Содержание к диссертации
Введение
1. Люминесцентные методы в аналитической химии 8
1.1. Люминесцентные методы определения лекарственных препаратов 8
1.2. Фосфоресценция при комнатной температуре 11
1.3. Основные факторы, влияющие на ФКТ 22
1.4. Распределение реагентов в водно-мицеллярных растворах 30
2. Анализ биологических объектов 35
2.1. Волосы как объект анализа 35
2.1.1. Пробоотбор и пробоподготовка 38
2.1.2. Извлечение из волос 42
2.2. Ногти как объект анализа. 45
2.3. Определение препаратов в моче человека. 48
3. Исходные вещества, аппаратура и техника эксперимента 51
3.1. Выбор модельных соединений 51
3.2. Исходные вещества и приготовление растворов 54
3.3. Аппаратура 56
4. Спектрально-люминесцентные характеристики изученных соединений 58
5. Изучение кислотно-основных свойств и распределения люминофоров в различных средах 69
5.1. Изучение кислотно-основных свойств в водной среде 69
5.2. Изучение кислотно-основных свойств в мицеллярной среде 81
5.3. Определение констант связывания люминофоров с мицеллами 84
5.4. Изучение образования хелатов фторхинолонов с ионами металлов 104
6. Определение активных компонентов исследуемых соединений в биологических объектах и тканях 107
6.1. Флуориметрическое определение фторхинолонов в фармацевтических препаратах 107
6.2. Флуориметрическое определение фторхинолонов в моче 109
6.3. Определение лекарственных препаратов в волосах человека 115
6.4. Определение противогрибковых препаратов в ногтях. 129
Выводы 132
Литература 134
- Фосфоресценция при комнатной температуре
- Извлечение из волос
- Исходные вещества и приготовление растворов
- Определение констант связывания люминофоров с мицеллами
Введение к работе
Актуальность работы. В последнее время резко возрос интерес исследователей к определению лекарственных соединений в различных медико-биологических объектах, таких, как биологические жидкости и ткани. Это становится особенно актуально в связи с усилением контроля над злоупотреблением наркотических, психотропных и допинговых препаратов у отдельных групп людей. Традиционно, основными методами аналитического контроля в этой области являются газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектральным детектированием. Однако, несмотря на их очевидные достоинства, эти методы требуют использования сложной и дорогой аппаратуры, высококвалифицированного персонала и, в связи с этим, не всегда доступны для рядовых аналитических лабораторий и мониторингового контроля.
При анализе биообъектов значительное внимание уделяется плазме крови и моче человека, тогда как часто более подходящими объектами могут являться биологические ткани - волосы и ногти человека, поскольку они обладают свойством накапливать вещества в течение длительного времени и, следовательно, являются более информативными объектами при долгосрочном потреблении препарата.
Помимо этого, одной из актуальных задач в фармацевтике в настоящее время является выявление фальсифицированных препаратов, поскольку современные рынки заполнены продукцией, качество которой часто не отвечает требуемым стандартам. Как правило, такие препараты представляют угрозу тем, что активные компоненты находятся в них в гораздо меньших, а, следовательно, терапевтически неэффективных количествах. Кроме того, в ряде случаев в составе подобных препаратов могут полностью отсутствовать компоненты, заявленные производителем. В связи с ростом количества' фальсификатов особую важность приобретает разработка экспрессных методов их анализа. Тест-методы, несмотря на их привлекательную экспрессность и простоту, не решают полностью проблему контроля лекарственных препаратов, поскольку изначально не ориентированы на проведение арбитражного .количественного анализа. Чаще всего для идентификации и определения основных компонентов лекарственных форм в
настоящее время используют хроматографические методы, которые довольно сложны в плане предварительной пробоподготовки.
Люминесцентные методы, с учетом их относительной простоты и дешевизны аппаратуры, вполне могут обеспечить требуемую чувствительность и селективность определений, что позволяет рассматривать их в качестве альтернативы хроматографическим методам.
Цель работы заключалась в изучении влияния различных факторов на спектрально-люминесцентные характеристики ряда лекарственных соединений на основе производных нафталина и фторхинолонов, и разработке подходов к люминесцентному определению их в фармацевтических препаратах и моче, волосах и ногтях человека. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить спектрально-люминесцентные свойства представителей выбранных классов лекарственных соединений - производных нафталина и фторхинолонов.
Изучить протолитические свойства выбранных соединений в водной среде и средах, содержащих различные поверхностно-активные вещества, оценить константы связывания соединений с мицеллами ПАВ различными методами.
Выбрать оптимальные условия люминесцентного определения изученных соединений в водной и мицеллярной средах при комнатной температуре.
Разработать методику определения фторхинолонов в фармацевтических препаратах.
Оценить возможность люминесцентного определения активных компонентов изучаемых фармацевтических препаратов в таких биологических объектах, как моча, волосы и ногти человека.
Научная новизна. Проведено сравнительное изучение протолитических свойств выбранных лекарственных соединений в водной и мицеллярной средах. Получены количественные характеристики связывания изученных соединений с мицеллами катионных и анионных ПАВ при различных значениях рН методами тушения собственной флуоресценции и Бенесси-Гильдебрандта. Разработана методика флуориметрического определения фторхинолонов в фармацевтических
препаратах. Изучено влияние биологической матрицы на сигнал люминесценции выбранных соединений в водной и водно-мицеллярной средах, изучены факторы, влияющие на экстракцию целевых соединений из матрицы волос и показана принципиальная возможность их определения в моче, волосах и ногтях человека люминесцентными методами.
Практическая значимость работы. Разработана методика флуоресцентного определения лекарственных соединений ряда фторхинолонов в фармацевтических препаратах. Предложены различные подходы к определению лекарственных соединений в моче, волосах и ногтях человека с использованием синхронной флуориметрии и фосфоресценции при комнатной температуре.
Положения, выносимые на защиту:
Результаты изучения спектрально-люминесцентных свойств лекарственных соединений на основе производных нафталина и фторхинолонов в водной и водно-мицеллярных средах.
Результаты изучения протолитических свойств выбранных лекарственных соединений в водной и водно-мицеллярных средах.
Количественные характеристики связывания изученных люминофоров с мицеллами анионных и катионных ПАВ, измеренные методами тушения собственной флуоресценции и Бенесси-Гильдебрандта.
Оценки влияния различных факторов на величину сигнала фосфоресценции при комнатной температуре лекарственных препаратов на основе нафталиновых производных в различных средах.
Методика флуоресцентного определения фторхинолонов в фармацевтических препаратах.
Способы определения лекарственных соединений в моче, волосах и ногтях человека, основанные на применении различных методов люминесцентной спектроскопии.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на международных конференциях студентов и аспирантов "Ломоносов 2004", "Ломоносов 2005" (Россия, Москва, 2004 и 2005 гг.) и международных симпозиумах "International congress on analytical sciences, ICAS 2006" (Россия, Москва, 2006 г.), "4th Black Sea conference on analytical chemistry" (Болгария,
Солнечный берег, 2007 г.), "Аналитика России" (Россия, Клязьма, 2004 г.), "Аналитика России" (Россия, Краснодар, 2007 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ: 3 статьи в открытой печати и 9 тезисов докладов.
Фосфоресценция при комнатной температуре
Люминесцентные методы, в основе которых лежит регистрация сигнала флуоресценции довольно долго используются в аналитической практике. Основные методики флуориметрического определения разных веществ, в том числе и лекарственных препаратов, хорошо изучены теоретически и отработаны на практике. Менее изученным направлением развития люминесцентных методов является фосфориметрия. Ранее измерение фосфоресценции проводили только в криогенных условиях, что являлось существенным недостатком метода, и он относительно редко использовался для аналитических целей. Фосфоресценция, наблюдаемая при комнатной температуре, нашла широкое применение в анализе, лишь начиная с 90-х годов прошлого века. Таким образом, фосфориметрия - метод сравнительно молодой, часто использующийся не только в качестве метода детектирования в комбинированных методах анализа, а как самостоятельный метод определения. Этот метод обладает рядом достоинств, позволяющих ему успешно конкурировать с традиционными вариантами флуориметрии. Однако для реализации метода требуется выполнение определенных условий, которые заслуживают более детального рассмотрения. Фосфоресценция - это излучательный Ті — S0 переход между состояниями различной мультиплетности, тогда как при флуоресценции происходит переход между состояниями одинаковой мультиплетности. Теоретически подобные переходы запрещены, однако в действительности они имеют место вследствие спин-орбитального взаимодействия. Низкая вероятность Ті —» S0 перехода приводит к тому, что излучательное время жизни фосфоресценции велико (10"4 - 100 с) по сравнению с временами жизни флуоресценции (10"8 - 10"6 с). Поэтому триплетные молекулы могут легко терять свою энергию в различных безызлучательных процессах. [15] Фосфоресценция наблюдается как в газах и жидкостях, так и в твердых телах. Однако из-за длительного времени жизни триплетного состояния, при повышенных температурах, тушение свечения за счет межмолекулярных столкновений и внутримолекулярной безызлучательной релаксации становится доминирующим.
Известны несколько путей уменьшения вклада дезактивационных процессов. Один из таких путей - измерение фосфоресценции в газовой фазе при достаточно низких давлениях, этот способ приводит к уменьшению столкновений излучающих молекул. Также тушение триплетного состояния кислородом можно уменьшить, поместив молекулы в атмосферу инертного газа. Использование фосфоресценции в парообразном состоянии для аналитических целей, по-видимому, нецелесообразно в силу ограниченности круга анализируемых объектов и сложности аппаратурного оформления. В жидких средах при комнатной температуре доля процессов, приводящих к быстрой безызлучательной дезактивации триплетного состояния, также велика. Растворенный кислород и процессы интеркомбинационного тушения значительно подавляют фосфоресценцию. Даже в тщательно дегазированных и очищенных от примесей растворах квантовый выход фосфоресценции весьма мал. Одним из способов ограничения безызлучательной дезактивации является иммобилизация триплетной молекулы в жесткой среде. Подобную жесткую матрицу обычно получают при довольно низких температурах [16]. Этот путь, увеличивающий квантовый выход фосфоресценции, имеет и ряд недостатков, связанных с плохой воспроизводимостью криогенных измерений. Другими способами иммобилизации излучающей молекулы являются капсулирование ее в полимерные матрицы [17, 18], стекла [19], волокна кератина [20], пленки поливинилового спирта и т.д. Этот путь, несмотря на весьма сложную процедуру пробоподготовки, по-видимому, вполне может быть положен в основу разработки методик количественного анализа с использованием фосфоресценции. В табл. 1 приведен список различных сред, предназначенных для иммобилизации излучающих молекул, при измерениях фосфоресценции. Таблица 1. Образцы сред, используемых для регистрации сигнала ФКТ. сорбентов.
В работе [21] исследовали фосфоресценцию при комнатной температуре для различных органических люминофоров на подложках целлюлозы и объясняли возникновение фосфоресценции протеканием различных процессов на поверхности подложки. Авторами [22, 23] также исследовалось явление фосфоресценции при комнатной температуре на различных подложках, включая кварц, алюминий, бумагу и асбест, и было найдено, что адсорбционное состояние молекул в твердом веществе обеспечивает жесткость, требуемую для уменьшения подавляющих свечение столкновений и предотвращает безызлучательную дезактивацию триплетных молекул. При исследовании сухого порошка чистой соли или выросших в растворе кристаллов, фосфоресценция замечена не была, что подчеркивало валеную роль адсорбированного состояния. Ионная природа анализируемых молекул часто является немаловажным фактором в генерации фосфоресценции. Например, не наблюдалось фосфоресценции при комнатной температуре при исследовании такого вещества, как 2-нафтол, адсорбированный на бумаге, хотя это вещество имеет полярную гидроксилыгую группу. Однако для ионной формы того же самого вещества была зарегистрирована интенсивная фосфоресценция [24].
Значительная роль водородных связей в генерации фосфоресценции при комнатной температуре полярных органических соединений, адсорбированных на бумаге, была иллюстрирована уменьшением или даже отсутствием сигнала ФКТ для соединений, не способных образовывать водородные связи из-за внутримолекулярных водородных связей, комплексообразования полярных групп с ионами металлов или молекулярных стерических ограничений. Например, 2-нафтоллят натрия возбуждал сильную фосфоресценцию, будучи адсорбированным на бумаге, но натриевая соль хелатообразующего агента - 1-нитрозо-2-нафтола - не давала фосфоресценции [25]. В то время, как полярные или ионные молекулы показывали интенсивный фосфоресцентный сигнал при комнатной температуре, будучи нанесенными на твердую поверхность из растворов, содержащих значительный избыток сильной кислоты или основания, неполярные соединения или вовсе не возбуждали фосфоресценции, или возбуждали чрезвычайно слабый фосфоресцентный сигнал, даже из кислых или щелочных растворов. Незначительные изменения в
Извлечение из волос
Известны два способа извлечения из волос: экстракция (без разложения матрицы) и вскрытие. Способ и условия обработки волос следует подбирать так, чтобы обеспечивалось как можно более полное извлечение препарата из матрицы, и, что особенно важно, не происходила деструкция этого впрепарата. В первом способе в качестве экстрагентов обычно используют кислоты или какие-либо органические растворители (как правило, спирт) при комнатной температуре [131]. Экстракция из волос спиртом была впервые предложена в 1979 г. Обычно для нее используют метиловый спирт, иногда - этанол [132, 133], обработка спиртом требует довольно длительного времени (от 12 до 18 ч) и невысоких температур (до 37 С) [134, 135]. В некоторых работах можно встретить экстракцию спиртом при более сильном нагревании [136, 137] или в ультразвуковой ванне [138, 139]. При подобной дополнительной обработке экстрактов ультразвуком и повышении температуры до 60 С время десорбции веществ из матрицы снижается до двух часов. Кислотную обработку обычно проводят соляной кислотой. Большинство исследователей используют 0.05 - 0.1 М раствор кислоты при слабом нагревании (45 - 56 С). В данном случае время обработки составляет примерно 16 - 18 часов [121, 140]. Увеличение температуры до 80 - 100 С, а концентрации кислоты до 2 М, согласно работам [118, 141], снижает время извлечения до 30 - 60 мин. В отдельных случаях, когда имеют дело с легко гидролизующимся в ходе экстракции веществом (например, 6-ацетилморфином), используют трифторуксусную кислоту [135]. В работе [142] для экстракции органических соединений использовали продолжительное (около 24-х часов) вымачивание волос в водных растворах, например, в солевом растворе додецилсульфата натрия, однако подобный способ может являться скорее исключением, чем правилом. Несколько чаще используется фосфатный буфер с нейтральным рН [124, 143], и иногда для извлечения эндогенных веществ просто промывают волосы несколько раз теплым буферным раствором [124]. Альтернативой классическим методам экстракции веществ из биологических матриц является метод сверхкритической флюидной экстракции (СФЭ), интерес к которому возник сравнительно недавно. Впервые использование сверхкритического флюида для извлечения препаратов из волос было показано в работе [144].
Преимуществами данного метода являются следующие: - требуемую селективность экстракции можно получить путем варьирования таких параметров, как давление, температура, концентрация, природа флюида и модификатор; прекрасные диффузионные качества флюидов обеспечивают быстрое проникновение и извлечение из образца; - экстракция в области низких температур позволяет извлекать термически лабильные соединения без разложения. [145] Среди используемых в СФЭ флюидов более всего популярен диоксид углерода из-за его нетоксичности, невоспламенимости и дешевизны. Из-за того, что диоксид углерода является слабополярным флюидом, извлечение соединений, прочно связанных с матрицей, затруднено. Впрочем, эту проблему вполне решает добавление к сверхкритическому флюиду органических растворителей-модификаторов, например, этилацетата и метанола [118, 130, 146]. Однако широкому применению этого метода мешает высокая стоимость его оборудования. При вскрытии (полном разложении) матрицы волос используется щелочная и ферментативная обработка. Поскольку щелочная обработка приводит к разрушению белковой матрицы волос, ее следует проводить в более жестких условиях, чем кислотную. В случае щелочного вскрытия используют 1 М, 2 М NaOH [115, 122, 123] и нагревание при 80 — 100 С. Время выдерживания образцов при вскрытии щелочью, как правило, меньше, чем при использовании кислоты - оно редко достигает 12 часов (если процесс идет при 37 С) [147]. Для последующего анализа, если это необходимо, щелочной экстракт нейтрализуют эквимолярным количеством кислоты и фосфатным буферным раствором. Ферментативная процедура впервые описана в работе [148], где использовали проназу в буферном растворе. Поскольку проназа не может полностью разрушить матрицу волоса, в работе [149] для разрыва S-S связей ) матрицы перед ферментативной обработкой использовали муравьиную кислоту. Такой способ позволял растворить волосы практически целиком или с остатком менее 5 %. Новый метод ферментативного разложения был предложен в работе [150], здесь образец волос растворяли в протеиназе К и дитиотреитоле для разрушения дисульфидных связей. Ферментативное извлечение веществ из волос обычно проводится в интервале температур 20 - 45 С, и время инкубации составляет от нескольких часов до суток.
Помимо уже упомянутых ферментов используют каталазу, арилсульфотазу и некоторые другие. Так или иначе, выбор способа извлечения должен прежде всего определяться природой анализируемых соединений. Однако единого мнения по этому вопросу в рассмотренной литературе не встречается. Например, известны случаи, когда для извлечения морфина и его производных из матрицы волос, применяли не только щелочную деструкцию [135, 151, 152], но и мягкую обработку спиртом [135, 153] либо буфером при слабом (37 С) нагревании [124, 154]. В то же время кокаин довольно легко переходит в экгонин и хорошо экстрагируется органическими растворителями [141, 147, 153], авторы работ [122, 155] извлекали его из волос с помощью кислоты или щелочи при нагревании. Можно сделать вывод, что органические ксенобиотики извлекают из волос различными способами, и только некоторые из них приводят к полному разрушению волоса. Впрочем, было доказано экспериментально, что полное разложение волос не является необходимым условием. В рассмотренных работах для сравнения эффективности различных способов экстракции из волос можно найти главным образом три приема: - сравнение абсолютных количеств вещества, извлеченного из одного и того же образца различными способами [118, 156, 157] ; - определение степени извлечения [142]; - расчет процентной доли от максимального извлечения [119, 125, 130, 132, 152]. Обширные межлабораторные исследования показали, однако, что ни один из упомянутых способов не обеспечивает постоянство результатов [158] и потому дать однозначную оценку эффективности того или иного способа извлечения по литературным данным не представляется возможным. Ногти являются сравнительно новыми и довольно перспективными биологическими объектами анализа. Ноготь состоит из трех основных частей: пластинки, ложа и матрикса. На отдаленном участке ногтевая пластинка отходит от ногтевого ложа у гипонихиума (рис. 2). Эпителий ногтевого ложа состоит из нескольких клеточных слоев и имеет протяженность от лунки до гипонихиума. Ногтевое ложе может составлять около одной трети толщины окончательной ногтевой пластинки. Дорсальная и
Исходные вещества и приготовление растворов
В качестве модельных соединений в работе использовали дипиридамол, пиндолол, пропранолола гидрохлорид (Wako, Япония), нафтидрофурила оксалат и тербинафина гидрохлорид (Sigma, США), ципрофлоксацина гидрохлорид, норфлоксацин, ломефлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин (Sigma, США), экзодерил (раствор, содержание нафтифина 10 мг, Биохеми, Австрия). Кроме того, в работе были использованы додецилсульфат натрия, сульфит натрия, нитрат таллия и иодид натрия (Acros, Германия), иодид аммония (Реахим), гидроксид натрия (о.с.ч.), соляная кислота (о.с.ч.), цетилтриметиламмоний бромистый (Sigma, США), Тритон Х-100 (Sigma, США), гексан (х.ч.). Растворы модельных соединений готовили растворением точных навесок в воде. Исходные водные растворы имели концентрацию 3,1-10"4М по основному веществу, для приготовления растворов использовали дистиллированную воду. Приготовленные растворы хранили в темном месте не более 1 недели во избежание фотохимического разрушения соединений. Рабочие растворы готовили разбавлением исходных растворов в соответствующей среде непосредственно перед проведением эксперимента. Исходный раствор нафтифина концентрацией 3,1-10"4М готовили разбавлением раствора экзодерила, содержащего 10 мг активного компонента. Исходные растворы додецил сульфата натрия с концентрацией 0,1 М (для фосфориметрических измерений) и 1 М (для измерений констант связывания с мицеллами) готовили растворением соответствующей навески в воде. В дальнейшей работе такие растворы называли водно-мицеллярными или, сокращенно - мицеллярными. Исходный раствор бромида триметилцетиламмония с концентрацией 0,5 М готовили растворением соответствующей навески в воде. Раствор Тритона Х-100 с концентрацией 0,5 М готовили разбавлением исходного вещества Тритон Х-100 в ультразвуковой ванне при нагревании.
Исходный раствор нитрата таллия с концентрацией 0,25 М готовили растворением соответствующей навески в воде в ультразвуковой ванне в течение нескольких часов. Раствор сульфита натрия с концентрацией 0,1 М готовили растворением соответствующей навески в воде непосредственно перед измерением. Так же растворы йодида натрия (1 М) и йодида аммония (1 М) готовили растворением точной навески в воде непосредственно перед измерением. Раствор NaOH с концентрацией 1 М готовили растворением точной навески в воде. Раствор НС1 с концентрацией 1 М готовили разбавлением 2 N кислоты из фиксанала. При изучении кислотно-основных равновесий флуориметрическим методом концентрация ДСН составляла 2,0-10" М, бромида триметилцетиламмония -2,0-10"2 М, Тритона Х-100 - 1,0Т0"2М. Необходимое значение рН устанавливали с помощью 0,1 М растворов гидроксида калия и соляной кислоты. При определении констант связывания по методу тушения с йодидом концентрация ДСН составляла 1,5-10"2М. Иодид натрия (в случае фторхинолонов и азотосодержащих гетероциклических соединений) и йодид аммония (в случае нафталиновых производных) добавляли в раствор так, чтобы конечные концентрации йодида в растворе составили 0.05, 0.1, 0.2, 0.3 и 0.4 М. При определении констант связывания по методу Бенесси-Гильдебранда концентрации ДСН и ЦТМАБ варьировались в диапазоне 5-10-5-10" М. Кислотность среды регулировали с помощью 0.1 М растворов соляной кислоты и гидроксида калия. Для измерения сигнала ФКТ в мицеллярной среде порядок приготовления анализируемого раствора был следующий. В мерную колбу вместимостью 10,0 мл помещали 0,1 мл исходного раствора люминофора, 2,0 - 2,5 мл 0,1 М раствора ДСН в зависимости от соединения, 0,5 - 0,6 мл 0,25 М раствора ТПЧОз в зависимости от соединения, 0,5 мл 0,1 М раствора сульфита натрия и доводили до метки водой. Колбу с полученным раствором помещали в УЗВ (t = 30 - 35 С) на 5 10 мин.
После ультразвуковой обработки растворы выдерживали при комнатной температуре в течение 5 мин, затем производили измерения. Для изучения экстракции препаратов в гексан готовили растворы препаратов концентрацией ЗД-10"5 М и проводили экстракцию в гексан при различных значениях рН. Кислотность среды регулировали с помощью 0,1 М растворов гидроксида калия и соляной кислоты. С целью изучения возможности использования люминесцентных методов для определения препаратов в волосах человека использовали образцы волос, полученные от четырех добровольцев. Для извлечения исследуемых веществ из матрицы волос навески волос m = 100 мг растворяли в 5 мл 1М NaOH в ультразвуковой бане в течение 120 мин. при t = 40C. Для извлечения исследуемых веществ из матрицы ногтей навески ногтей m = 100 мг. растворяли в 5 мл 1М NaOH в ультразвуковой бане в течение 120 мин. при t = 40C. 3.3. Аппаратура Спектры люминесценции растворов лекарственных препаратов измеряли на спектрофлуориметре «Shimadzu RF-5301» (Япония) при скорости сканирования 1 нм/с. Спектральная ширина щели монохроматора составляла 3 нм для пропранолола, 10 нм для тербинафина, нафтифина и норфлоксацина и 5 нм для остальных модельных соединений. Для измерения использовали кварцевые кюветы (/=1см). Спектры фосфоресценции растворов измеряли на спектрофлуориметре «Панорама» (фирма «Люмэкс», Россия). Для измерения использовали кварцевые кюветы (/ = 1 см). Время задержки строба измерения составляло 30 мкс. Ультразвуковую обработку растворов проводили с использованием ультразвуковой ванны (Bransonic, США). Значения рН растворов контролировали на универсальном ионометре ЭВ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ 43-07. Массы навесок определялись на аналитических весах (Ohaus, Switzerland) Для проведения микрожидкостной экстракции использовали специальный микроэкстрактор (J&W Scientific, США).
Определение констант связывания люминофоров с мицеллами
На излучательные характеристики люминофора значительно влияет его окружение. Люминесцирующая молекула, будучи помещенной в среду поверхностно-активного вещества, заключается в мицеллу, предохраняющую ее от потерь энергии при столкновениях, что увеличивает интенсивность наблюдаемого свечения. Подбор оптимальной организованной среды является важным этапом при разработке новых люминесцентных методик. Для изучения свойств окружения можно использовать термодинамический и кинетический подходы. Термодинамический подход базируется на анализе констант связывания, характеризующих способность участников реакции образовывать прочный комплекс. Известно, что малополярные незаряженные молекулы, в частности полиароматические углеводороды, практически полностью солюбилизируются в мицеллах [188]. Имеются данные, например, что для молекулы нафталина константа связывания составляет 3,68-105 [189]. Однако, все соединения, изучающиеся в настоящей работе, имеют в своей структуре полярные заместители и поэтому их нельзя рассматривать как полные аналоги ПАУ в части поведения в водно-мицеллярных системах. Существуют литературные данные о константах связывания с додецилсульфатом натрия для пропранолола [182], дипиридамола [177, 182], пиндолола [182], тербинафина [182] и ломефлоксацина [190]. Литературных данных о константах связывания остальных соединений в ДСН, равно как и данных о характеристиках связывания в средах других ПАВ для изученных соединений найти не удалось. При изучении комплексообразования люминесцентными методами в качестве аналитического сигнала используют интенсивность излучения. Существуют различные методы для определения состава комплексов и констант связывания [191]. Одним из таких методов является определение констант связывания люминофоров с мицеллами ПАВ по тушению быстрой флуоресценции люминофоров молекулами, имеющими заряд, одноименный с зарядом мицеллы. При определении констант связывания исследуемых соединений в среде додецилсульфата натрия в качестве тушителя был выбран иодид-ион. Поскольку скорости входа в мицеллу и выхода из нее молекул люминофора ниже, чем скорость дезактивации синглетных состояний, то флуоресценция молекул люминофора, находящихся в мицелле, затухает независимо от присутствия тушителя в водной фазе со скоростью l/t/m .
Интенсивность флуоресценции if в отсутствие тушителя Q описывается уравнением где - IfiV интенсивность флуоресценции в водной фазе, Ifm интенсивность флуоресценции в мицеллярной фазе, а и Ъ — доли люминофора в мицеллах и воде {а + Ъ =1). Интенсивность флуоресценции в присутствии тушителя Подставляя написанные выше уравнения в уравнение Штерна-Фольмера, получаем где kq - константа тушения; г , - время жизни флуоресценции пробы в воде в отсутствие тушителя; 1 и Ifw - интенсивности флуоресценции исследуемых соединений в. отсутствии и в присутствии тушителя соответственно; [Q] -равновесная концентрация тушителя. Из зависимости от 1/[Q], зная - -, находят отношение а/Ь, а затем константы связывания: где а и Ъ это доли люминофора в мицеллах и воде (а + Ъ = 1); М - концентрация мицелл. Предполагается, что только одна молекула люминофора входит в мицеллу. Нарис. 25-35 представлены зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя, полученные для исследуемых соединений. Рассчитанные значения констант связывания люминофоров с мицеллами ДСН при различных значениях рН представлены в табл. 6. Очевидно, во всех средах происходит достаточно сильное связывание изученных соединений с мицеллами додецилсульфата натрия. Различия в значениях констант, по-видимому, можно связывать с электростатическим взаимодействием заряженных групп в молекулах исследованных соединений при вхождении в анионные мицеллы. Поскольку йодид-ион заряжен отрицательно, он не может использоваться как тушитель в средах катионных и неионных ПАВ. Потому измерение констант связывания в этих средах данным методом не проводилось.
![Нейросетевой динамический анализ биологических тканей и жидкостей [Электронный ресурс]](/i/i/4396/168329.png "Нейросетевой динамический анализ биологических тканей и жидкостей [Электронный ресурс] Янкина Наталья Николаевна")