Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Структура связывающих белков периплазматического пространства грамотрицательных микроорганизмов и их роль в системах мембранного транспорта мета болитов 7
1. Системы транспорта метаболитов в грамотрицатель ных микроорганизмах
2. Роль связывающих белков в системах мембранного транспорта и способы их выделения 13
3. Первичные структуры связывающих белков 32
4. Физико-химические свойства связывающих белков 41
5. Пространственная структура связывающих белков 49
ГЛАВА II. Экспериментальная часть 67
1. Выделение, кристаллизация и предварительные рентгеноструктурные исследования лейцин--специфичного белка 67
2. Получение кристаллических тяжелоатомных производных, сбор и обработка трехмерного набора экспериментальных данных
3. Определение координат тяжелых атомов в производных прямыми рентгеновскими методами 83
.4. Уточнение параметров тяжелых атомов и локализация второстепенных мест связывания. Определение абсолютной конфигурации 96
5. Синтез электронной плотности с разрешением Выделение молекулы белка в кристаллической ячейке 116
6. Синтез электронной плотности с разрешением 4 А 117
7. Связывание Ь-лейцина белком в кристал лическом состоянии 120
ГЛАВА III. Пространственная структура молекулы лейцин-специфичного белка 125
1. Общая форма молекулы 125
2. Структурная организация молекулы белка при разрешении 127
3. Положение активного связывающего центра 131
4. Взаимосвязь между структурой и свойст вами 132
Основные результаты и выводы 136
Литература
- Роль связывающих белков в системах мембранного транспорта и способы их выделения
- Получение кристаллических тяжелоатомных производных, сбор и обработка трехмерного набора экспериментальных данных
- Синтез электронной плотности с разрешением Выделение молекулы белка в кристаллической ячейке
- Положение активного связывающего центра
Введение к работе
Большое внимание в настоящее время в нашей стране и во всем мире уделяется таким направлениям науки, как биоорганическая химия, молекулярная биология и биотехнология, которые, помимо развития фундаментальных исследований,вносят все больший вклад в решение практических задач, стоящих перед самыми различными отраслями народного хозяйства.
Важной проблемой этих научных направлений является изучение структуры и функции большого числа биологически активных соединений, таких, как,например, полипептиды, белки,нуклеиновые кислоты, гликопротеиды и многие другие. Одними из самых сложных известных современной науке природных молекул являются белки, играющие важнейшую роль в жизнедеятельности различных организмов.
Пространственная структура, то есть взаимное расположение всех атомов белковой молекулы, определяет ее биологическую функцию, физические и химические свойства.Структура белков кодируется в геноме живых организмов на уровне аминокислотной последовательности, однако зависит не только от особенностей этой последовательности, но и от множества возникающих в белковой глобуле внутримолекулярных взаимодействий как между соседними, так и очень далеко отстоящими друг от друга в полипептидной цепи аминокислотными остатками. Поэтому для глубокого понимания механизма функционирования белков недостаточно знания только их химической структуры, необходима подробная информация о пространственной организации их молекул, расположений и взаимодействии всех строительных блоков - аминокислотных остатков.
Большое значение, наряду с другими физическими методами изучения пространственного строения веществ, имеет рентгенострук-турный анализ,позволяющий в конечном итоге получить детальную
картину трехмерной структуры молекулы на атомном уровне. Такая информация дает возможность установить взаимосвязь между первичной и третичной структурами и пространственной структурой и биологической функцией белковой молекулы.
Целью настоящей работы является изучение рентгеновским
методом многократного изоморфного замещения при разрешении 4 А пространственной структуры лейцин-специфичного белка из Е.СОІІ, являющегося важным компонентом системы транспорта L -лейцина в бактерии.
Диссертация состоит из введения, трех глав,перечня основных результатов и выводов работы и списка использованной литературы.
Объект исследований данной работы - лейцин-специфичный белок - является представителем целой группы функционально родственных связывающих белков периплазматического пространства грамотрицательных микроорганизмов. Ряд работ по рентгенострук-турным исследованиям связывающих белков указывает на то,что они обладают весьма сходной пространственной организацией при отсутствии статистически значимой гомолргии первичных структур.
В связи с этим в главе I приведены в сжатом виде литературные данные о роли связывающих белков в системах мембранного транспорта метаболитов в грамотрицательных микроорганизмах,их первичной структуре,физико-химических характеристиках и пространственном строении. Особое внимание в главе уделено тем связывающим белкам,для которых ведутся рентгеноструктурные исследования.
В главе П приведено описание условий выделения и кристаллизации исследуемого белка, подробно изложены все этапы рентге-ноструктурных исследований, начиная с получения тяжелоатомных производных и кончая построением синтеза электронной плотности
молекулы при разрешении 4 А.
В главе Ш представлены основные результаты изучения прост-
ранственной структуры лейцин-специфичного белка и проведено сравнение результатов работы с имеющейся структурной информацией для других связывающих белков.
Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю работы, академику Ю.А.Овчинникову за постоянное внимание и помощь в работе.
Роль связывающих белков в системах мембранного транспорта и способы их выделения
Все описанные в предыдущем параграфе системы транспорта метаболитов в грамотрицательных микроорганизмах являются довольно сложными биохимическими машинами,выполняющими не менее трех функций: I)специфическое узнавание и рецепцию метаболита; 2) перенос его через мембрану; 3) диссоциацию метаболита во внутриклеточную среду. Один из классов транспортных систем, подверженный влиянию осмотического шока клеток,нуждается для своей работы в так называемых связывающих белках,особом компоненте,не связанном прочно с мембраной или с находящимися в ней другими компонентами этих систем.Данные большого количества работ указывают на то,что связывающие белки выполняют первую из трех функций, а именно,специфическое узнавание и рецепцию (захват) метаболита. Ясно также, что они должны взаимодействовать с другими компонентами транспортной системы.
Связывающие белки были выделены для большинства чувствительных к осмотическому шоку систем транспорта некоторых ионов, аминокислот,Сахаров и витаминов в грамотрицательных микроорганизмах. Большая часть исследователей считает,что связывающие белки локализованы в периплазматическом пространстве клеток. Они не обладают какой-либо известной энзиматической активностью, но способны связывать переносимые метаболиты с высокой специфичностью ( Kd 10"8-10"5М ).
Генетические и биохимические исследования показывают,что эти белки являются необходимым компонентом соответствующих систем транспорта метаболитов,так как, во-первых,удаление связывающих белков из периплазматического пространства клетки при помощи процедуры осмотического шока вызывает одновременно утерю активности транспортных систем,с которыми эти белки ассоциированы. Добавление связывающих белков к подвергнутым шоку клеткам обычно приводит к восстановлению транспорта. Во-вторых,мутанты,дефективные по связывающему белку,неспособны к транспорту; ревертанты обладают не только нормальным связывающим белком, но и восстанавливают способность к транспорту. В-третьих,ингибиторы связывания метаболитов с этими белками обычно инактивируют также и соответствующие транспортные системы. В-четвертых, транспортные системы и их связывающие белки обладают очень близкими аффинностью и субстратной специфичностью. В-пятых, генетическая экспрессия связывающих белков и соответствующих транспортных систем в большинстве случаев регулируется одним механизмом.
Приводимые ниже результаты большого количества исследований показывают,что связывающие белки характеризуются не только одинаковой ролью в системах транспорта различных метаболитов, но и сходством ряда других свойств,что позволяет сгруппировать их в единый функциональный класс связывающих белков.
Правомерность такого объединения подтверждается также и тем,что все связывающие белки могут быть выделены из клеток посредством единой процедуры,которая состоит в следующем [чв]. Клетки собираются в средней или поздней логарифмической фазе роста и промываются несколько раз Tris-нсі -буфером, рН 7. Отмытые клетки суспендируются при комнатной температуре в 40 --80 объемах 20$ раствора сахарозы, содержащего 0,1 mM EDTA. Суспензия тщательно перемешивается 10-20 мин. и затем центри -15 фугируется. Полученный осадок быстро суспендируется в 40-80 объемах дистиллированной ледяной воды, содержащей 0,IniM Mgci2. Суспензия перемешивается в течение 10 мин. и вновь центрифугируется. Эта процедура приводит к разрыхлению внешней оболочки мембран грамотрицательных микроорганизмов,разрушению ее осмотическим давлением у большей части клеток и образованию сферо-пластов. Оставшийся после центрифугирования супернатант (шоковая жидкость) содержит ряд гидролитических ферментов и связывающие белки для различных метаболитов. Эта процедура может быть несколько модифицирована для тех микроорганизмов,которые более чувствительны к осмотическому шоку. Дальнейшие этапы выделения и очистки связывающих белков могут включать концентрирование супернатанта, освобождение от небелковых примесей, разделение белков на колонке с DEAE -целлюлозой, изофокусирование и т.д., в зависимости от конкретного связывающего белка.
Получение кристаллических тяжелоатомных производных, сбор и обработка трехмерного набора экспериментальных данных
В работах (_I5I,I52j представлена структура арабиноза-свя о зывающего белка при разрешении 2,8 А. Анализ карты электронной плотности этого разрешения подтвердил сделанные ранее выводы о двухдоменной структуре молекулы белка. Домены,обозначенные"?" и "Q,", расположены таким образом, что образуют в области междоменного перешейка узкую и глубокую щель. Дно щели формируется тремя сегментами полипептидной цепи, соединяющей домены. Был установлен ход полипептидной цепи в молекуле белка. Расположение элементов вторичной структуры в обоих доменах весьма похоже. Каждый домен состоит из уплощенного jS -листа с двумя J_ -спиралями с каждой стороны. На рис.8 представлено схематическое изображение структуры молекулы белка. Исходя из этого хода полипептидной цепи примерно 35% всей цепи образуют основную часть домена Р, 43% - весь Я-домен. Оставшаяся часть цепи ( 22%) формирует петлю,продолжается в Р-домен и образует С-концевую,девятую, -спираль, принадлежащую обоим доменам. Образующий центральную часть каждого домена f -лист состоит из шести параллельных (за исключением одного антипараллельного в домене Gl ) -сегментов. Пары L-спиралей,расположенные с каждой стороны j$ -листа, антипараллельны J& -сегментам.
Такое взаимное расположение (. - и -структурных образований полипептидной цепи напоминает структуру некоторых других белков, особенно дегидрогеназ и киназ (так называемый тип укладки нуклеотид-связывающего домена [,I53j ). Это тем более интересно, что, как было показано I5lJ, один из аналогов аденина (2/,4/,5/, 7 -тетраиодофлуоресцин), связывающийся с несколькими дегидроге-назами и киназами,связывается также с арабиноза-связывающим Схематическое изображение молекулы арабиноза-связывающего белка. Стрелками обозначены в-сегменты, скрученными лентами - « -спиральные участки полипептидной цепи. белком с Kd 3xI0 М. Дифференциальные спектры поглощения в диапозоне длин волн 450-610 нм при добавлении тетраиодофлуорес-цина к арабиноза-связывающему белку характерны аналогичным для ряда связывающих нуклеотиды ферментов, таких как лактат дегидро-геназа [I54J, аспартат транскарбамилаза [I55J и креотинкиназа [I56J. Такой же дифференциальный спектр наблюдается при связывании тетраодофлуоресцина с галактоза-связывающим белком, что подтверждает предположение о сходстве пространственной организации ряда связывающих белков.
При разрешении 2,8 А авторам работы [l5I,I52J не удалось совершенно однозначно определить положение активного центра арабиноза-связывающего белка, однако ряд физико-химических данных и анализ карты электронной плотности указывает на то, что структура белка установлена в комплексе с моносахаридом, который находится,видимо, в глубине междоменной полости молекулы белка в районе участвующего в связывании субстрата остатка Cys-64 (Рис.4).
В работе положение активного центра молекулы было однозначно идентифицировано при помощи разностных синтезов Фурье для кристаллов арабиноза-связывающего белка,вымоченных в 46 мМ растворе электронно-плотного аналога субстрата - 6-бром--6-деокси-1)-галактозы. Карты элетронной плотности такого синтеза разрешения 3,5 А обнаружили пик, который был в 3,5 раза выше уровня фона. Наложение карты разностного синтеза Фурье на карту электронной плотности нативного белка разрешения 2,8 А показало, что разностный пик находится в глубине междоменной полости и на расстоянии 6-7 А от участвующего в связывании субстрата Cys -64 (Рис.4). Кроме того, этот пик частично перекрывается с не относящимся- к полипептидной цепи пиком,обнаруженным ранее на карте электронной плотности нативного белка при разрешении 2,8 А и соответствующим; видимо,связанному моносахариду.
После установления структуры арабиноза-связывающего белка с разрешением 2,4 A [l58jc помощью полной аминокислотной последовательности (рис.4) была построена атомная модель молекулы (рис.9),сначала с помощью оптического компаратора, а затем с использованием компьютерных графических систем. Данные высокого разрешения подтвердили большую степень сходства пространственных структур доменов молекулы при отсутствии гомологии их аминокислотных последовательностей. Сравнение показало, что из 139 JL -углеродных атомов в Ргдомене и 152 в Огдомене 92 атома эквивалентны со среднеквадратичным отклонением 2,6 А. Междоменная полость,в которой происходит связывание субстрата, образована в основном гидрофильными аминокислотными остатками.
В работе [l59J исследовался комплекс арабиноза-связываю-щего белка с моносахаридом при разрешении 2,4 А. Молекула L-арабинозы была отнесена к электронной плотности,соответствующей связанному моносахариду на карте электронной плотности белка разрешения 2,4 А. Все гидроксилы L-арабинозы оказались фиксированы водородными связями с расположенными в междоменной полости молекулы белка аминокислотными остатками Lys-IO, Asp-90, Asn-250, Glu-146 (возможно через молекулу воды) и Asn-232 (рис. 10). Остатки Lys-IO, Giu-I4 и Asp-90 находятся в одном домене, в то время как Asn-205 и Asn -232 - в другом домене арабиноза--связывающего белка.
Синтез электронной плотности с разрешением Выделение молекулы белка в кристаллической ячейке
Сведение координат тяжелых атомов в одну систему.. Сведение полученных прямыми методами координат тяжелых атомов в разных производных в одну систему координат и установление центров связывания в pt(CH2)2(NH2) c:i2 -производном осуществлялось с помощью разностных синтезов Фурье (программа FFT кристаллографического комплекса), вычисленных по коэффициентам лF? J ехр(і-Ур).
На первом этапе приближенные фазы V р структурных факторов Fp лейцин-специфичного белка были определены следующим образом, В исходные данные программы PHAS , осуществляющей расчет фаз структурных факторов белка по методу.фазового центроида Блоу и Крика l87j, были введены параметры тяжелых атомов, полученные прямыми методами (табл.10). По этим параметрам отдельно по каждой производной рассчитывались фазьпр в сфере разрешения
Затем проводилось несколько циклов уточнения коэффициентов заполнения и координат тяжелых атомов поочередно с циклами уточнения их тепловых факторов в изотропном приближении. Уточнение осуществлялось с помощью программы REFIN по алгоритму Диккерсона и др. LI88J попеременно с вычислением фаз fv» После стабилизации характеризующих процедуру уточнения показателей наибольшее значение фактора достоверности (равного среднему значению косинуса ошибки фазового угла) ш =0,41 было получено для фаз, рассчитанных по параметрам тяжелых атомов K2Pt(N03) -производного, имеющего, кстати, наибольший коэффициент контрастности RD ПО отношению к нативному белку (см.табл.б).
На следующем этапе с использованием полученного таким образом набора фаз был рассчитан разностный синтез Фурье для K?Ptci6 -производного. По двум наиболее сильным пикам электронной плотности на этом синтезе были определены трансляционные сдвиги, связывающие начала двух разных координатных систем. При этом учитывалось, что полученные прямыми методами координаты тяжелых атомов в K2Ptci6 -производном могут, кроме того, соответствовать зеркально-отраженной структуре. Так как известно, что разностный синтез Фурье, рассчитанный по вычисленным на основании одного тяжелоатомного производного фазам белка может содержать значительные искажения и ложные пики, в дальнейшем для рассчета фаз использовались все полученные прямыми методами параметры тяжелых атомов (с учетом трансляционных сдвигов). После нескольких циклов уточнения вновь, уже по двум производным, рассчитывались фазы белка и проводилось построение разностных синтезов Фурье для следующего производного. Таким образом были определены трансляционные сдвиги для координат основных мест посадки тяжелых атомов во всех исследовавшихся прямыми методами производных.
Определение координат тяжелых атомов в pt(CH2)2(NH2)2Cl2--производном. На конечном этапе при помощи разностного синтеза Фурье были получены координаты основных мест присоединения тяжелых ионов в пятом, Pt(CH2)2(NH2)2ci2-производном.При построении синтеза использовались фазы р, вычисленные по четырем производным.
Уточнение парметров тяжелых атомов. Уточнение параметров тяжелых атомов (в приближении анизотропного теплового движения атомов) и коэффициентов шкалирования производных проводилось методом наименьших квадратов (программа REFIN,LI88J) попеременно с перевычислением фаз структурных амплитуд. Уточнение осуществлялось в два этапа. На первом использовались данные зоны разрешения 20 А d 5 А (1631 рефлекс) нативного белка и пяти изоморфных кристаллических производных. Статистические показатели, характеризующие этот этап уточнения, приведены в табл.11. Окончательная средняя величина статистической оценки т (фактор достоверности) составила 0,80. Затем,после получения набора дифракционных данных в зоне разрешения 5 A d 4 А был проведен второй этап уточнения параметров тяжелых атомов с использованием пяти производных в зоне 20 A d 5 А и четырех производных в зоне 20 A d 4 А (3172 рефлекса) с ограничением F 0,5.
Неоднократно проводившееся на различных этапах уточнения построение разностных синтезов Фурье позволило выявить дополнительные места посадки тяжелых атомов в производных лейцин--специфичного белка, среди которых не оказалось мест со значительными (по сревнению с основными) коэффициентами заполнения. После стабилизации процесса уточнения (статистические данные приведены в табл.12) среднее значение фактора достоверности т составило 0,71 для 3172 рефлексов в сфере разрешения 4 А. На рис.22 представлено распределение отношения вклада тяжелого атома FH к ошибке замкнутости фазового треугольника и статистической оценки т в зависимости от разрешения. Из рисунка видно,что на краю
Положение активного связывающего центра
Фрагмент наложенных сечений карты электронной плотности (разрешение 4 Я) лейцин-специфического белка с выделенным оС-спиральным участком полипептидной цепи (около 4 витков). На карте электронной плотности разрешения 5 й такие участки (рис. 32) проявлялись в виде непрерывных стержней с повышенной электронной плотностью. метки, суть которого состоит в использовании радиоактивномеченных субстратов (в данном случае лейцина и изолейцина), обладающих разной энергизйизлучения. При специфическом связьшании L-лейцина кристаллы должны быть радиоактивны с энергией излучения,характерной для радиоактивной метки в Ь-лейцине. В этих целях были использованы монокристаллы лейцин-специфичного белка, которые в силу малых размеров оказались непригодны для рентгеноструктурных исследований. Кристаллы в течение полутора месяцев вымачивались в кристаллизационном противорастворе, содержащем радиоактивные L-[ Н } лейцин ( Amersham, Англия, 135 Ku/мМ, І мл-ІКи ) и L-L С J изолейцин (Amersham,Англия, 348тКи/мМ, І мл-50 мкКи) в равных количествах. Таким образом,отношение активностей Н/1 С в исходном растворе составляло 20. После вьмачивания кристаллы были несколько раз промыты противораствором для удаления несвязанных аминокислот и растворены. Радиоактивность растворов определялась при помощи пропорционального счетчика в диоксановом сцинтилляторе. Результаты измерений с различным уровнем дискриминации амплитуды импульсов показали, что отношение активностей в промывочном растворе составляет 19, т.е. близко к отношению в исходном растворе, а в растворенных кристаллах равно 242, т.е. в 13 раз больше. Эти результаты указывают на специфичное связывание L-лейцина белком в кристаллическом состоянии. В целях локализации активного центра в молекуле лейцин--специфичного белка при помощи разностного синтеза Фурье была проведена съемка экспериментального набора дифракционных отражений в сфере разрешения 4 А от кристаллов, вымачивавшихся в течение месяца в кристаллизационном противорастворе, содержащем L-лейцин в концентрации I мМ. Коэффициент контрастности такого набора по отношению к нативным кристаллам RD составил 13% при максимальном изменении параметров элементарной кристаллической ячейки на 0,5%. Вымачивание кристаллов в растворе с более высокой концентраций L-лейцина приводило к их разрушению, а при более длительном (три-четыре месяца) вымачивании в меньших концентрациях - к существенным изменениям параметров ячейки, при которых попытки обнаружить на разностных синтезах соответствующую связанной аминокислоте дополнительную электронную плотность не могли привести к успеху. Это может быть связано с кон-формационными изменениями молекулы лейцин-специфичного белка при связывании ь-лейцина, что приводит ко все более значительным изменениям всей кристаллической решетки по мере заполнения активных центров специфически связывающимися молекулами амино-ктслоты.
Анализ карты электронной плотности разрешения 5 А [196, 197] позволил установить общую форму молекулы лейцин-специфичного белка и определить некоторые особенности его структурной организации. После выделения молекулы белка в элементарной кристаллической ячейке (гл.П 5) по сечениям карты электронной плотности разрешения 5 А была построена пенопластовая модель о лейцин-специфичного белка в масштабе 0,37 см/А (рис.35). В модели представлена электронная плотность выше уровня I (при шкале плотностей от I до 10). Молекула имеет форму вытянутого вдоль оси z (оси С кристал о лической ячейки) эллипсоида. Измеренные по 5 А модели прибли о зительные размеры молекулы составляют 43x43x76 А (соотношение осей -1:2). Лейцин-специфичный белок состоит из двух ярко выраженных, близких по размерам глобулярных доменов А и В (рис.35), расположенных в разных половинах эллипсоида и соединяемых в центральной части узким перешейком. В области перешейка между доменами образуется хорошо заметная полость,имеющая форму щели. Глубина щели примерно в три раза больше ее ширины. Как можно видеть из рис.35,основные места посадки тяжелых ионов в изоморфных производных лейцин-специфичного белка расположены на поверхности домена А, причем одно из них - в глубине междоменной полости молекулы. Это указывает на доступность внутренних областей полости для больших заряженных (в основном отрицательно) ионов. Во всех пяти использованных производных домен В характеризуется отсутствием мест посадки тяжелых ионов со значительными коэффициентами заполнения.
