемости до 20 месяцев [Гарин A.M. 2005 год]. Введение в клиническую практику применения моноклональных антител (бевацезумаб, цетуксимаб, панитумумаб) позволило в сочетании с химиотерапией увеличить общую выживаемость больных дКРР до 24 месяцев [Гарин А. М. 2005; Adamo V. et. al. 2007]. Несмотря на указанные достижения, статистические данные свидетельствуют о том, что пятилетняя выживаемость пациентом с дКРР остаются на прежнем уровне от 0 до 10% [Мерабишвили В.М. 2006].
Однако данные факторы не всегда учитываются при проведении лекарственного лечения больных [Чубенко В.А., Моисеенко В.М.]. Таким образом, очевидно, что для увеличения показателей выживаемости больных необходим пересмотр общепринятой стратегии лечения диссеминированных солидных новообразований. Это означает использование цитостатиков не на основе максимально переносимых доз с регрессом опухоли в качестве основного критерия эффективности, а в ином режиме. Например, увеличение плотности дозы препарата в единицу времени, за счет уменьшения интервалов между последовательными циклами химиотерапии, при поддержке колониестимулирующих факторов (dose-dense терапия); метрономная терапия; последовательное назначение химиопрепаратов в максимально переносимых дозах с последующей метрономной терапией в сочетании с ингибиторами сигнальной трансдукции и ангиогенеза ("chemo-switch" режим); назначение лекарственных препаратов с учетом кинетики опухолевого роста; попытки воздействия на стволовые клетки опухоли. При этих методиках в качестве критерия эффективности лечения должна выступать общая выживаемость, а не объективный ответ опухоли на терапию. Несомненно, что достижение полного регресса новообразования увеличивает продолжительность жизни больных. Однако, даже при назначении самой современной терапии, частота полного регресса опухоли не превышает 10% [De Vita V.T. et al, 2008]. Частичный регресс заболевания в основном способствует улучшению качества жизни пациентов. При этом вследствие репопуляции опухоли, показатели общей выживаемости практически не изменяются. Предполагая, что продолжительность жизни зависит от времени достижения летального или «критического» объема опухоли, основным критерием эффективности лечения является длительная стабилизация процесса [Чубенко В. А.,2008].
Индивидуализация химиотерапии в зависимости от молекулярно-генетического профиля опухолевой ткани
Гистологические срезы опухоли подвергались микродиссекции. Полученные таким способом срезы толщиной 10-15 мкм депарафинизировались с помощью 2-кратной обработки ксилолом при комнатной температуре. Затем фрагменты ткани регидратировались с помощью последовательной промывки в 96% этаноле, затем в 85% и 75% растворах этанола - по 10 минут в каждом. После удаления этанола в пробирку добавляли 180 мкл лизирующего буфера: ІхТЕ (Юммоль Tris-НС1 (рН=8,0), 0,1 ммоль ЭДТА; рН=8,0), 2% натрия додецилсульфат и 20 мкл протеиназы К (20 мг/мл). Пробирки подвергались инкубированию при t=60C в течение 16 часов до полного растворения ткани. К полученным таким образом лизатам добавляли однократный объем кислого сатурированного фенола и 0,3 объема хлороформа. Проводилось встряхивание пробирки в течение 10 минут при комнатной температуре, пробы подвергались центрифугированию при 15000 g в течение 15 минут при температуре ротора 0-2С (Centrifuge 5415 R, Eppendorf). Центрифугирования заканчивалось отбором суперфазы в новые эппендорфы и добавлением 0,3 объема хлороформа с последующим интенсивным перемешиванием и центрифугированием, аналогично описанному выше. К осторожно отобранной верхней фазе прибавляли 0,1 объема ЗМ ацетата натрия (рН=4,0), 1 мкл раствора гликогена (20мг/мл) в качестве ко-осадителя и 1 объем охлажденного до -20С изопропанола. После перемешивания растворов пробы оставлялись не менее чем на 3 часа при - 20 С. Преципитат РНК осаждали центрифугированием пробы при 15000 g в течение 30 минут при температуре ротора 0-2С. После центрифугирования на дне пробирок образуется небольшое количество белого осадка. После удаления изопропанола промывали осадок в 500 мкл 70% этанола в течение 10 минут при комнатной температуре. Осторожно эвакуировала этанол. После подсушивания в термостате при 40С осадок растворяли в 25 мкл стерильной воды при 60С в течение 10 минут. Раствор РНК хранили при - 20С до использования в реакции обратной транскрипции. 2) Получение кДНК в реакции обратной транскрипции
Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 20 мкл. К образцу РНК объемом 5 мкл добавляли 1 мкл случайных гексануклеотидов (10 ое/мл), инкубировали при +70С в течение 10 минут, после чего пробы срочно охлаждали на льду. К смеси РНК и гексапраймеров прибавляли 14 мкл реакционной смеси: буфер для обратной транскрипции - до однократного, MuMLV («Сибэнзим», Россия) - 200 единиц, dNTP - 250 мкМ. Реакцию обратной транскрипции проводили в течение 1 часа при температуре 38С, после чего инактивировали ревертазу нагреванием образца до 90С в течение 10 минут. Полученную кДНК до использования хранили при температуре -20С. 3) Изучение уровня экспрессии мРНК генов TS, ТР и DPD с помощью количественной ПНР в реальном времени.
Оценка уровня экспрессии генов в образцах ДНК проводилась на основании построения относительной стандартной кривой количества копий таргетного гена по соотношению с реферным геном (SDHA -GenBank: NM004168) в мультиплексной полуколичественной ПЦР, в реальном времени, с использованием флюоресцентно меченых зондов, специфичных к выбранным для амплификации участкам кДНК. Анализ результатов проводили с использованием метода калибровочной кривой. Праймеры для ПНР были подобраны таким образом, чтоб исключить получение амплификата с геномной ДНК, присутствующей в пробе кДНК. Образцы РНК без обратной транскрипции резервировались как отрицательный контроль в ПЦР. Реакцию проводили на приборе iCycleriQReal- Time PCR Detection System (Bio-RadLaboratories, USA) в объеме 25 мкл, каждый образец в протоколе дублировался. В составе реакционной смеси был 1-кратный ПЦР-буфер с содержанием MgCl(2) 2,5 мМ, 125 мкМ dNTP, от 200 нМ каждого праймера и 500 нМ каждого из флюоресцентно меченых зондов, 1 ед. термоактивируемой Taq-полимеразы «Thermostar» («Синтол», Россия). Реакцию начинали с инкубирования проб при 95С в течение 10 минут для активации полимеразы, затем следовали 45 циклов: 95С - 15 сек., 60С - 45 сек. 4) Методика исследования уровня экспрессии генов DPD, TS, ТР, СОХ-2, Егсс-1, соматических мутаций гена k-RAS, MSI, полиморфизма гена MTHFR, полиморфизма гена UGT1A1 в аденокарциномах толстой кишки:
Материалом для исследования соматических мутаций гена K-ras, МСН, полиморфизм гена MTHFR, полиморфизм гена UGT1A1 в аденокарциномах толстой кишки служили образцы парафиновых блоков с опухолевой тканью.
Анализ ПЦР- продуктов проводили с помощью электрофореза в 1,5-2% агарозном геле с использованием однократного трис-ацетатного (ТАЕ) буфера после окрашивания гелей бромистым этидием. SSCP-анализ амплифицированного экзона 1 гена K-ras (157 п.о. и 200 п.о.) проводили безизотопным методом (Амосенко Ф.А. и соавт., 1997). Сиквенс амплифицированного фрагмента гена k-RAS (200 п.о.), содержащего аномалии, выявленные в ходе SSCP-анализа или рестрикционного анализа, проводили с помощью автоматического секвенатора фирмы "Applied BioSystems", модель 377, используя систему «Big Dyeerminators». Для оценки достоверности полученных результатов использовали общепринятые методы вариационной статистики (Айала Ф., 1984).
Геномную ДНК из образцов опухолевых тканей выделяли с помощью Ha6opa«QIAamp Blood and Tissue Kit» фирмы «QIAGEN» no соответствующим протоколам. Для оценки достоверности полученных результатов использовали общепринятые методы вариационной статистики.
В соответствии с задачами исследования, в проспективной части исследования пациенты с дКРР были разделены на 4 группы:
1) Группа пациентов с установленным фактом прогрессирования опухолевого процесса на фоне химиотерапии, которая была назначена эмпирическим путем в соответствии с международными рекомендациями. В этой группе предиктивные маркеры к цитостатической терапии были определены ретроспективно.
2) Группа пациентов, которым предиктивные маркеры цитостатической терапии были определены до начала химиотерапевтического лечения. Лекарственная терапия назначена с учетом индивидуализированного подбора на основе предиктивных маркеров.
3) У пациентов (п=29), после проведения эффективного химиотерапевтического лечения стало возможным выполнение полной и частичной циторедуктивнои операции и дополнительно выполнены морфологические исследования удаленной опухоли и/или метастатического очага для определения степени лечебного патоморфоза. Лечебный патоморфоз оценивали по степени повреждения опухолевой ткани цитостатиком: от малозначимых повреждений (1 степень лечебного патоморфоза), до полного отсутствия опухолевых клеток в исследуемой ткани (4 степень лечебного патоморфоза).
Течение опухолевого процесса у пациентов получавших лечение 5-ФУ с модификаторами биологического ответа
Сравнительная характеристика двух- и трехкомпонентных схем лекарственной терапии больных с дКРР в зависимости от молекулярно-генетических характеристик опухоли
Из общей когорты пациентов были выделены две группы. В первой группе находились больные, в опухолевой ткани которых все изучаемые предиктивные маркеры находились в низкой экспрессии, отсутствие мутации в гене k-RAS. Во второй группе находились пациенты, у которых в молекулярно-генетическом статусе зафиксирована гиперэкспрессия от 1 до 3-х предиктивных маркеров из изучаемой панели. В каждой группе пациенты получали лечебную химиотерапию либо по схеме de Gramont(2-x компонентная схема), либо с включением оксалиплатина или иринотекана FOLFOX/FOLFIRI( 3-х компонентная схема). Результаты лечения пациентов в обеих группах представлены в таблице 15 и на рисунке 7.
Ретроспективно оценено, что объективный ответ в случае назначения режима de Gramont зарегистрирован у 100 % пациентов при следующем молекулярно-генетическом профиле опухоли: TS (-), ТР (-) , DPD (-), C0X-2(-),Ercc-l(-),k-RAS - дикий тип (данное сочетание встречается у 13% пациентов). Результаты лечения пациентов с аналогичным молекулярно-генетическим портретом опухоли, в схему лечения которых был введен 3 компонент (оксалиплатин, иринотекан), оказались сопоставимыми с 2-компонентным режимом (de Gramont)-объективный ответ зарегистрирован у 100%. Таким образом, может быть сделан вывод, что 13% пациентов от общей популяции может быть назначен режим deGramont, как стандарт первой линии ПХТ, без использования в схеме лекарственного лечения оксалиплатина или иринотекана, с той же эффективностью лечения, но с вероятным преимуществом по токсичности и стоимости XT.
Отмечено, что назначение 5-фФУ с лейковорином в рамках режима de Gramont при наличии высокой экспрессии от одного до трех изучаемых молекулярно-генетических маркеров, делает такую схему лечения неэффективной (прогрессирование зарегистрировано у 80% пациентов) и нецелесообразной для назначения. Согласно полученным данным у пациентов с гиперэкспрессией от 1 до 3-х маркеров, эффективность лечения достоверно возрастает с введением в схему ПХТ 3 компонента (оксалиплатина или иринотекана), что приводит к увеличению частоты объективных ответов с 0% до 65,3% (р 0, 001).
Обратилась для лечения в СПб ГБУЗ ГКОД в апреле 2009 года. Проживает в городе Сочи, в детстве болела простудными заболеваниями, перенесла ветряную оспу. Профессиональных вредностей не имела. При оценке соматического статуса зарегистрирована гипертоническая болезнь 2 степени, атеросклеротический кардиосклероз. Других хронических заболеваний не выявлено.При поступлении на лечение в Городской клинический онкологический диспансер у пациентки: Диагноз: Рак сигмовидной кишки (состояние после обструктивной резекции сигмовидной кишки от 02.03.09 года) - pT4NlM0. Прогрессирование заболевания: мтс печени 27.04.09 года
Гистологическое исследование: Умеренно дифференцированная аденокарцинома сигмовидной кишки. Анамнез заболевания: с февраля 2009 года отмечала нарастающую склонность к запорам, умеренные боли в животе. В начале марта 2009 года госпитализирована в районную больницу с клиникой острой толстокишечной непроходимости, вызванной раком сигмовидной кишки. Выполнено оперативное лечение в объеме обструктивной резекции сигмовидной кишки. В конце апреля пациентка самостоятельно обратилась в ГКОД для определения дальнейшей тактики лечения.
Результаты клинико-диагностического обследования. При обследовании было выявлено прогрессирование заболевания: одиночный мтс в правой доле печени, диаметром 85мм. Назначено молекулярно-генетическое исследование, иммуногистохимическое исследование первичной опухоли.
Молекулярно-генетический профиль опухолевой ткани и назначение капецитабина
Пациентка О. 67 лет родилась в Ленинграде. В детстве перенесла обычные детские инфекции, в течение жизни часто болела простудными заболеваниями, в 2002 году перенесла непроникающий острый инфаркт миокарда. Профессиональных вредностей не имела.Из хронических заболеваний зафиксирована ишемическая болезнь сердца, постинфарктный кардиосклероз, гипертоническая болезнь 3 степени. В сентябре 2008 года оперирована в центре колопроктологии по поводу рака прямой кишки pT4NlMl, мтс печени. Выполнено комбинированное хирургическое лечение в объеме передней резекции прямой кишки, атипичной резекции печени. Через 3 недели после операции пациентка начала получать 1 линию ПХТ по схеме FOLFOX. При первом контрольном обследовании выявлено прогрессирование заболевания: рецидив в культе прямой кишки, мтс печени. Выполнено повторное хирургическое лечение в объеме брюшно-промежностной экстирпации прямой кишки. Далее назначена 2 линия XT - кселода в монорежиме. При первом контрольном обследовании выявлено прогрессирование заболевания: мтс печени, легких. Смена линии химиотерапии: митомицин + de Gramont. При контрольном обследовании выявлено прогрессирование заболевания: мтс печени, легких, мтс в паховые лимфоузлы.
Пациентка поступает для продолжения лечения в ГКОД в апреле 2009 года с результатами молекулярно-генетического исследования опухоли (табл.26).
При интерпретации результатов исследования сделан вывод, что опухоль нечувствительна к препаратом фторпиримидинового ряда, резистентна к препаратам платины, имеет агрессивный пролиферативный потенциал.
Назначена 4 линия ПХТ по схеме: митомицин 6 мг/м в 1-ый и 29-ый день, иринотекан по 140 мг/м в 1-ый, 15-ый и 29-ый день.
После проведения 2-х циклов химиотерапии зафиксирована стабилизация опухолевого процесса: мтс печени без динамики, незначительный регресс мтс легких, выраженный регресс мтс в паховых лимфоузлах (справа на 31%, слева на 32%). Из осложнений проводимого лечения регистрировалась слабость 2-3 степени, тумор-лизинг синдром, проявляющийся в виде фибриллитета, лейкоцитоза, повышения уровня С-реативного белка, Д-димеров крови, фибриногена. После проведения4 циклов ПХТ сохраняется тенденция к уменьшению мтс в легких, регресс в паховых лимфатических узлах на 65%, стабилизация опухолевого процесса в печени.
С сентября 2009 года пациентка перестала получать ПХТ т.к. сказывалось накопление токсического действия химиопрепаратов: слабость, астения, находилась под динамическим наблюдением. Стабилизация процесса продолжалась 4 месяца, в дальнейшем пациентка погибла от острой сердечно-сосудистой недостаточности на фоне повторного острого инфаркта миокарда.
В нашем исследовании динамически наблюдались пациенты, у которых, после проведения эффективной химиотерапии 1 линии, регистрировалось прогрессирование заболевания. Для подбора эффективной химиотерапии 2 линии были выполнены повторные молекулярно-генетические исследования опухолевых или метастатических очагов. Использовался операционный материал после циторедуктивных операций, либо выполнялась биопсия метастатического очага. Особое внимание мы уделяли изменчивости статуса Егсс-1. Самостоятельно - факт гиперэкспрессии Егсс-1 расценивается как неблагоприятный, потому что несет ответственность за устойчивость к лекарственному лечению. Поэтому, для нас было важным определить его изменчивость на фоне эффективного лекарственного лечения. Результаты представлены в табл. 114
При анализе Ercc-статуса опухоли до лечения (1 линия XT) и при повторной биопсии после завершения лекарственного лечения у всех 7 исследованных пациентов зарегистрировано изменение экспрессии данного показателя, что свидетельствует об изменчивости молекулярно-генетического статуса опухоли на фоне эффективной ПХТ и необходимости проведения повторной биопсии для планирования 2 линии лечения.
Также следует отметить, что у одного пациента произошло изменение статуса по k-RAS, у двух пациентов после проведения химиотерапии изменился статус маркеров фторпиримидинового ряда. Все эти изменения свидетельствуют в пользу того, что опухоль гетерогенна, после проведения эффективной линии XT опухоль видоизменяется, приобретает другие пути опухолевой трансдукции.
Таким образом, нами был сделан вывод о том, что при выявлении прогрессирования заболевания после проведения эффективной первой линии XT нецелесообразно руководствоваться изначальным молекулярно-генетическим портретом опухоли для индивидуализированного подбора 2 линии XT и целесообразно выполнять повторное молекулярно-генетическое исследование после получения нового биопсийного материала из опухолевой ткани.
