Введение к работе
Актуальность проблемы
Основная функция глаза – световосприятие и преобразование светового кванта в различимый сенсорный сигнал. Зрительный аппарат развивался для выполнения именно этой функции и максимально для нее приспособлен. Для восприятия света в широком диапазоне освещенностей сформировалось много как клеточно-молекулярных, так и физических механизмов адаптации органа зрения к тому диапазону освещенностей, в котором происходит функционирование того или иного вида животных. Однако, кроме того, что свет является носителем сенсорного сигнала, он может выступать и как физиологически опасный фактор. Причиной этого является то, что, взаимодействуя с различными светопоглощающими веществами – хромофорами - квант света может инициировать образование активных форм кислорода (АФК), которые, в свою очередь, могут оказывать повреждающее действие на молекулярные и клеточные структуры глаза, такие, как хрусталик, роговица и сетчатка [Островскиий,1982]. Хотя сам факт, что пребывание экспериментальных животных в условиях высоких освещенностей приводит как к снижению зрительных функций, так и к заметным морфологическим изменениям, известен давно[Delmelle M.,1977; Островский М.А., 1982], особую актуальность эта проблема получила в последнее время, когда было установлено, что в сетчатке при относительно высокой освещенности развивается апоптоз. Поскольку сетчатка является постмитотической нервной тканью и не восстанавливается при гибели клеток, развитие апоптоза на протяжении всей жизни может иметь прямое отношение как к старению сетчатки, так и к развитию старческих патологий.
В сетчатке не так много хромофоров, и поиск хромофоров, ответственных за развитие апоптоза, а также механизмов светоиндуцированной генерации свободных радикалов имеет первостепенное значение как в фундаментальном, так и в прикладном смысле.
Одним из потенциальных хромофоров – генераторов свободных радикалов - является свободный полностью транс-ретиналь (ATR) [Delmelle M., 1978; Островский, 1982]. Ретиналь в 11-цис конфигурации является хромофорной группой светочувствительного белка родопсина, который находится в фоторецепторной клетке в очень высокой концентрации (3-4 ммоль/л). При освещении он переходит в полностью транс-форму и диссоциирует, находясь в фоторецепторной мембране в полностью транс-форме. Действительно, известно, что ATR способен при освещении генерировать как синглетный кислород, так и супероксид анион-радикал с относительно высоким квантовым выходом (0.001). Однако, высвобождаясь из белка, ATR восстанавливается в ретинол ферментом ретинолдегидрогеназой (РДГ), причем активность РДГ настолько высока, что in vivo свободный ретиналь не обнаруживается в сетчатке даже при распаде 90% родопсина при очень сильной освещенности. Ретинол же, в отличие от ретиналя, не является сенсибилизатором, способным генерировать свободные радикалы. В стабильном состоянии ретиналь в обеих изомерных формах в сетчатке встречается только в связанном с ретиналь-переносящими белками состоянии. В связи с этим важным представляется вопрос о том, является ли ATR фотосенсибилизатором, будучи связанным с ретиналь-переносящими белками. Накапливаясь при высокой освещенности внутри фоторецепторного диска, ATR формирует Шиффовы основании с аминогруппами белков и липидов, которые не являются фототоксичными. Однако, некоторое его количество может оставаться и в свободном виде.
Цель диссертационной работы
Цель диссертационной работы заключалась в исследовании фотосенсибилизирующих свойств ретиналя в связанном с ретиналь-переносящими белками состоянии, а также в оценке возможных концентраций свободного ретиналя в фоторецепторной мембране в том случае, когда он по каким-либо причинам не восстанавливается в ретинол, и оценке квантовых выходов фотоповреждения белков свободным ATR.
Основные задачи исследования
Определить, какие активные формы кислорода образуются при освещении ATR в растворе и в состоянии, связанном с ретиналь-связывающими белками.
Методом спиновой ловушки определить изменение квантового выхода генерации АФК при связывании ATR с ретиналь-связывающими белками.
Определить характеристики возбужденного триплетного состояния ATR методом лазерного импульсного фотолиза.
Исследовать кинетические характеристики тушения триплетного состояния ретиналя молекулярным кислородом в различных средах – водных растворах, липосомах, в состоянии, связанном с альбумином и специфическим ретиналь-переносящим белком из межфоторецепторного матрикса.
Определить соотношение между связанным (образующим Шиффовы основания) и свободным ATR в фоторецепторном диске при полном обесцвечивании родопсина.
Научная новизна
Впервые установлено, что эффективность генерации АФК снижается при связывании ATR с альбумином. Установлено, что при эквимолярном соотношении альбумина и ATR эффективность уменьшается в четыре раза.
Впервые изучены кинетические параметры тушения триплетного состояния ретиналя молекулярным кислородом в водных растворах, липосомах и в состоянии, связанном с ретиналь-связывающими белками. Показано, что скорость процесса тушения возбужденного триплетного состояния кислородом при связывании ATR с альбумином уменьшается в 8 раза, а в случае МРПБ - примерно в 50 раз.
Показано, что при связывании с фосфолипидными липосомами или фоторецепторными мембранами ATR локализуется на поверхности, а не внутри липидного бислоя. Определены константы связывания ретиналя с аминогруппами липидов в фоторецепторных мембранах. Установлено, что в фоторецепторных мембранах при нативном соотношении ATR и родопсина 70% ATR связывается с аминогруппами компонентов фоторецепторных мембран, и только 30% находится в свободном состоянии.
Научная и практическая ценность работы
Результаты диссертации имеют фундаментальное значение для понимания механизмов фотоповреждения сетчатки глаза и разработки средств защиты от него.
Основные положения, выносимые на защиту:
Связывание ATR с ретиналь-переносящими белками. Эффект экранирования ATR ретиналь-переносящими белками, приводящий к уменьшению квантового выхода активных форм кислорода.
Кинетические характеристики процесса тушения возбужденного триплетного состояния ATR молекулярным кислородом в различных средах. Уменьшение константы скорости реакции тушения триплетного состояния ATR молекулярным кислородом при связывании ATR с альбумином и межфоторецепторным ретиналь-переносящим белком (МРПБ).
Соотношение свободного и связанного с аминогруппами ATR при полном обесцвечивании родопсина в фоторецепторной мембране.
Апробация работы:
Основные результаты работы были доложены на следующих всероссийских и международных конференциях: Аболтин, П.В. Протекторное действие ретиналь-связывающих белков при генерации активных форм кислорода ретиналем. / П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, Г. Р. Каламкаров // Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем». - Сборник статей. – Минск, Беларусь. 2010, 23-25 июня. - С. 23-25; Аболтин, П. В. Фотоиндуцированная генерация активных форм кислорода производными и конъюгатами ретиналя / П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, К. Б. Шумаев, Г. Р. Каламкаров // Всероссийская конференция с международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии». – Москва 2011, 6-10 октября. – С. 107; Аболтин, П.В. Ретиналь-белковые взаимодействия как фактор, предотвращающий фототоксическое действие ретиналя в сетчатке глаза. / Аболтин П.В., Шевченко Т.Ф., Левин П.П., Шумаев К.Б, Каламкаров Г.Р. // УI Съезд Российского фотобиологического общества. - Материалы съезда. - Пос. Шепси 2011, 15-22 сентября. С. 79. Каламкаров, Г. Р. Ретиналь-белковые взаимодействия как фактор, предотвращающий окислительный и нитрозитивный стресс в сетчатке глаза / Г. Р. Каламкаров, П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, Т. С. Константинова, А. Е. Бугрова, К. Б. Шумаев // Седьмая научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». - Материалы конференции. – Смоленск 2011, 14-18 сентября. - С. 112-113. Аболтин, П.В. Фотоиндуцированная генерация активных форм кислорода производными и конъюгатами ретиналя / П. В. Аболтин, Т. Ф. Шевченко, П. П. Левин, К. Б. Шумаев, Г. Р. Каламкаров // Съезд биофизиков. - Материалы докладов. – Нижний Новгород 2012, 20-26 августа. - Симпозиум II. С.8.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 тезисов докладов, опубликованных по материалам конференций.
Структура и объем диссертации
