Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Некоторые сведения о коллоидах и высокомолекулярных соединениях вин 9
1.1.1. Осадки вин 14
1.2. Характеристика состава, динамики накопления и свойств биополимеров коньячных спиртов и коньяков 15
1.2.1. Осадки в коньяках 19
1.3. Высокомолекулярные соединения дубовой древесины 21
1.4. Современные методы анализа биополимеров коньяков и вин 24
1.5. Роль аналитических исследований в технологии виноделия 28
2. Эксперементальная часть 31
2.1. Исследуемые объекты 32
2.2. Растворители и реактивы 32
2.3. Сорбенты 32
2.4. Мембраны 32
2.5. Электрофорез 33
2.6. Гель-хроматография 34
2.7. Хромато-масс-спектрометрия 35
2.8. Ионообменная хроматография 36
2.9. Мембранные методы 36
2.10. Лиофилизация 36
2.11. Спектроскопические методы исследования 37
2.12. Очистка и стабилизация коньяков и вин 37
3. Разработка метода разделения и выделения биополимеров коньяков и коньячных спиртов 39
3.1. Разработка аналитического метода фракционирования коньяков и коньячных спиртов на основе гель-проникающей хроматографии 39
3.2. Разделение биополимеров с применением мембранных методов 46
3.3. Комбинированный ультрафильтрационно-гелъ-хроматографический метод разделения биополимеров коньяков 51
4. Исследование химического состава и фззик0-химических свойств биополимеров коньяка 56
4.1. Хромато-масс-спектрометрия биополимеров коньяка 56
4.2. Электрофоретические исследования биополимеров коньяка 69
4.3. Спектроскопические исследования биополимеров коньяка 75
5. Исследование биополимеров коньячных спиртов 83
5.1. Хроматографические и электрофоретические свойства полимеров коньячных спиртов 83
5.2, Изучение динамики накопления.биополимеров коньячных спиртов 88
6. Гибридные исследования шополимеров. белых крепленых виноматериалов 95
6.1. Раз работка, метода выделения биополимероввин 95
6.2. Электрофоретические исследования биополимеров, крепленого виноматериала 106
6.3. Исследование биополимеров крепленого виноматериала спектроскопическими методами 110
7. Практическое применение разработанных гибридных методов анализа 114
7.1. Стабилизация коньяков 116
7.2. Стабилизация крепленых виноматериалов 133
Выводы 144
- Характеристика состава, динамики накопления и свойств биополимеров коньячных спиртов и коньяков
- Лиофилизация
- Комбинированный ультрафильтрационно-гелъ-хроматографический метод разделения биополимеров коньяков
- Электрофоретические исследования биополимеров, крепленого виноматериала
Характеристика состава, динамики накопления и свойств биополимеров коньячных спиртов и коньяков
Высокомолекулярные соединения коньячных спиртов и коньяков представлены, главным образом, соединениями, экстрагируемыми из дубовой бочки и продуктами их превращений. В работах [48,49] лигнин коньячного спирта характеризуется водонерастворимой фракцией, которая составляет в среднем 15$ от общего количества продуктов распада и водорастворимой -85$, из них 55$ нерастворимы в эфире. В водорастворимую фракцию лигнина коньячного спирта входят глюкозиды, гемикетали и ароматические компоненты [48]. Водорастворимые соединения лигниновой природы окисляются перманганатом и вносят ошибку в определение танидов [50]. Таниды коньячного спирта в зависимости от их растворимости и способности сорбироваться кожным порошком делят на три фракции f48,51J; в каждой из них идентифицировано присутствие лигнина. Авторы [50,5l] утверждают, что углеводы в коньячных спиртах представлены, главным образом, моносахарами, а также незначительным количеством декстринов. Авторы [52,53] утверждают, что продолжительная выдержка, повышенная концентрация спирта и температура способствуют протеканию в коньячных спиртах меланоидинообразования. Исследователи [54j обнаружили максимум поглощения при 280 нм и полагают, что существует взаимосвязь между интенсивностью поглощения и качеством спиртов. Вместе с тем в работе [55J не обнаружено максимума поглощения при 280 нм у отечественных коньяков. Большинство УФ-спектров коньячных спиртов, коньяков и хлороформенных вытяжек коньячных спиртов, приведенных автором [48J имеют два максимума поглощения - при длинах волн 226-230 нм и 275-280 нм, хотя авторы и не отмечают наличие первого из них. В работах последних лет [56,57] однозначно определено, что лигнаны дуба и коньячных спиртов имеют два максимума поглощения - при 226 и 280 нм. Весьма примечательным является большое сходство ИК-спект-ров модельной смеси Сахаров и некоторых коньячных спиртов [48J. В первые шесть лет выдержки коньячных спиртов в составе экстрата увеличивается содержание лигнина, однако в дальнейшем этот процесс значительно замедляется ввиду усиления гидролиза, окисления лигнина, выпадение его частично в осадок, распада, с образованием ароматобразуодих компонентов [58J. Изменения в процессе выдержки дубильных веществ носят практически аналогичный характер [48,59].
В результате гидролиза высокомолекулярных компонентов дубовой клепки, в коньячном спирте образуются моносахара, содержание которых увеличивается в течение всего периода выдержки. Причем, если в начале выдержки преобладают пентозы, то после 10 лет - гексозы Авторы [48,591 делят процесс выдержки коньячных спиртов на три периода: первый - до 5 лет, второй - от 5 до 10 лет и третий - свыше 10 лет. В эти периоды процессы экстракции и новообразования отличаются своей интенсивностью. В коньячных спиртах, выдержанных до 5 лет,дубильные вещества составляют 23-25$ сухого остатка, лигнин - 28 35$, редуцирующие сахара - 18-24$, после Ю лет выдержки содержание этих компонентов соответственно составляет: 10-15$, 17-22$ и 51-58$. Автор [48,60j полагает, что более показательным является изменение соотношения основных веществ экстракта и рекомендует как один из методов установления возраста коньячного опир-та определение величин этого соотношения. Для определения возраста коньячных спиртов предложены также методы УФ- , ИК-сяектрометрии, метод определения в спиртах тяжелого изотопа углерода - трития J56,6I,62j. Коньяк, в отличие от коньячных спиртов содержит колер. Колер представляет собой продукт карамелизации сахарозы. Авторы [l9J отмечают, что при этом происходит его дегидратация с образованием карамелей, органических кислот и других продуктов. С повышением температуры варки колера увеличивается образование труднорастворимых карамелинов и других высокополи-меризованных соединений [63,64І что отрицательно сказывается на вкусовых качествах и стабильности коньяков. Интенсивность окраски колера зависит от образующихся гуминовых кислот j_I9J. Авторы б4] считают, что определяющее значение имеет наличие в сахаре редуцирующих веществ. В сахаре, идущем на промышленную переработку, обнаружены аминокислоты [бб]. Авторы полагают, что при варке колера протекает сахароаминная реакция, образующиеся при этом меланоидины значительно влияют на окраску. Трудности выделения высокомолекулярных соединений коньяка предопределили крайне недостаточную степень изучения этого важного класса соединений, оказывающего определяющую роль на качество и стабильность напитка. Применению современной разделительной техники в исследовании биополимеров коньяков посвящены единичные работы. Так, в 1983 г. японскими энохимиками [бб] методами ГПХ и ультра-фильтрации показано наличие в коньяке полимеров с ММ около 10 тыс. и более, которые играют решающую роль в образовании окраски.
Полимеры с МЛ равной I тыс. характеризовались наибольшим содержанием метоксильных групп. Авторами работ [67] , в зависимости от молекулярных масс, выделено в ординарных коньяках отечественного производства 7 фракций биополимеров. Определена доминирующая роль в их составе углеводных компонентов. Показано влияние эффективности выделения полимеров на адекватность последующей идентификации. С установлением природы, химического состава высокомолекулярных и коллоидных соединений коньячных спиртов и коньяков связано установление механизма и причин образования осадков и совершенствование технологии стабилизации. Ряд исследователей решает эту проблему с позиций изучения природы и состава осадков в коньяках. Известно [68], что по внешнему виду осадки, образующиеся в коньяках, можно разделить на две группы: - осадки в виде светло-серых хлопьев, находящиеся во взвешенном состоянии, которые при встряхивании оутылки частично растворяются; - нерастворимые осадки темно-серого цвета, плотно лежащие на дне бутылки. Содержание метоксильных групп в осадке дает основание предполагать наличие продуктов распада лигнина. Н.Т.Семененко считает, что осадок образуется ввиду потери растворимости веществ, входящих в состав коньячных спиртов, при купаже, в результате разбавления их до кондиции коньяков. Он также высказывает мнение о возможности образования осадка за счет колера В работе [70j, Тохмахчи Н.С. и др., исследовав осадки грузинского и азербайджанского коньяков на растворимость в различного рода растворителях, показали, что осадок имеет полярную природу. В осадках обнаружено значительное количество кальция, магния, меди, полифенолов, а также пектиновых веществ, углеводов, липидов. Исследованиями [чі] в древесине дубовой бочки и в коньячном спирте обнаружены белковый и небелковый азот, что ставит задачу исследования возможности образования белковых помутнений коньяков. По мнению А.ДДашхи и др. [V2J, одной из причин помутнения коньяков является триглицеридная фракция. В коньячном осадке идентифицированы триглицериды, содержащие 20 известных и 2 неизвестные жирные кислоты. Отмечается повышение устойчивости коньяков с увеличением их спиртуозности [ 73J. Ж.Лафон с сотрудниками также считают, что помутнения в коньяке могут возникать за счет снижения растворимости различных соединений, находящихся в коньяке, при уменьшении спиртуозности и температуры. коньяк - продукт с высокой концентрацией спирта и кислой рН среды, в химическом отношении активный реагент. Вещества, входящие в его состав могут легко вступать в реакцию с металлами, образуя осадки, представляющие собой полимерные хелаты меди, кальция и железа, магния [74,75J. По данным Н.Т.Семененко, критической концентрацией железа в коньяках является I мг/л, Ж.Лафон - 0,4 мг/л. Определяющее значение в появлении и характере осадка имеет содержание иона Fe + [68].
Лиофилизация
В работе использовали анионит АРА-М. Подготовку и регенерацию анионита проводили по общепринятым методикам [ I26J . Колонку 1x5 см уравновешивали 0,5$ трис- НСЕ буфером. Через анионит пропускали 20 мл коньяка со скоростью 5-15 мл/час. По окончании сорбиции колонку промывали двумя объемами исходного буфера. Для десорбции использовали 0-2М растворы ШС1 в линейном, экспоненциальном и ступенчатом градиентах концентраций. Элюирование проводили со скоростью 1-Ю мл/час. Контроль выхода фракции осуществляли при помощи проточного денситометра спектрофотометрически при длине волны 276 нм. 2.9. Мембранные методы Обратный осмос осуществляли, используя фильтрационную ячейку статического типа с рабочим объемом 150 мл. Рабочее да-вление 30х10иПа осуществлялось в токе азота. Ультрафильтрацию и мйкрофильтрацию проводили при использовании комплекта лабораторных ячеек типа ФМ.0І, выпускаемых СКВ аналитического приборостроения АН СССР, с рабочим объемом от 10 до 1000 мл. Рабо-чее давление 3-ЮиПа создавалось при помощи азота. 2.10. Лиофилизация Лиофилизацию проводили на установке "Хетосик" фирмы "Хелинг" (Дания) при температуре 15-17С и избыточном давлении 30 Па. Образцы предварительно замораживали в круглодонных колбах объемом 0,250-1 л на установке "Хетофриг" фирмы "Хелинг" при температуре - 50С. Сушку также проводили на установке "Минифэст-680" фирмы "Эдварде" (Англия), 2.II. Спектроскопические методы исследования Строение биополимеров изучали методами ИК- и ЯМР - спектроскопии. ИК- спектры снимались на приборе UR -20 в интервале 400-4000 см . Образцы готовились в виде таблеток с КВч и в тонких пленках. ЯМ? - Н спектры регистрировали на спектрометре WH -90 "Брукер", при комнатной температуре. Растворитель - дейтериро-ванная вода, внутренний стандарт {СЧ ) СОИ9 Химические сдвиги измеряли в О -шкале. Точность измерения химических сдвигов составляла чр,03 м.д. Изучение УФ -спектров поглощения проводили на спектрометре "Хитачи" модель 330 (Япония), Уф -Спекорд (ГДР) и "Перкин-Ельмер" (США). Качественный и количественный анализ металлов в винах и коньяках проводили на атомно-абсорционном спектрофотометре "Перкин -Ельмер", модель 402. 2.12. Очистка и стабилизация коньяков и вин Представляло практический интерес выяснение роли компонентов вин и коньяков в образовании помутнений, определение оптимальных средств и методов борьбы с этими явлениями.
Объектами исследования служили высокомолекулярные флокулянти различной природы: катионные - поли- МN -диметил-А/,Л/ -диаллиламмонийхлорид и полиаминоэфиры акриловый (метакриловой) кислот; анионные - гидролизованный полиакриламид, гидрофобные полиэлектролиты - поливинил капролактам и сополимер на основе винилацетата и винилпирролидона. Флокулянти готовились в виде 0,1#-ных водных растворов и вводились в исследуемые объекты в количестве 10-40 мг/л. Остаточные количества полиэлектролитов определялись спектрофотометрически с помощью эозина, Гі72І . Стабилизация с применением традиционных оклеивающих средств и термообработок, а также оценка склонности коньяков и вин к образованию помутнений, проводились по общепринятым в технологии виноделии методикам. Определение содержания в исследуемых объектах спирта, сахара, экстракта, титруемой и летучей кислотности, общего и белкового азота, полифенольных соединений проводили по методикам, утвержденным Министерством пищевой промышленности СССР [І69І 3.1. Разработка аналитического метода фракционирования коньяков и коньячных спиртов на основе гель-проникающей хроматографии Метод ПК перенесен в исследования полимеров коньяков и вин из практической биохимии без учета специфики изучаемого объекта. В то же время известно, сколь велико влияние на процесс ІЖ взаимодействий подвижной и неподвижной фаз, исследуемого объекта с подвижной и неподвижной фазами 140-147 Для разделения продуктов винодельческого производства с повышенным содержанием спирта - коньяков и коньячных спиртов, взят, в качестве неподвижной фазы, ранее применявшийся гидрофильный неполярный (малополярный) гель Сефадекса Г-25 146 Фирмы-производители гидрофильных Сефадексов типа "Г" запрещают применение их для работы с неполярными и малополярными органическими объектами, в частности, с этиловым спиртом, так как в подобном случае происходит процесс перехода гидрофильного геля в золь, либо сжатие гранул и усадка слоя геля в колонке. В таких условиях нельзя добиться равновесного распределения изучаемых соединений между подвижной и неподвижной фазами и, естественно, достоверных, воспроизводимых результатов.
Кроме того, выбор неподвижной фазы предопределяет применение в качестве элюента воды или водных растворов. Однако многие исследователи в области химии коньяка связывают процессы нарушения нативной структуры полимеров коньяка, образование коллоидов и выпадение осадка именно с разбавлением коньячных спиртов при купажировании. В таком случае, неизбежное разбавление образца в процессе хроматографирования элюентом-водой, отрицательно отражается на адекватности результатов. Б связи с вышесказанным, представляло интерес изучение влияния на процесс ШХ коньяков, подвижной и неподвижной фаз и определение оптимальных условий хроматографирования. Нами исследовались возможности применения в качестве неподвижной фазы комбинированных гидрофильно-гидрофобных гелей Сефадексов І-Н -20 и LH -60, полученных оксипропилирова-нием соответственно Сефадексов Г-25 и Г-50, а также синтетические молекулярные сита "Тоеперл" /-/U/ 40t f///-50, фирмы "Тойосода" (Япония). В качестве элюентов применялись водный и водно-спиртовый Глицин- НС& , буферные растворы со значениями спиртуозности, рїї и ионной силы соответствующими коньяку, а также дистиллированная вода и 40% спирто-водный раствор. Исследования проводили, используя систему для жидкостной колоночной хроматографии фирмы "ЖБ" (Швеция), на колонке 70x1,4 см. Элюент после приготовления отфильтровывали на фильтр-картоне "ЖС" фирмы "Зейц" (ФРГ). Скорость элюирования - 20 мл/ч. Отбор фракций по 150 капель. Проточная кювета денситометра емкостью 70 мкл. Скорость лентопротяжки самописца 0,2 мм/мин, температура в термостати-руемом шкафу 17С. Анализ с использованием ГПХ позволяет идентифицировать биополимеры в соответствии с их молекулярными массами. Однако, как следует из литературного обзора, на механизм разделения оказывают конкурирующее влияние сорбционные эффекты, специфические взаимодействия подвижной и неподвижной фаз между собой и с разделяемым объектом, стерические особенности полимеров и т.д. Так, в частности, фирма-производитель Сефадекса - "Фармация файн кэмикалс" приводит в своих проспектах данные калибровок гелей по модельным растворам декстранов и белков 148 При прочих равных условиях они отличаются между собой, в некоторых случаях, на порядок. Поэтому для характеристики фракций нами используется широко распространенный метод относительной хроматографической подвижности, позволяющий избежать неадекватных характеристик по молекулярной массе веществ с недостаточно изученными строением и свойствами. Выяснение точной молекулярной массы для биополимеров коньяков и вин должно составлять отдельное исследование, основанное на комплексном использовании наряду с ГПХ других аналитических методов, в частности,ультрацентрифугирования, осмо-метрии и т.д.
Комбинированный ультрафильтрационно-гелъ-хроматографический метод разделения биополимеров коньяков
В исследуемых объектах биополимеры находятся в микроколичествах, что обуславливает необходимость предварительного концентрирования при препаративном выделении соединений. Обычно для концентрирования образцов применялась вакуум-выпарка. Использование этого метода для подготовки к анализу коньяков невозможно, вследствие того, что в результате выпарки происходит преимущественное удаление более легкокипящего компонента растворителя, в нашем случае,этилового спирта. В результате в перегонной колбе образуется осадок из водонераствори-мых компонентов коньяка, что делает последующий анализ неадекватным. Ультрафильтрация позволяет осуществить быстрое иЧшгкое" концентрирование макромолекул коньяка без увеличения содержания низкомолекулярных соединений, при неизменных спиртуозности, рН, ионной силе концентрируемого объекта. В предлагаемом нами комбинированном методе разделения биополимеров осуществляется последовательное сочетание ультрафильтрации и ГПХ, что позволяет, во-первых, устранить недостатки присущие ультрафильтрации - низкую селективность при разделении сложных смесей; во-вторых, решить вопрос предварительной подготовки образца для ГПХ, нивелируя разбавление в ходе анализа. В результате значительно возрастает чувствительность анализа и эффективность препаративного выделения высокомолекулярных соединений, в нашем случае биополимеров с Rf I (рис.3.36). В некоторых случаях применение комбинированного метода настолько эффективно, что позволяет и значительно упростить и сократить анализ, так как высококачественная ультрафильтрация объединяет в себе три операции: концентрирование образца, обес-соливание его и последующее концентрирование высокомолекулярной части перед ГПХ (рис.3.46). Препаративное выделение фракций проводили на колонке 3,7x90, объемом 1000 мл., скорость элюирования 200 мл/час, объем вводимой пробы 25 мл, отбор фракции по 250 капель. Остальные условия хроматографирования те же, что и ранее. В таблице 3.2. представлены результаты количественных измерений площадей пиков под кривой хроматографического профиля, а также абсолютные массы лиофильно высушенных фракций. Следовательно, в данном случае, по площадям пиков под хроматограммои не представляется возможным сравнить абсолютные массы веществ, находящихся во фракциях. На рис.3.5. представлены хроматограммы, полученные по разработанной нами методике для Молдавских и Грузинских ординарных коньяков.
Прежде всего, важно отметить общий характер денситометри-ческих кривых коньяков, независимо от района производства. Существенным является полная идентичность Hi фракций биополимеров. Отличия заключаются лишь в количественном изменении площадей пиков под денситограммами. По нашему мнению, ГПХ может служіть методом качественной идентификации коньяков, как продукции винодельческого производства. Перераспределение площадей пиков очевидно отражает особенности технологии. Площадь пика вероятно является количественной оценкой содержания биополимеров лишь для фракций с одинаковыми Щ , так как каждая фракция характеризуется своим коэффициентом, связывающим площадь пика и абсолютную массу биополимеров (табл.3.2.). Данные химического состава высокомолекулярных соединений коньяков в современной литературе отражены недостаточно, носят в основном, общий характер. Это обусловлено как сложностью и разнообразием состава смесей биополимеров, так и недостатками, связанными с их выделением. Представляло интерес исследование фракций биополимеров коньяка, выделенных по предложенному нами ультрафильтрационно-гель-хроматографическому методу. В изучении состава фракций биополимеров мы опирались на спектроскопические и электрофоретические методы анализа. Однако нами впервые отведена основная роль в исследовании высокомолекулярных соединений коньяка хромато-масс-спектрометраи. Один из наиболее перспективных и информативных методов анализа -хромато-масс-спектрометрия, в сущности,сама является гибридным методом, так как объединяет в себе одновременно операции разделения и анализа, что и обусловило ее эффективность в изучении смесей соединений природного происхождения. 4.1. Хромато-масс-спектрометрия биополимеров коньяка Следует учитывать, что хромато-масс-спектрометрия накладывает очень жесткие требования к летучести анализируемых соединений, что предопределяет использование ее преимущественно в анализе низкомолекулярного легколетучего комплекса коньяка. Нами впервые предложено применить хромато-масс-спектро-метрию в исследовании высокомолекулярных биополимеров коньяков. Это оправданно лишь при гибридизации ее с ультрафильтрационно-гель-хроматографическим методом выделения полимеров. Подобное комбинирование предполагает предварительный гидролиз отдельных фракций и перевод их в легкоопределяемые хро-мато-масс-спектрометрическим методом производные.
Результаты анализа мономерного состава гидролизата позволяют вполне определенно судить о природе и строении конкретного биополимера, исключая неоднозначность трактовки результатов, тлеющую место при анализе гидролизата смеси соединений. С целью расширения диапазона определяемых веществ, мы воспользовались стандартным приемом - переводом их в эфиры. В качестве этерифицирущих агентов использовали метилирующий ( Me ) и триметилсилилирующий (ТИС) реагенты, последовательно. Выбор обсуждаемых реагентов основан на том, что библиотека масс-спектров содержит спектры веществ, преимущественно в виде этих производных. В случае, если фракции биополимеров содержат относительно низкомолекулярные компоненты, то можно предположить, что непосредственное метилирование смесью СН30Н/ВГ3 (14$ раствор) с последующим силилированием метилсилилтрифторацетамидом с три-метилхлорсиланом в качестве катализатора (Регисил-3) предоставит возможность их анализа методом хромато-масс-спектрометрии. При метилировании растворы темнеют, в ряде случаев обра-зуются осадки, которые не растворяются при силилировании. Полученные хроматограглмы фракций практически одинаковы. В качестве примера на рис.4.1 приведена типичная из полученных денсито-грамм. Она характеризуется лишь наличием пика, соответствующего растворителю. Следовательно, выделенные на ПК фракции действительно представляют собой высокомолекулярные нелетучие соединения. начально проводят гидролиз. Чаще всего гидролиз осуществляют соляной кислотой, I-2H [\И для гликопептидов и 6Н HCt для белков в течении нескольких часов при температуре Ю0С [133, 134]. Метанолиз с последующим силилированием фракций биополимеров коньяка проводят по методике описанной выше. На рис.4.2-4.5 представлены хроматограммы полного ионного тока всех фракций полимеров коньяка, а также нулевой фракции, то есть элюента, выходящего ранее свободного объема колонки. Характерной особенностью полученных хроматограмм является наличие в большинстве из них пиков с очень близкими временами удерживания. Можно предположить, что им соответствуют одинаковые вещества, что не всегда так. Рассмотрим в качестве примера пики: 577 из фракции с Щ 1,0; 578 из фракции с Rf 0,7; 579 из фракции с Щ 0,33; 580 из фракции с Rf 0,29 и 581 из фракции с Ri 0,47. Сравнение масс-спектров этих веществ показывает (рис.4.б и 4.7), что вещества 578 из фракции с Rf 0,7 и 581 из фракции с Rf. 0,47 идентичны и представляют собой моносахариды (рис.4.6), а компоненты 577 из фракции с Hi 1,579 из фракции с Rf 0,33 и 580 из фракции с Rf 0,29 идентичны и являются метиловым эфиром жирной кислоты (рис.4.7). Для простоты обсуждения полученных результатов, вещества с практически одинаковыми временами удерживания и их масс-спектры обозначены одной буквой латинского алфавита. В табл. 4.1 суммированы данные хромато-масс-спектрометрического анализа гидро-лизатов фракции биополимеров коньяка Армянского 3-х летней выдержки. Анализ мономерного состава биополимеров (табл.4.1) позволяет сделать вывод, что фракции биополимеров с Rl 1,0; 0,33 и 0,29 имеют гликолипидную природу, фракции биополимеров
Электрофоретические исследования биополимеров, крепленого виноматериала
Как и в случае коньяков исследования проводили с привлечением вертикального трубчатого диск-электрофореза в системе Дэвиса. Подготовку образца к анализу, режим и контроль электрофореза осуществляли аналогично описанному выше. При электрофорезе исходного виноматериала проявляется 5 окрашенных в видимой области зон с ОЭП 0,69 и 0,61 - коричневые; 0,75 - желтая; 0,88 и 1,0 - серые (рис.6.5). Прокраска геля красителем Кумасси бриллиантовым Г-250 позволила определить наличие белковых соединений в зонах с ОЭП 0,61 и 0,69. В остальных электрофоретических фракциях белка с точностью 10 г/л не обнаружено. Краситель Толуидиновый синий позволил идентифицировать полисахаридные соединения также в зонах с ОЭП 0,61 и 0,69 (рис.6,5). Таким образом, электрофоретические зоны исходного виноматериала с ОЭП 0,61 и 0,69 представляют собой интерполимерные . окрашенные в коричневый цвет комплексы полисахаридно-белковой природы. Визуально окрашенные зоны с ОЭП I; 0,88 и 0,75 давали отрицательную реакцию с толуидиновым синим. Однако этот факт не является подтверждением отсутствия полисахаридов, так как краситель толуидиновый синий специфичен в идентификации мукополи- сахаридов, а также гликопротеинов и может не связываться полисахаридами других типов. Электрофоретическому исследованию были подвергнуты лио-филизаты фракций исходного виноматериала, выделенные по модифицированному фильтрационно-хроматографическому методу. После разделения электрофорезом во фракции с /?г I локализовано и обнаружено путем прокраски геля две зоны с ОЭП 0,53 и 0,44 (рис.6.6). Причем следует отметить, что полоса с ОЭП 0,53 представляет белково-полисахаридный полимер, в тог.время, как в зоне с ОЭП 0,44 обнаружен только белок. Диск-электрофорез фракции биополимеров с дг 0,85 позволил локализовать три форетические зоны с ОЭП 0,57; 0,46 и 0,35 (рис.6.6). Как соединение белково-полисахаридной природы идентифицирована полоса с ОЭП 0,46, а полоса с ОЭП 0,57 представляет собой полисахарид; полоса с ОЭП 0,35 - белок. Важно подчеркнуть, что визуальный контроль электрофореза фракций с /?р 0,68; 0,44; 0,36; 0,33; 0,29 и 0,23 позволяет обнаружить по одной полосе в каждой из них. Обработкой гелей кумасси бриллиантовым Г-250 установлено отсутствие соединений белковой природы в перечисленных хрома- тографических фракциях с точностью до 10 г/л. Положительная реакция на полисахариды, в виде одной окрашенной полуидиновым синим полосы, была обнаружена во фракциях с /?/ 0,68; 0,29 и 0,23.
Причем ОЭП нативно-окрашенных зон биополимеров и зон идентифицируемых красителем совпадают. Во фракциях с Rf 0,44; 0,36 и 0,33 реакцией с красителем полисахариды не идентифицированы. Однако, как сказано выше, этот факт не позволяет утверждать об отсутствии полисахаридов в указанных фракциях, о чем свидетельствует приведенное Результаты Уф -спектроскопии 0,1% растворов лиофилиза-тов фракций биополимеров характеризуются наличием двух максимумов поглощения в области 226-230 нм и 276-280 нм. Кроме того, у фракций полимеров с Ri 0,30 и 0,23 характерно выражен максимум поглощения при 325 нм. В таблице 6.1 представлены экстинции 0,1 растворов фракций Ш виноматериала, площади пиков под кривой элюирования (рис.6.2) и абсолютные массы лиофилизованных фракций. Существенно отметить, что такой параметр, как отношение массы лиофильно высушенной фракции к площади соответствующего пика под денситограммой элюирования изменяется от 0,82 до 176.,4 То-есть количественное содержание функциональных групп или веществ, обладающих хромофорным эффектом при 276 нм не пропорционально массе полимера, на основании чего возможно предположить о различном составе и природе биополимеров, в зависимости от R-1 элюирования. По аналогии с анализом коньяков, адекватная количественная оценка биополимеров вина по площади соответствующего пика под денситометрической кривой, очевидно, предполагает использование индивидуальных коэффициентов пропорциональности, в зависимости от Rl фракции (табл.6.1). Оценка численных значений экстинции 0,1% растворов лиофи-лизатов фракций биополимеров вина при длинах волн 276 нм и 226 нм, величины их соотношения, а также сравнение полученных результатов (табл.6.I) с показателями модельных растворов позволяет, аналогично коньякам, сделать вывод о незначительном содержании в составе ЕМ соединений фенольной природы - в среднем до 3-7 % от массы фракции. Интересно отметить, что наибольшим содержанием хромофорных, при 276 нм веществ или функциональных групп обладают биополимеры элюирующиеся с геля Сефадекса Г-25 с Н4- 0,29 и 0,23, то-есть наиболее низкомолекулярные компоненты. ИК-спектры лиофилизатов фракций биополимеров (рис.6.7) носят инвариантный характер, что позволяет предложить эту область детектирования для контроля ПК разделения. Спектры характеризуются наличием полос поглощения, относящимся к карбоксильным, карбонильным и гидроксильным группам.
Существенно, что фракциям с /и 1,0; 0,85; 0,68; 0,29 и 0,23 присущи полосы поглощения характерные для NH -групп (1720 см ), что подтверждает результаты форетической идентификации мукополисаха-ридов. Отсутствие этой полосы поглощения у фракций с Hf- 0,34; 0,44 и 0,36 позволяет предположить, что данные биополимеры не относятся к мукополисахаридам, и объяснить отрицательную реакцию с Толуидиновым синим. Следовательно, электрофоретическим и ИК-спектрометрическим методами экспериментально показана неудовлетворительность метода определения белков по методу Кьельдаля. Содержащиеся в винах аминогликаны обуславливают некорректность анализа. Анализ ЯМР-Н спектров (рис.6.8) подтверждает отсутствие фенольних соединений, которым присущи химические сдвиги в области 6-7 м.д.,и наличие большого числа групп (химические сдвиги. 1,28 и."3,04 м.д.). Одной из важнейших проблем современного виноделия является обеспечение длительной стабильности коньяков и вин. В современных условиях интенсификации производства, наряду с усилением требований к качеству продукции, актуальность задачи неизмеримо возрастает. Научно-обоснованные рекомендации по повышению эффективности стабилизации возможны только на основании анализа состава биополимеров коньяков и вин, детерминирования полимерного комплекса в образовании помутнений, а также выяснения механизма действия различных осветлителей и стабилизаторов. Физико-механические процессы, приводящие к образованию дисперсной фазы, а также технология стабилизации, в частности, оклейка, фильтрация, сопровождаются, в первую очередь, качественными и количественными изменениями массово-молекулярного распределения биополимеров коньяков и вин. В связи с чем, предлагаемый в данной работе ультрафильтрационно-хроматографический гибридный метод анализа, является, по нашему мнению, надежным инструментом для решения поставленных задач. Традиционные способы стабилизации вин и коньяков от коллоидных помутнений в большинстве случаев малоэффективны. Кроме того, из-за недостаточно высокой селективности оклеивающих материалов происходит обеднение продуктов ценными веществами. Следует отметить.несовершенство традиционных приемов стабилизации и отсутствие объективных аналитических методов определения биополимеров ответственных за помутнения. Эти условия достаточны для постановки задачи по разработке новых стабилизирующих средств, среди которых весьма эффективными оказались селективные высокомолекулярные флокулянти ряда поли- l\/,lv -диметил- -диаллиламмоний хлорида (катионная характеристика), поливинилкапролактама и сополимеры винилацетат винил-пирролидона (гидрофобная характеристика). Различная природа используемого ряда полиэлектролитов предопределяет селективное устранение того или иного высокомолекулярного компонента помутнений за счет образования стехиометрического нерастворимого комплекса.
Похожие диссертации на Разработка гибридных ультрафильтрационно-хроматографических методов анализа биополимеров в винах и коньяках
