Введение к работе
Актуальность проблемы. Процесс слияния мембран играет важнейшую роль во многих биологических процессах, таких как экзоцитоз, оплодотворение, синаптическая передача и т.д (Evered and Whelan, 1984). Актуальность проблемы слияния мембран трудно переоценить; так, например, нервная деятельность поддерживается синаптической передачей возбуждений, которая реализуется при слиянии синаптических пузырьков с мембраной пресинаптического нейрона и выделении медиаторов в синаптическую щель. Изучить механизм слияния мембран в биологических системах трудно, поскольку соответствующая молекулярная машина включает множество белков, структура и функции которых недостаточно полно изучены (Jahn and Fasshauer, 2012). Подходом к решению проблемы явились исследования, проведенные на модельных мембранах, механизм слияния которых был установлен в 70-х годах (Leikin et al., 1987; Chernomordik et al., 1987). Однако оставались сомнения в том, что этот механизм будет справедлив при слиянии биологических объектов. Огромную роль в решении проблемы сыграли исследования вируса гриппа, слияние которого с мембраной индуцирует всего один белок — гемагглютинин, структура эктодомена которого установлена с атомарным разрешением (Harris et al., 2006).
На основании экспериментальных данных предложена концепция, согласно которой слияние мембран происходит в несколько этапов (Chernomordik et al., 1987). Ключевым этапом является формирование сталка, — структуры, в которой контактные монослои мембран уже слились, а дистальные монослои — еще нет (Kozlov and Markin, 1983; Markin et al., 1984). Для того чтобы в системе из двух мембран образовался сталк, необходимо преодолеть энергетический барьер, связанный с деформацией и гидратационным отталкиванием мембран. Последнее обусловлено отталкиванием слоев воды, ассоциированных с полярными головками липидов. Теоретические оценки показывают, что высота энергетического барьера как минимум на порядок превышает энергию, характерную для тепловых флуктуаций (Efrat et al., 2007). Это означает, что без дополнительного воздействия мембраны не сольются за разумное время в несколько секунд. В биологических системах таким воздействием являются специфические белки, называемые белками слияния. Белки слияния содержат домены, внедренные в обе сливающиеся мембраны. В настоящее время выдвинуты две гипотезы относительно механизма понижения высоты барьера белками (McMahon et al., 2010). Согласно первой гипотезе, белки слияния индуцируют в мембране ненулевую спонтанную кривизну. Согласно второй гипотезе, белковый комплекс изменяет свою конформацию и стягивает друг с другом домены, находящиеся в разных мембранах, в результате чего мембраны сближаются и сливаются. Под действием белков мембрана деформируется; энергия этих деформаций дает «упругий» вклад в энергетический барьер, который мембраны должны преодолеть на начальной стадии слияния. Кроме того, изменение формы мембран влияет на энергию гидрат-отталкивания между ними. Несмотря на большое число экспериментальных и теоретических работ, посвященных исследованию белков слияния (Martens and McMahon, 2008; Chernomordik and Kozlov, 2008, Jahn and Fasshauer, 2012), детальный механизм их функционирования до сих пор не выяснен. В частности, не ясен вклад двух механизмов: индуцирования спонтанной кривизны и прямого стягивания мембран. Выяснение механизма функционирования белков слияния является одной из важнейших задач биофизики мембран, поскольку позволяет определить способы воздействия на эти белки, в частности, блокирования начальной стадии вирусного слияния.
Поскольку слияние мембран в живых системах происходит достаточно быстро, энергетический барьер должен составлять несколько kT, что сравнимо с величиной тепловых флуктуаций; его высота определяет скорость течения всего процесса. Таким образом, вопрос о высоте энергетического барьера для перехода системы в состояние сталка и о влиянии на нее белков является ключевым для описания слияния мембран в биологических системах.
Цель и задачи работы. Целью работы является выяснение механизма инициализации белками слияния плотного контакта мембран на первой стадии процесса слияния. В соответствии с этим, решаются следующие задачи:
-
Расчет геометрических характеристик мембранной выпуклости, формирующейся под действием белков слияния, индуцирующих в ней ненулевую спонтанную кривизну.
-
Нахождение зависимости высоты энергетического барьера перехода в сталк от спонтанной кривизны, индуцируемой белками в мембране, и от усилия, которые белки к ней прикладывают.
-
Моделирование процесса формирования симметричного белкового комплекса из неупорядоченно расположенных единичных белков, опосредованного деформациями мембран.
-
Моделирование процесса порообразования и определение величины линейного натяжения кромки сквозной поры в липидном бислое.
Методы вычислений. Бислойная липидная мембрана имеет ярко выраженное различие физических свойств в латеральном и нормальном направлениях, т.е. обладает анизотропией. Это свойство роднит ее с жидкокристаллическими средами. В вычислениях использовалась форма записи свободной энергии, предложенная Хэммом и Козловым (Hamm and Kozlov, 2000). В этом выражении для энергии учитываются деформация наклона углеводородных хвостов липидных молекул к поверхности мембраны, а также деформация изгиба. Вычисления были проведены в приближении малых деформаций, мембрана считалась сплошной объемно несжимаемой средой. Пространственные распределения деформаций были определены через минимизацию функционала энергии при фиксированных граничных условиях. Необходимые численные расчеты были произведены на программном обеспечении Maplesoft Maple 11, Ontario, Canada.
Научная новизна. Впервые обнаружена связь между изменением формы мембраны и известными из экспериментов и теоретических оценок параметрами белков слияния: их геометрическими размерами, индуцируемой спонтанной кривизной и усилием, прикладываемым к мембране. Также впервые систематически изучено влияние размеров сливающихся везикул на форму образующейся на мембране выпуклости. Впервые обнаружена и теоретически исследована зависимость высоты энергетического барьера первой стадии мембранного слияния от индуцируемой белками спонтанной кривизны и усилием, прикладываемым ими к мембранам. Впервые доказана необходимость кооперативного воздействия белков слияния на мембрану по двум механизмам — механизму индуцирования в мембране спонтанной кривизны и механизму силового воздействия — для существенного понижения высоты энергетического барьера образования сталка. Впервые методами теории упругости мембран описан процесс формирования симметричного комплекса из единичных белков слияния и стабилизация этого комплекса за счет деформаций мембраны. Также впервые методами теории упругости мембран исследовано изменение формы мембраны под действием единичных белков слияния и найдена зависимость этого изменения от их геометрических характеристик.
Практическое значение работы. Результаты исследования дают возможность разработать методы количественной оценки, позволяющие определить влияние белков слияния на процесс слияния мембран в начальной стадии. В частности, появляется возможность определить способы блокирования начальной стадии вирусного слияния. Вычисленная в работе высота энергетического барьера формирования сталка является необходимым параметром, используемым при анализе кинетики слияния мембран. Зависимость высоты барьера от свойств белков слияния позволяет усовершенствовать кинетическую теорию первых стадий мембранного слияния — сведения мембранных выпуклостей и образования сталка. Полученные в работе зависимости энергетического барьера перехода в сталк от измеряемых или контролируемых параметров дают возможность планировать будущие эксперименты и прогнозировать их результаты как в искусственных, так и в биологических системах. Разработанная теория позволяет систематизировать имеющиеся экспериментальные данные и обладает предсказательной силой.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на российских и международных конференциях: конференция молодых ученых ИФХЭ РАН (Москва, 2010, 2011, 2012), семинар лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ РАН, а также на: 9th International Frumkin Symposium (Moscow, 2010), 56th Annual Meeting of American Biophysical Society (San-Diego, California, USA, 2012).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в восьми печатных работах, в том числе в трех статьях в отечественных реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, и иллюстрирована рисунками. Диссертация состоит из Введения, обзора литературы (часть I, главы 1 и 2), основной части (четыре части и 9 глав, включая результаты исследований и их обсуждение) выводов и списка литературы. Список цитированной литературы включает источника, из них … на русском языке и … иностранных.
