Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Люминесцентные методы в аналитической химии 9
1.1 .Фосфоресценция при комнатной температуре 10
1.1.1 .Фосфоресценция на поверхности 11
1.1.2.Фосфоресценция в растворах 17
1.1.2.1 .Фосфоресценция в мицеллярных растворах 18
1.1.2.2 .Фосфоресценция в циклодекстриновых средах 21
1.1.2.3 .Сенсибилизированная фосфоресценция 26
1.1.2.4.Фосфоресценция в водных растворах 28
1.2. Основные факторы, влияющие на ФКТ 29
1.2.1 .Эффекты внешнего и внутреннего тяжелого атома 2 9
1.2.2. Влияние среды 32
1.2.3. Тушение ФКТ кислородом З 3
1.2.4. Температурно-индуцированный эффект 35
1.3. ФКТ с временной и спектральной селекцией 36
1.4. Сочетание ФКТ с другими методами 38
Глава 2. Методы определения лекарственных соединений в фармацевтических препаратах и биологических жидкостях 40
2.1.Методы идентификации и определения активных компонентов в фармацевтических препаратах 40
2.2. Основные методы определения лекарственных соединений в биологических матрицах 42
Глава 3. Исходные вещества, аппаратура и техника эксперимента 45
3.1. Выбор модельных соединений 45
3.2. Исходные вещества, приготовление растворов и аппаратура 47
3.3. Выбор оптимальных условий сканирования спектров фосфоресценции на спектрофлуориметре «Панорама» 50
Глава 4. Спектрально-люминесцентные характеристики изученных соединений 52
Глава 5. Изучение кислотно-основных свойств и распределения люминофоров в различных средах 63
5.1, Изучение кислотно-основных свойств в водной среде 63
5.2.Изучение кислотно-основных свойств в мицеллярной и циклодекстриновой средах 70
5.3. Определение констант связывания люминофоров с р-циклодекстрном 73
5.4.0пределение констант связывания люминофоров с мицеллами додецилсульфата натрия 80
Глава 6. Влияние различных факторов на ФКТ в мицеллярной, водной и циклодекстриновой средах 84
6.1. Фосфоресценция при комнатной температуре в мицеллярной среде 84
6.2. Фосфоресценция при комнатной температуре в водной среде 97
6.3.Фосфоресценция при комнатной температуре в циклодекстриновой среде 103 6.4.0пределение времени жизни люминофоров в триплетном состоянии в различных средах 105
Глава 7. Люминесцентное определение лекарственных соединений в фармацевтических препаратах и биологических жидкостях 110
7.1. Люминесцентное определение активных компонентов в фармацевтических препаратах 110
7.2.Фосфориметрическое определение пропранолола в биологических жидкостях 118
7.2.1 .Определение пропранолола в моче 118
7.2.2 .Определение пропранолола в плазме крови 122
Выводы 128
Литература 130
- Основные факторы, влияющие на ФКТ
- Основные методы определения лекарственных соединений в биологических матрицах
- Выбор оптимальных условий сканирования спектров фосфоресценции на спектрофлуориметре «Панорама»
- Определение констант связывания люминофоров с р-циклодекстрном
Введение к работе
Актуальность работы. Выявление фальсифицированных
фармацевтических препаратов является актуальной задачей, поскольку современные фармацевтические рынки заполнены продукцией, качество которой часто не отвечает гребуемым стандартам. Подобные препараты представляют угрозу тем, что активные компоненты находятся в них в меньших, а, следовательно, терапевтически неэффективных количествах. Кроме того, в составе таких препаратов могут полностью отсутствовать компоненты, указанные на упаковке. В связи с ростом количества фальсификатов особую важность приобретает разработка экспрессных методов их анализа. Тест-методы не решают полностью проблему контроля лекарственных препаратов, поскольку они не ориентированы на проведение арбитражного количественного анализа. В настоящее время для идентификации и определения основных компонентов лекарственных форм чаще всего используют хроматографические методы, которые могут быть довольно сложны в плане предварительной пробоподготовки
Помимо контроля качества фармацевтических препаратов можно отметить
интерес исследователей к определению лекарственных соединений в различных
медико-биологических объектах, в частности, в биологических жидкостях и
тканях. Это объясняется усилением контроля за употреблением наркотических,
психотропных и допинговых препаратов у определенных категорий людей.
Основными аналитическими методами в этой области являются газовая и
высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектральным
детектированием. Эти методы, несмотря на их очевидные достоинства, требуют
использования сложной и дорогой аппаратуры, высококвалифицированного
персонала и, в связи с этим, не всегда доступны для рядовых аналитических
лабораторий и мониторингового контроля.
БИБЛИОТЕКА С.Петеї 09 «Ю.
Автор выражает искреннюю Рпщртпрттг'"ТТі тппгнту ^ф-прч ачат»тич»ГКг.д химии химического факультета МГУ, кх н ТВ ПоленэнРвШНАШММНЬв'ьИлйа^ис, поддержку,
помощь в работе и обсуждении результатов
3 *
Требуемую чувствительность и селективность определений могут обеспечить люминесцентные методы, которые при наличии простых и экспрессных методик вполне могут составить альтернативу хроматографическим методам.
Цель работы заключалась в изучении влияния различных факторов на спектрально-люминесцентные характеристики ряда лекарственных соединений на основе производных нафталина и азотсодержащих гетероциклических соединений, и разработке люминесцентных методик их определения в фармацевтических препаратах, а также в оценке возможности их люминесцентного определения в биологических жидкостях. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи-
1. Изучить спектрально-люминесцентные свойства двух групп
лекарственных соединений: производных нафталина и азотсодержащих
гетероциклических соединений.
-
Изучить протолитические свойства ряда лекарственных соединений в водной, мицеллярной и циклодекстриновой средах, оценить константы связывания соединений с мицеллами додецилсульфата натрия (ДСП) и /3-циклодекстрином (/?-ЦД).
-
Выбрать оптимальные условия люминесцентного определения изученных соединений в водной, мицеллярной и циклодексгриновой средах при комнатной температуре.
-
Сравнить возможности флуориметрического и фосфориметрическою методов для определения лекарственных соединений в фармацевтических препаратах и биологических жидкостях.
-
Разработать методики определения изученных лекарственных соединений в фармацевтических препаратах.
Научная новизна. Проведено сравнительное изучение протолитических свойств модельных лекарственных соединений в водной, мицеллярной и циклодекстриновой средах Получены количественные характеристики связывания изученных соединений с мицеллами ДСН и /?-ЦД при различных
значениях рН. Изучено влияние различных факторов на сигнал фосфоресценции модельных соединений при комнатной температуре в различных средах и определены времена жизни их триплетных состояний. Для празозина, пиндолола, фолиевой кислоты и тербинафина спектры фосфоресценции в растворах измерены впервые. Изучено влияние биологической матрицы на сигнал люминесценции модельных соединений в водном и мицеллярном растворах и показана принципиальная возможность их люминесцентного определения в моче и плазме крови человека без предварительного концентрирования и удаления матрицы.
Практическая значимость работы. Предложены методики люминесцентного определения ряда лекарственных соединений на основе производных нафталина и азотсодержащих гетероциклических соединений в лекарственных препаратах, в том числе и комбинированных. Предложен подход к определению модельных лекарственных соединений в плазме крови и моче человека на основе временной селекции сигналов фосфоресценции при комнатной температуре.
Положения, выносимые на защиту:
-
Результаты изучения спектрально-люминесцентных свойств двух групп лекарственных соединений- производных нафталина и азотсодержащих гетероциклических соединений в водной, мицеллярной и циклодекстриновой средах.
-
Результаты изучения протолитических свойств модельных лекарственных соединений в водной, мицеллярной и циклодекстриновой средах.
-
Количественные характеристики связывания изученных люминофоров с мицеллами ДСН и Р-ЦД и времена жизни триплетного состояния в этих средах.
-
Результаты исследования влияния различных факторов на величину сигнала фосфоресценции модельных соединений при комнатной температуре в различных средах.
-
Методики люминесцентного определения некоторых производных нафталина и азотсодержащих гетероциклических соединений в фармацевтических препаратах.
-
Подход к определению модельных лекарственных соединений в плазме крови и моче человека, основанный на временной селекции сигналов фосфоресценции при комнатной температуре
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на Международных конференциях студентов и аспирантов «Ломоносов 2002», «Ломоносов 2004» (Россия, Москва, 2002 и 2004 гг.) и международных симпозиумах «225th ACS National Meeting» (США, Новый Орлеан, 2003 г.), «Spectroscopy in special applications» (Украина, Киев, 2003 г.), «2nd Black Sea conference on analytical chemistry» (Турция, Стамбул, 2003 г.), «Приборостроение-2003» (Украина, Винница, 2003 г.) «Аналитика России» (Россия, Клязьма, 2004 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ: 3 статьи в открытой печати, 1 статья в сборнике и 6 тезисов докладов.
Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, выводов и списка литературы. Во введении обосновывается актуальность темы и цель работы, ее новизна и практическая значимость Первая глава обзора литературы посвящена основным направлениям развития фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ), вторая глава - современным методам определения лекарсівениьіх соединений в фармацевтических препаратах и биологических жидкостях, последующие главы содержат экспериментальные результаты. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного тексіа, включает 49 рисунков и 17 таблиц. Список литературы содержит 177 работ.
Основные факторы, влияющие на ФКТ
Внешнее возмущение тяжелых атомов было впервые описано в 1952 году [88]. В работе проводили исследование смеси 1-хлоронафталина и этилиодида и наблюдали увеличение интенсивности колебаний Ті - S0 перехода. На основании этого факта, автор сделал вывод о том, что присутствие в растворе молекул с большим атомным номером может сильно влиять на спин-запрещенные переходы. По-видимому, снижение интенсивности флуоресценции и связанное с ним возникновение фосфоресценции с ростом концентрации тяжелого атома являются результатом двух процессов: увеличения скорости интеркомбинационной конверсии из возбужденного синглетного в триплетное состояние и увеличения скорости излучательных переходов из триплетного состояния в синглетноосновное.
Поскольку присутствие тяжелого атома может влиять и на излучательные, и на безызлучательные синглет-триплетные переходы, увеличение квантового выхода фосфоресценции происходит не всегда. Даже когда заселение триплетних уровней увеличивается, параллельный безызлучательный распад триплета может также увеличиваться и таким образом конкурировать с фосфоресценцией. В литературе введены понятия «эффект внешнего» тяжелого атома и «эффект внутреннего» тяжелого атома. В последнем случае тяжелые атомы химически связаны с изучаемым соединением. Фосфоресценция галогенозамещенных ароматических соединений увеличивается в результате эффекта внутреннего тяжелого атома. Интенсивность фосфоресценции в этом случае увеличивается не только путем увеличения скорости интеркомбинационной конверсии из возбужденного синглетного в триплетное состояние, но и за счет сокращения дезактивационных столкновений. Ранее предполагали, что фосфоресценция при комнатной температуре является специфическим свойством ионов или полярных молекул, так как в тех же условиях неполярные молекулы вещества вещества и неионные формы фосфоресцировали слабо или не фосфоресцировали вовсе. Большинство работ [89, 90] включали в себя исследования фосфоресценции веществ, способных к диссоциации по кислотному или основному типу. Впервые фосфоресценцию при комнатной температуре неполярного соединения — пирена - наблюдали в присутствии иного тяжелого атома — нитрата серебра, нанесенного на бумагу [18].
Благодаря использованию тяжелых атомов на твердых сорбентах сигнал ФКТ был зарегистрирован и для других неполярных соединений: антрацена, бенз[а]пирена, карбазола фенантрена [18]. Установлено, что эффект воздействия тяжелого атома зависят от природы фосфорофора. Иодид натрия оказывает более существенное влияние на фосфоресценцию ионизированных молекул, но менее эффективен по отношению к неионизированным полиядерным ароматическим соединениям. Он является наиболее эффективным для триптофана, его метилового эфира и индола. Нитрат серебра, в свою очередь, является очень ффективным для полиядерных соединений, но проявляет менее существенный эффект по отношению к ионизированным формам. Эффект внешнего тяжелого атома играет исключительную роль в формировании фосфоресценции веществ, адсорбированных на твердой подложке, поскольку на поверхности сорбента, например, бумаги тяжелые атомы и растворенные молекулы могут занимать только промежутки между волокнами целлюлозы. Подобное пространственное ограничение увеличивает близость между тяжелыми атомами и молекулами люминофоров и тем самым обеспечивает более действенный эффект. Так, интенсивность фосфоресценции при комнатной температуре пирена, адсорбированного на бумаге, пропитанной ацетатом таллия, увеличивается почти на три порядка по сравнению с сигналом, полученным на необработанной подложке [5].
Использование в качестве источников «тяжелых атомов» различных солей для изучения ФКТ полиароматических углеводородов, адсорбированных на бумаге, показало, что интенсивность фосфоресценции увеличивается в ряду: Hg2+ Pb2+ Ag+ T1+[26, 91,92]. Другое исследование эффекта тяжелого атома [89] показало увеличение фосфоресценции ПАУ на поверхности в ряду F" СГ Вг" Г, т.е. более тяжелый галогенид индуцирует большее увеличение фосфоресценции. Авторами было найдено, что возмущения тяжелых атомов влияют на скорость излучательных процессов (например, фосфоресценции) больше, чем на скорость безызлучательных. Позднее эффект внешнего тяжелого атома стали широко использовать для возбуждения фосфоресценции при комнатной температуре в растворах. Дело в том, что большинство соединений в растворах даже в присутствии организованной среды имеют крайне низкий квантовый выход фосфоресценции. Поэтому наличие тяжелого атома в растворах является обязательным требованием для большинства соединений в мицеллярных, циклодекстриновых и водных растворах.
Например, фосфоресцентный сигнал Г -(2-цианоэтил)карбазола не возникает в 0.1 М растворе ДСН при комнатной температуре. Однако при замене 30 % ионов натрия в растворе на ионы таллия удается зарегистрировать интенсивный сигнал ФКТ [42]. Как правило, в водно-мицеллярных средах в качестве источника тяжелого атома используют нитрат таллия. Однако в работе [29] показано, что фосфоресценция в мицеллярных растворах возможна присутствии других солей одновалентного таллия. Положение и форма спектров фосфоресценции не зависят от природы аниона, а интенсивность фосфоресценции в присутствии сульфата ниже, чем в присутствии однозарядных анионов - ацетата и нитрата. Как отмечалось ранее, в водно-циклодекстриновых средах используются различные способы введения тяжелых атомов в раствор. Это могут быть модифицированные галогенсодержащие циклодекстрины, а также различные галогензамещенные спирты, углеводороды и другие соединения. В некоторых работах [87] упоминается об использовании различных неорганических солей, в
Основные методы определения лекарственных соединений в биологических матрицах
К основным методам, используемым для определения лекарственных препаратов в биологических жидкостях, относятся газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ/МС) и высокоэффективная жидкостная хроматография. Отдельно следует упомянуть скрининговые методы тонкослойную хроматографию и радиоиммунный анализ (РИА). Метод ГХ/МС отличается высокой селективностью. Он дает возможность проводить разделение и идентификацию основных веществ и их метаболитов. Другим достоинством ГХ/МС является высокая чувствительность. Возможности указанного метода для определения лекарственных веществ в различных биологических объектах подробно описаны в статьях и обзорах [114-117]. К недостаткам метода следует отнести высокую стоимость анализа и необходимость проводить дополнительную стадию — дериватизацию аналитов, которая увеличивает время пробоподготовки и погрешность определения. Высокоэффективная жидкостная хроматография, как правило, используется в сочетании с кулонометрическим, амперометрическим, флуориметрическим и масс-спектрометр ическим детектированием [118-123]. Метод ВЭЖХ/МС близок по чувствительности к методу ГХ/МС, но в отличие от последнего, не требует перевода анализируемых веществ в летучие и термостойкие формы. ВЭЖХ/МС является высокочувствительным и селективным методом идентификации соединений в биологических матрицах, но, тем не менее, мало распространен из-за высокой стоимости оборудования.
Кроме того, недостатком ВЭЖХ является недолговечность дорогих колонок и необходимость их регенерации. При анализе сложных биологических матриц часто наблюдается явление необратимой сорбции, которое приводит к невозможности регенерации. По этой причине перед проведением анализа методом ВЭЖХ, как правило, требуется сложная пробоподготовка. Радиоиммунный анализ достаточно экспрессен и обладает высокой чувствительностью. Однако метод требует дорогих реагентов — антител и антигенов, являющихся индивидуальными для каждого класса соединений [124]. В работе [125] показано, что часто выбранные антитела взаимодействуют не только с основным веществом, но и с его метаболитами, при этом определяемая концентрация получается суммарной. В связи с этим, РИА часто используют для скрининга. В качестве скрининг-метода также успешно применяется тонкослойная хроматография [126-130]. С появлением денситометров открылась возможность количественного определения лекарственных соединений в тонком слое. Наиболее важной и сложной задачей при анализе биологических матриц является подготовка изучаемого образца к анализу. Разнообразие биологических объектов — жидкостей, тканей и органов и изучаемых соединений - обусловливает специфику извлечения аналитов в каждом конкретном случае. Для определения биологически активных веществ в организме человека часто используются моча и кровь [114,131].
Указанные объекты имеют недостаток - лекарственные соединения метабилизируют в крови и быстро выводятся из организма человека с мочой. Следовательно, анализ биожидкостей характеризует только текущий процесс выведения вещества. Поэтому в последнее время некоторые исследователи обратились к использованию нетрадиционных объектов анализа - таких, как волосы, ногти и т. д. [132]. Однако главным недостатком этих объектов является сложность химического состава и низкое содержание изучаемых веществ в матрице. Извлечение аналитов из биожидкостей достигается за счет жидкость-жидкостной экстракции и твердофазной экстракции. Как правило, полученный экстракт содержит не только изучаемые соединения, но компоненты матрицы, жиры, биологически неактивные метаболиты. Их присутствие может отрицательно сказаться на результатах последующего определения. Многоступенчатая и длительная процедура очистки приводит к потерям соединения и не всегда эффективна. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что разработка экспрессных, экономичных и чувствительных методов определения лекарственных соединений в фармацевтических препаратах и биологических жидкостях является актуальной задачей. В настоящее время для идентификации и определения основных компонентов лекарственных форм чаще всего используют хроматографические методы, которые довольно сложны в плане предварительной пробоподготовки. В ряде случаев используют титриметрические методы, что сильно увеличивает время анализа. Требуемую чувствительность и селективность определений, на наш взгляд, могут обеспечить люминесцентные методы, которые при наличии простых и экспрессных методик вполне могут составить альтернативу вышеперечисленным методам. В связи с этим, очевидна необходимость изучения влияния различных факторов на спектрально-люминесцентные характеристики лекарственных соединений и разработки люминесцентных методик их определения в фармацевтических препаратах. В качестве модельных люминофоров в работе изучены представители двух классов органических соединений — азотные гетероциклические соединения и производные нафталина. Этот выбор обоснован тем, что гетероциклические соединения играют одну из ключевых ролей в процессах жизнедеятельности организма.
Благодаря своей высокой биологической активности они широко применяются в медицине для лечения различных заболеваний: более 60 % наиболее распространенных синтетических препаратов в качестве активного компонента содержат гетероциклические соединения [133]. Нами были выбраны следующие представители этого класса: дипиридамол, празозин, пиндолол и фолиевая кислота. Так, дипиридамол (ДИП) предложен в качестве антиангинального средства, расширяющего коронарные сосуды, увеличивающего объемную скорость коронарного потока и улучшающего снабжение миокарда кислородом. Празозин (ПРАЗ) является гипотензивным а-адреноблокирующим препаратом, применяемым при гипертонической болезни и сердечной недостаточности. Фолиевая кислота (ФОЛ) применяется при лечении лекарственной и радиационной анемии, лейкопении и др. Пиндолол (ПИН) относится к группе р-адреноблокаторов, действующих как на pi, так и на р2-адренорецепторы. Ослабляя влияние симпатической импульсации на Р-адренорецепторы сердца, они уменьшают силу и частоту сердечных сокращений [134]. В табл. 3 приведены структурные формулы изученных соединений и названия коммерческих препаратов, представленных на российском рынке, в состав которых входят изученные соединения. Соединения нафталинового ряда также используют в медицинской практике в качестве лекарственных препаратов. Так, нафазолин (НАФ) принадлежит к группе а-адреномиметических препаратов. Обладая сосудосуживающими свойствами, при нанесении на слизистые оболочки он оказывает противовоспалительное и противоотечное действие. Тербинафин (ТЕР) является
Выбор оптимальных условий сканирования спектров фосфоресценции на спектрофлуориметре «Панорама»
Производные нафталина и азотные гетероциклические соединения, обладают достаточно интенсивной флуоресценцией, регистрируемой даже для растворов с очень низкой концентрацией (с = 1,0-10 М). Регистрация фосфоресценции изученных соединений затруднена, поскольку интенсивность аналитического сигнала достаточно мала. Для измерения спектров фосфоресценции целесообразно использовать приборы с временной селекцией сигналов. В связи с этим требуется выбор оптимальных условий. Основными параметрами, позволяющими проводить временную селекцию сигналов, являются длительность строба измерения и время задержки строба измерения. На рис. З в качестве примера представлена зависимость интенсивности фосфоресценции раствора нафазолина от времени задержки строба измерения. Аналогичные зависимости получены для всех соединений. Оптимальной задержкой строба измерения выбрали 20 мкс, поскольку при ней регистрируется только спектр фосфоресценции. На рис. 4 представлена зависимость интенсивности фосфоресценции для раствора нафазолина от времени длительности строба. Очевидно, вид этой зависимости во многом будет определяться временем жизни люминофора. Оптимальные значения этого параметра подбирали для каждого соединения индвидуально. Жесткая структура производных нафталина и некоторых азотных гетероциклических соединений позволяет при комнатной температуре получать хорошо разрешенные спектры флуоресценции и фосфоресценции. В основе спектральной селекции при реализации флуориметрических и фосфориметричесюнх методик лежит использование различий в спектральных характеристиках исследуемых веществ и фона: длинах волн возбуждения и испускания. Для решения подобных задач удобно воспользоваться 3-х мерным представлением данных получившего в англоязычной литературе название emission-excitation spectra (EES) или emission-excitation matrix (EEM). Аналогией этих названий можно считать термин «спектры возбуждения-эмиссии» (ВЭ), который и будет использоваться в дальнейшем. Для построения ВЭ спектры флуоресценции и фосфоресценции измеряют при различных длинах волн возбуждающего излучения, а затем строят трехмерный график, на котором по оси z откладывают интенсивность, а по осям х и у длины волн возбуждающего и регистрируемого излучений.
Такой способ представления данных содержит в себе максимальное количество информации о люминофоре, включая абсорбционные и эмиссионные характеристики, а также направление максимального изменения сигнала, знание которого часто необходимо для реализации процедуры синхронного сканирования. Спектры флуоресценции и фосфоресценции растворов исследуемых люминофоров представлены на рис. 5-12. Как видно из рисунков, трехмерное представление легко позволяет выявить особенности спектральных характеристик. Выбор оптимальных значений длин волн возбуждения и регистрации индивидуальных соединений в этом случае в значительной степени упрощается. В табл. 4 представлены оптимальные значения длин волн возбуждения, а также значения длин волн в максимумах спектров флуоресценции и фосфоресценции, полученные на основе анализа спектров ВЭ. Подчеркнуты значения длин волн, соответствующих максимальной интенсивности аналитического сигнала. В дальнейшей работе их использовали для возбуждения флуоресценции и фосфоресценции определяемых соединений. Как показывает анализ литературы, спектры флуоресценции растворов большинства модельных соединений, изучены достаточно подробно [136-140].
Спектральные характеристики, полученные в настоящей работе, хорошо согласуются с литературными данными. Спектры фосфоресценции менее изучены. В литературе удалось найти данные лишь для растворов нафазолина [83], пропранолола [49], напроксена [84] и дипиридамсша [46]. Спектральные характеристики тербинафина, пиндолола, празозина и фолиевой кислоты впервые получены в настоящей работе. Отметим, что спектры фосфоресценции растворов производных нафталина весьма похожи между собой и характеризуются широкими полосами с двумя максимумами, что, по-видимому, обусловлено наличием в структуре соединений нафталинового кольца. Спектры фосфоресценции соединений, содержащих в своей структуре азотные гетероциклы, характеризуются широкой полосой с одним максимумом и имеют больше индивидуальных особенностей. Форма и положение полос в спектрах фосфоресценции большинства изученных люминофоров, измеренных в мицеллярной, водной и циклодекстриновой средах, практически не отличаются. Влияние среды окружения люминофора сказывается лишь на значениях абсолютной интенсивности сигнала ФКТ. В мицеллярной среде она на порядок выше. Для тербинафина, фолиевой кислоты и празозина в водной и циклодекстриновой средах спектры фосфоресценции зарегистрировать не удалось.
Определение констант связывания люминофоров с р-циклодекстрном
Окружение люминесцирующей молекулы сильно влияет на ее эмиссионные характеристики, что важно при разработке флуориметрических и фосфориметрических методик. Связываясь с различными органическими люминофорами и образуя своего рода защитную оболочку, молекулы циклодекстринов способны значительно увеличивать интенсивность их люминесценции. В последнее время особое внимание уделяется изучению возможности использования циклодекстринов в качестве защитных сред при определении содержания различных органических соединений методом фосфоресценции при комнатной температуре. Для изучения свойств окружения можно использовать термодинамический и кинетический подходы. Термодинамический подход базируется на анализе констант связывания, характеризующих способность участников реакции образовывать прочный комплекс.
Для некоторых соединений (например, напроксен и пиндолол) в литературе имеются данные о константах связывания с р-циклодекстрином [136, 137], для остальных соединений подобных сведений найти не удалось. В связи с этим представляло интерес исследовать процессы комплексообразования р4 циклодекстрина с изучаемыми органическими соединениями и определить константы связывания. Для определения состава комплексов и констант связывания применяются различные методы, основанные на изучении зависимости состав-свойство [152, 153]. При изучении комплексообразования люминесцентными методами в качестве аналитического сигнала используют интенсивность излучения. Наиболее широко используются методы расчета параметров комплексов на основе построения кривой насыщения. При взаимодействии люминофора (5) с молекулой /ї-циклодекстрина (ЦД) устанавливается равновесие характеризуемое константой Если концентрации люминофора и циклодекстрина равны соответственно С и Ст, выражение для константы равновесия можно привести к виду Последнее уравнение трансцендентно и для определения константы связывания Кщ используют линеаризацию или нелинейный метод наименьших квадратов. В настоящее время для определения констант связывания разработано несколько подходов [154-157]. Все они базируются на линеаризации уравнения (20) с использованием ряда допущений. Несомненным достоинством этих подходов является отсутствие необходимости построения всей кривой насыщения.
Так, например, в методе Бенеси-Гильдебранда с учетом предположения, что образуется комплекс состава 1:1, уравнение (20) преобразуется к виду где /о - интенсивность флуоресценции люминофора в отсутствие циклодекстрина, /щ - интенсивность флуоресценции люминофора полностью связанного в комплекс (соответствует горизонтальной асимптоте на кривой насыщения). При построении графика зависимости интенсивности флуоресценции от линия, свидетельствующая о том, что стехиометрия комплекса равна 1:1. Константа устойчивости комплекса определяется из отношения свободного члена и тангенса угла наклона полученной прямой. Константы связывания люминофоров с циклодекстрином определяли при различных значениях рН (величины рН были равны 2.4, 8.4 и 11.2). Измеренные зависимости интенсивности флуоресценции от рН в координатах - — представлены на рис. 17-24, Вычисленные значения коэффициентов корреляции свидетельствуют о том, что образующиеся комплексы имеют состав 1:1. Рассчитанные константы приведены в табл. 7. Как следует из таблицы, кислотность среды оказывает влияние на величины констант связывания наряду с такими факторами, как гидрофобность молекулы люминофора, соответствие геометрии циклодекстриновой полости размерам и пространственному расположению заместителей люминофора. Многие гетероциклические соединения (дипиридамол, фолиевая кислота и празозин) и напроксен образуют достаточно прочные комплексы с ft-циклодекстринами. Однако полного вхождения молекулы люминофоров в циклодекстриновую полость, по-видимому, не происходит.
Этот факт подтверждается не слишком высокими значениями констант связывания, а также малым влиянием циклодекстрина на кислотно-основные свойства этих соединений. Для пропранолола, нафазолина, пиндолола и тербинафина значительного связывания не наблюдается. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование циклодекстрина для усиления аналитического сигнала целесообразно, по-видимому, лишь в случае фосфориметрического определения напроксена. 0.ID
