Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структура кариотипа в фокусе проблем таксономии 12
1.1. Краткая характеристика объектов исследования 12
1.1.1. Сведения по биологии серых хомячков надвидового комплекса Cricetulus barabensis 12
1.1.2. Сведения по биологии крысовидных хомячков рода Tscherskia 13
1.1.3. Сведения по биологии пищух рода Ochotona 14
1.2. Цитогенетические характеристики в изучении мелких млекопитающих
1.2.1. Кариологическая изученность хомячков Cricetulus barabensis и C. pseudogriseus 16
1.2.2. Структура кариотипа и замечания по систематике Tscherskia triton
1.2.3. Внутриродовая структура и цитогенетическая характеристика рода, Ochotona 30
1.3. Гетерохроматин: структура, функции и роль в изменчивости, кариотипа 44
1.3.1. Свойства, структура и функции гетерохроматина 46
1.3.2. Содержание гетерохроматина как цитогенетический признак и его значение в эволюции кариотипа 52
1.4. Методы цитогенетических исследований 54
Глава 2. Материал и методы исследования 59
2.1. Материал исследования 59
2.2. Методы цитогенетического анализа 64
2.2.1. Приготовление хромосомных препаратов из клеток красного костного мозга 64
2.2.2. Рутинное окрашивание 66
2.2.3. Дифференциальное C-окрашивание 66
2.2.4. Ag-NOR-окрашивание ядрышкообразующих районов 66
2.2.5. Дополнительные методы, использованные в работе 68
Глава 3. Результаты и обсуждение 69
3.1. Степень цитогенетических различий и уровень дивергенции молодых видов на примере хомячков Cricetulus barabensis и C. pseudogriseus 69
3.1.1. Рутинное окрашивание хромосом C. barabensis 69
3.1.2. С-окрашивание хромосом C. barabensis 71
3.1.3. Рутинное окрашивание хромосом C. pseudogriseus 75
3.1.4. С-окрашивание хромосом C. pseudogriseus и сравнительный анализ кариотипов C. barabensis и C. pseudogriseus 75
3.2. Единообразие кариотипов у подвидов Tscherskia triton из изученных локалитетов Приморского края 81
3.3. Кариологические особенности пищух и дополнение внутриродовой системы рода Ochotona 85
3.3.1. Первоописание кариотипа O. huangensis и уточнение цитогенетических границ между подродами Pika и Ochotona 85
3.3.1.1. Цитогенетическое описание пищухи O. huangensis 85
3.3.1.2. Сравнительный анализ кариотипов O. huangensis и O. alpina 92
3.3.1.3. Сравнительный анализ кариотипов O. huangensis и O. dauurica
3.3.2. Диагностика пищух O. hyperborea государственного заповедника «Бастак» с использованием цитогенетических методов 96
Заключение 104
Выводы 107
Список литературы
- Сведения по биологии пищух рода Ochotona
- Внутриродовая структура и цитогенетическая характеристика рода, Ochotona
- Дифференциальное C-окрашивание
- Единообразие кариотипов у подвидов Tscherskia triton из изученных локалитетов Приморского края
Введение к работе
Актуальность исследования. Большинство таксонов выделено по морфологическим признакам. Развитие биохимических и генетических методов анализа породило в зоологии множество новых вопросов и идей о видообразовании, неравномерности эволюции на различных уровнях организации и соответственно видовых критериях (Воронцов, 1999, 2004; Лашин и др., 2012). При формировании новых взглядов на систематику возникает вопрос о сопоставлении результатов, полученных различными методами. Нередко происходит пересмотр родственных отношений и ревизия таксономии многих групп животных. Кариологические исследования остаются актуальными, так как рассматривают организм на своем особом уровне. Кариологические характеристики являются хорошим диагностическим и, следовательно, таксономическим признаком для многих видов животных. Методы кариологического анализа применяют для распознавания близкородственных видов и видов-двойников, выявления сходства и родства видов внутри рода, а также оценки эволюции кариотипа (Matthey, 1973).
В некоторых группах млекопитающих значительную роль может играть хромосомное видообразование (Воронцов, 1999). Эволюционные преобразования хромосом могут приводить к генетической изоляции и к расхождению близких форм (Ларкин, 2007). Поэтому изучение меж- и внутривидовой хромосомной изменчивости позволяет проследить генетическую дифференциацию таксонов в процессе видообразования (Лухтанов, Кузнецова, 2009; White, 1973; Zima, 2000).
В связи с этим, нами выбрано несколько групп мелких млекопитающих, проблематика которых сочетает таксономические и цитогенетические аспекты. Эти группы активно исследуются морфологическими и молекулярно-генетическими методами, что позволяет нам провести актуальное исследование методами кариосистематики, в рамках комплексного подхода. Рассмотренные нами виды родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona имеют обширные ареалы, в том числе, на Дальнем Востоке России, где они малочисленны и недостаточно изучены в плане границ распространения, внутривидового разнообразия и цитогенетической изменчивости. Также эти виды являются носителями опасных инфекционных заболеваний человека. Поэтому изучение хромосомной изменчивости необходимо для выяснения внутривидовой структуры, которая может быть связана с природной циркуляцией различных штаммов патогеннов.
Степень разработанности темы. Хомячки надвида Cricetulus barabensis морфологически слабо дифференцируются, но имеют различную структуру кариотипов: C. barabensis 2n=20, NF=38, C. griseus 2n=22, NF=38, C. pseudogriseus 2n=24, NF=38, C. sokolovi 2n=20, NF=40 (Орлов, Малыгин, 1988; Громов, Ербаева, 1995; Картавцева, 2002а). Их таксономический статус остается дискуссионным. Результаты краниометрии показали самостоятельность C. sokolovi, остальные кариоформы отнесены к подвидам C. barabensis (Лебедев, Лисовский, 2008). По молекулярно-генетическим данным кариоформы соответствовали либо подвидам, либо близким видам (Поплавская и др., 2012а,б). Нами решено более детально проанализировать кариотипические различия C. barabensis и C. pseudogriseus, и получить новые данные для решения вопроса об их таксономическом статусе.
Крысовидный хомячок Tscherskia triton de Winton, 1899 – одно из немногих животных, в кариотипе которого обнаружены В-хромосомы (Борисов, 1980, 2012; Картавцева и др., 1980). На территории Приморского края описаны два подвида (Костенко, 1984; Картавцева, Алексеева, 1987): T. t. albipes и T. t. nestor, которого сближают с крысовидными хомячками Китая и Корейского п-ова. Нами предпринята попытка установить цитогенетические различия подвидов, а также определить наличие В-хромосом в их кариотипах.
Виды пищух рода Ochotona Link, 1795 хорошо дифференцируются по кариотипическим характеристикам. Внутриродовая систематика пищух активно разрабатывается морфологическими, молекулярно-генетическими и биоакустическими методами (Лисовский, 2005; Формозов и др., 2006; Hoffmann, Smith, 2005; Lissovsky et al., 2007; Lanier, Olson, 2009). Однако затруднения связаны с недостатком информации по центрально-азиатским видам пищух. Другой аспект касается слабой изученности внутривидового разнообразия таких широкоареальных видов как O. hyperborea Pallas, 1811. На Дальнем Востоке цитогенетические характеристики этого вида известны из Магаданской области России (Иваницкая, 1991) и о-ва Хоккайдо Японии (Hayata, Shimba, 1969). Наша работа направлена на получение новых данных по кариологии и изменчивости пищух, и их использование для дополнения внутриродовой системы.
Цели и задачи исследования. Цель настоящего исследования – изучить хромосомную изменчивость и цитогенетическую дифференциацию близких таксонов представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
-
Исследовать кариотипы подвидов C. barabensis и вида C. pseudogriseus для выявления внутривидовой изменчивости;
-
Установить дополнительные дифференцирующие критерии видов C. barabensis и C. pseudogriseus на основе анализа распределения гетерохроматина в хромосомах;
-
Проанализировать кариотипы и выявить цитогенетические различия подвидов T. triton из Приморского края;
-
Описать кариотип O. huangensis, провести сравнительный анализ с кариотипами представителей подродов Pika и Ochotona, и использовать эти данные для дополнения внутриродовой системы пищух с уточнением границ подродов по хромосомным числам;
-
Провести цитогенетический анализ пищух Забайкальского края и юга Дальнего Востока России для обнаружения хромосомной изменчивости.
Научная новизна. Впервые получены цитогенетические данные, подтверждающие обитание C. barabensis в Новосибирской и Еврейской Автономной областях (Картавцева, Вакурин, Высочина, 2013; Вакурин и др., 2014). В результате С-окрашивания хромосом C. barabensis из различных частей ареала, впервые выявлена изменчивость окрашивания гетерохроматиновых блоков (С-блоков) на двух парах аутосом, без выраженной дифференциации между подвидами. Показана стабильность хромосомных характеристик C. pseudogriseus из 10 локалитетов Забайкальского края. Для двух видов хомячков установлены дифференцирующие критерии кариотипов по С-исчерченности хромосом. Показано, что в кариотипах этих видов, при Робертсоновских слияниях акроцентрических аутосом, происходит потеря гетерохроматинового материала (Vakurin et al., 2011; Вакурин и др., 2014).
Впервые установлены цитогенетические характеристики и распределение С-блоков O. huangensis – циньлинской пищухи (2n=42, NF=84), выявлен гетероморфизм локализации С-блоков на 8-й паре аутосом (Vakurin et al., 2012). Впервые проведен сравнительный анализ кариотипа O. huangensis с кариотипами пищух из подродов Pika и Ochotona. Диплоидное число (42) O. huangensis расширяет значения хромосомных чисел для видов подрода Ochotona (2n=46–50, 68), что нарушает разграничение по этому показателю с подродом Pika (2n=38–42, 68). Впервые определена таксономическая принадлежность пищух Еврейской Автономной области (из заповедника «Бастак») к виду O. hyperborea – северная пищуха (Фрисман и др., 2013; Vakurin et al., 2013). Выявлена изменчивость кариотипа O. hyperborea из Амурской области по морфологии Х-хромосомы, соотношению мелких пар мета-субметацентрических и субтело-акроцентрических аутосом. Впервые в семействе Пищуховых Ochotonidae Thomas, 1897 выявлена изменчивость числа половых хромосом (у самки O. mantchurica из Забайкальского края обнаружен кариотип Х0 – с одной половой хромосомой).
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработка систематики и выявление дифференцирующих критериев близких видов направлено на анализ биоразнообразия и механизмов видообразования. Установление таксономической принадлежности пищух на Дальнем Востоке необходимо для определения их ареала, что в дальнейшем позволит строить гипотезы о путях распространения вида. Полученные данные дополняют внутриродовую систему пищух и могут быть использованы для дальнейшей ревизии. Описание кариотипа O. huangensis существенно для подтверждения видового статуса и составления диагноза. Новые сведения о хромосомной изменчивости могут быть включены в сводки по млекопитающим и атласы хромосом. Исследование таких эндемичных видов, как циньлинская пищуха, позволит установить места и условия их обитания, оценить степень антропогенного влияния, формировать охранные зоны, например, при планировании развития сельского хозяйства. Результаты нашей работы могут быть включены в курс цитогенетики биологических специальностей вузов.
Личный вклад автора. С участием автора проводили приготовление суспензий метафазных хромосом, забор материала у части крысовидных хомячков Вакурин А.А. осуществил лично. Автор готовил хромосомные препараты (более 250), проводил их окрашивание различными методами. Самостоятельно выполнил микроскопический анализ, фотографирование метафазных клеток (более 1400), обработку данных и построение кариограмм. Автором проведен анализ полученных результатов и подготовка публикаций. Дополнительные данные, полученные молекулярно-генетическими и биоакустическими методами, проанализированы при участии автора.
Апробация работы. Результаты исследования доложены на 6 всероссийских и региональных научных конференциях и симпозиумах: IX Съезд Териологического общества РАН (Международное совещание Териофауна России и сопредельных территорий, Москва, 1-4 февраля 2011 г.), Современные достижения в популяционной, эволюционной и экологической генетике – Modern Achievements in Population, Evolutionary and Ecological Genetics: International Symposium (MAPEEG, Владивосток, 2009, 2011 и 2013 гг.), Конференция конкурс молодых ученых БПИ ДВО РАН (Владивосток, 8-9 ноября 2012 г.) и 10-ая Дальневосточная конференция по заповедному делу (Благовещенск, 25-27 сентября 2013 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ: 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах; 1 статья в региональном научном журнале; 1 статья в сборнике; 5 работ в материалах научных конференций.
Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 124 страницах, содержит 6 таблиц и проиллюстрирован 16 рисунками. Список литературы включает 134 наименований, из них 56 на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю – д.б.н. И.В. Картавцевой за неоценимый опыт и наставление в ходе исследования, и замечания при написании рукописи. Особая благодарность к.б.н. В.П. Кораблёву за введение в цитогенетическую науку и обучение методам. За совместные работу и публикации благодарю коллег: доктора Цзян (Куньминский институт зоологии, Китай), Т.В. Григорьеву и к.б.н. Н.А. Формозова (МГУ, Москва), к.б.н. А.А. Лисовского (Зоологический музей МГУ, Москва), д.б.н. Л.В. Фрисман и м.н.с. Л.В. Капитонову (ИКАРП ДВО РАН, Биробиджан), Н.П. Высочину (Хабаровская противочумная станция), вед. инж. В.Ю. Гуськова (БПИ ДВО РАН, Владивосток), м.н.с. Е.В. Кумакшеву (НИИЭМ имени Г.П. Сомова СО РАМН, Владивосток), А.А. Аверина (заповедник «Бастак», Биробиджан). Благодарю д.б.н. И.В. Картавцеву, к.б.н. В.П. Кораблёва, к.б.н. М.В. Павленко, к.б.н. И.Н. Шереметьеву, к.б.н. А.А. Лисовского – за предоставленный материал для исследования. Также благодарю всех сотрудников лаборатории эволюционной зоологии и генетики Биолого-почвенного института – за рабочую атмосферу, поддержку и советы при подготовке диссертационной работы.
Гранты РФФИ и ДВО. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов: РФФИ №: 06-04-39015, 06-04-48969а, 12-04-00662а; ДВО РАН №: 09-II-СО-06-007, 12-II-СО-06-018 и гранта «Комплексные экспедиционные исследования природной среды бассейна р. Амур в 2004-2007 гг.».
Во введении обоснована актуальность темы исследования, сформулированы цели и задачи работы, указаны научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы.
Сведения по биологии пищух рода Ochotona
В составе рода Tscherskia Ognev, 1914 всего один вид – Tscherskia triton de Winton, 1899 – крысовидный хомячок. Данные хомячки близки к серым хомячкам и раньше включались в род Cricetulus Milne-Edwards, 1867. Размеры тела более крупные до 23 см, хвост длинный до 10 см, с характерным кончиком белого цвета (Громов, Ербаева, 1995). Морда немного вытянута с относительно удлиненными ушами, что придает хомячку несколько крысиный облик. Окраска шерсти темная, серо-бурая; цвет спины однотонный, на боках светлее, брюхо пепельное, часто на груди расположено белое пятно. Уши и хвост покрыты короткой, редкой шерстью (Павлинов и др., 2002; Лебедев, 2012). Череп с постепенно расходящимися в заднем направлении скуловыми дугами. Слуховые барабаны довольно крупные, выпуклые (Громов, Ербаева, 1995). Крысовидные хомячки обитают на возвышенной местности по долинам рек, на лугах и заболоченных участках в зарослях кустарника. Могут заходить в прилежащие области лесов, селиться вдоль сельхоз полей и около жилых построек. Зверьки роют норы и в зимнее время их не покидают. Основной вид их пищи – семена растений, делают зимние запасы (Лебедев, 2012). Приносят потомство до 3 раз в год (Павлинов и др., 2002). Вред, наносимый сельскому хозяйству, не велик; хомячки являются носителями возбудителей природно-очаговых инфекций, могут использоваться как лабораторные животные (Громов, Ербаева, 1995).
Этот вид распространен в северо-восточном Китае, на Корейском полуострове, на Дальнем Востоке России в южном Приморье: Приханкайская низменность, средняя часть хребта Сихотэ-Алинь (Громов, Ербаева, 1995; Лебедев, 2012).
Пищухи рода Ochotona Link, 1795 – мелкие (в длину 12–28 см) млекопитающие отряда зайцеобразные Lagomorpha Brandt, 1855. Имеют относительно короткие конечности, задние по длине почти равны передним или немного превышают их. Хвост снаружи незаметен. Уши округлые короткие, лишь у некоторых видов длиннее середины головы. Мех густой, мягкий и высокий. Окраска шерсти разнообразна от красноватой до серой, на брюшной стороне обычно светлее. Линька может происходить несколько раз в год (Громов, Ербаева, 1995). Летний мех более яркий, чем зимний (обычно серый разных оттенков). На мордочке расположены длинные вибриссы, у некоторых видов более трети длины тела. Кожные подушечки пальцев голые. Специфическая, для некоторых видов, кожная апокриновая железа располагается в заднем отделе щек и служит для мечения территории (Соколов и др., 1994).
Характерной особенностью многих северных видов пищух является развитая звуковая сигнализация – крик громкий, некоторые звуки напоминают свист. Эти обитатели предгорий и высокогорья могут встречаться на высоте 6000 м и выше над уровнем моря. Селятся поодиночке или колониями, предпочитают каменные россыпи или открытые равнины, но встречаются также полупустынные и степные виды (Павлинов и др., 2002). Убежище находят в расщелинах между камнями, либо роют норы. Многие виды пищух обладают сильной привязанностью к местам их обитания, что связано, прежде всего, с хорошо обжитыми многолетними убежищами (Соколов и др., 1994; Hoffmann, Smith, 2005). Зверьки ведут, в основном, дневной образ жизни. В поисках пищи далеко от своих убежищ не отходят. Основой рациона является травянистая растительность, а также мягкая кора деревьев и кустарников. Характерно запасание на зиму кормов, в виде своеобразных стожков сена. Размножаются 2-3 раза в год. Период размножения растянут и не совпадает у различных видов и в различных местах обитания (Павлинов и др., 2002). Длительность беременности около 30 дней. Детеныши разных видов рождаются либо голыми, либо густо покрытыми волосами (Соколов и др., 1994; Громов, Ербаева, 1995).
В ряде мест пищухи являются вредителями сельского хозяйства, повреждают всходы и подрост ценных (кедр) и фруктовых пород деревьев. Представители семейства пищуховых, могут являться как основными, так и второстепенными носителями чумы (Громов, Ербаева, 1995).
Для многих изученных видов рода Ochotona установлены морфологические критерии видовой диагностики и границы ареалов. В настоящее время ареалы многих видов пищух разорваны (Воронцов, Иваницкая, 1973). Распространены в Северной Америке, Юго-Восточной Европе, в Азии от Арктического побережья до северных районов Ирана, Афганистана, Пакистана, Индии и Бирмы, от Полярного Урала на западе и до тихоокеанского побережья на востоке, включая Чукотку, Камчатку и остров Хоккайдо, а также на территории Северной Кореи (Соколов и др., 1994; Hoffmann, Smith, 2005).
Пищухи одна из наиболее древних групп плацентарных млекопитающих (Гуреев, 1964; Иваницкая, 1989; Лопатин, Аверьянов, 2008; Rose et al., 2008). Семейство пищуховых включает один современный род Ochotona. В палеонтологической летописи просматривается два периода расцвета пищух: середина олигоцена – начало миоцена и конец миоцена – плейстоцена. Далее последовало резкое вымирание и сокращение ареалов, в том числе и рода Ochotona в голоцене (Иваницкая, 1989).
Первые же работы по сравнительной кариологии показали, что кариотип может являться видовым диагностическим признаком. Большинство видов животных отличаются по числу, размерам и форме хромосом. Существуют виды-двойники, морфологический анализ которых затруднён. Для таких случаев адекватным диагностическим методом является цитогенетический анализ. С другой стороны описаны группы видов с одинаковыми числами (2n) и морфологией хромосом, а также обнаружены виды (хромосомно-полиморфные), в популяциях которых число и морфология хромосом изменчивы. Внутри- и межпопуляционный хромосомный полиморфизм обнаружен у 4% видов млекопитающих (Ляпунова, Картавцева, 1976). Поэтому сравнительная кариология имеет большое значение при сравнении разных популяций, географически замещающих друг друга форм неясного таксономического ранга или групп близких видов на уровне подрода (Орлов, 1974). Проблема множественных хромосомных рас, их гибридизация и явление робертсоновского веера ставит всё новые задачи перед цитогенетикой. В 70-х годах ХХ века начали активно развиваться методы дифференциального окрашивания хромосом, но и они не всегда могли разрешить спорные вопросы. В дальнейшем они стали дополняться молекулярными данными.
Внутриродовая структура и цитогенетическая характеристика рода, Ochotona
Первоописание кариотипа Tscherskia triton de Winton, 1899 было проведено из корейской популяции, диплоидное число хромосом оказалось равным 30 (Makino, 1951). В дальнейшем стало известно, что кариотип крысовидного хомячка может содержать добавочные хромосомы (В-хромосомы) и первоописание сделано для кариотипа с двумя В-хромосомами. Нормальный кариотип этого вида имеет 2n=28: 11 пар акроцентрических и 2 пары мета-субметацентрических аутосом, субтелоцентрическую X-хромосому и мета-субметацентрическую Y-хромосому (Борисов, Кораблёв, 1978). Хромосомные наборы T. triton изучены на небольшой части ареала: из трех провинций Китая – Шаньдун, Цзилинь и Шэньси (Wang et al., 1999), на Корейском полуострове (Makino, 1951; Tsuchiya, Won, 1976), в Приморском крае России из окрестностей г. Уссурийска и пос. Пограничный (Борисов, 1978, 1980, 2012; Борисов, Кораблёв, 1978; Картавцева и др., 1980).
Кариотип крысовидного хомячка исследован методами дифференциального C-, G-, Q-, NOR-окрашивания. С помощью С-окрашивания у этого вида показано довольно высокое содержание гетерохроматина – 28% от размера генома (Борисов, Кораблёв, 1978). Крупные, прицентромерные С-блоки выявляются на всех акроцентрических парах аутосом, на мелких мета-субметацентрических парах центромерные С-блоки меньшего размера. Половые хромосомы также имеют прицентромерные блоки гетерохроматина, на Y-хромосоме этот участок занимает и часть короткого плеча (Борисов, Кораблёв, 1978). Такое большое количество гетерохроматинового материала делает T. triton удобным объектом для изучения структуры и свойств гетерохроматина. По ряду методов окраски хромосом был продемонстрирован различный характер С-блоков у крысовидного хомячка. Прицентромерные С-блоки акроцентрических аутосом разделяются на два участка. Первый участок не проявляется при рутинной и кратковременной С-окраске, но флуоресцирует при Q-окраске и прокрашивается при нормальных условиях С-окрашивания. Второй участок заметен как более темный уже при рутинной окраске; при С-окраске, вместе с первым участком, он выявляется как крупный блок гетерохроматина, но не флуоресцирует при Q-окраске. При G-окрашивании первый участок прицентромерного гетерохроматина интенсивно окрашивается и наиболее устойчив к трипсину, второй участок не окрашивается. Всего на 3-й паре хромосом крысовидного хомячка прокрашивается до 12 G-полос; G-окраска практически совпадает с Q-окраской и противоположна С-окраске, исключение проявляется в тусклом свечении первого участка гетерохроматина при окрашивании акрихином (Борисов, 1978; Борисов, Кораблёв, 1978). Таким образом, было показано, что прицентромерные С-блоки содержат гетерохроматин двух типов. Сравнение кариотипов T. triton и других видов хомяков выявило корреляцию содержания высокоповторенной ДНК и гетерохроматина. Следовательно, различие гетерохроматина обусловлено не столько первичной последовательностью нуклеотидов, сколько плотностью его упаковки. На молекулярном уровне такая упаковка связана с функциональными особенностями гетерохроматина, ДНК-белковым взаимодействием и их общей структурной организацией. Различие Q-окраски также может зависеть от обогащенности ГЦ-основаниями (Борисов, 1978). Для хромосомного набора T. triton описано наличие 1-2 мелких акроцентрических В-хромосом. Добавочные хромосомы встречаются у малого числа особей и лишь в небольшом количестве клеток. Так на 21 изученную особь были обнаружены: одна В-хромосома у 3 хомячков в 20-40% исследованных клеток; две В-хромосомы у 1 хомячка в 5% клеток (Борисов, 1980). Показана конъюгация В-хромосом в мейозе и их более высокая частота встречаемости в герминативных клетках, по сравнению с клетками соматических тканей. Однако при отсутствии добавочных хромосом в соматических клетках, в герминативных клетках они также отсутствуют. В связи с этим было выдвинуто предположение, что В-хромосомы образуются de novo в репродуктивной ткани, а затем элиминируют в соматической из-за их отрицательного воздействия (Борисов, 2012). По С-окраске В-хромосомы почти полностью состоят из гетерохроматина, с менее интенсивно окрашенными прицентромерными и теломерными участками. По G-окраске добавочные хромосомы окрашиваются слабо, кроме небольшого прицентромерного участка; флуоресценция при Q-окраске также тусклая. Данные отличия окраски гетерохроматина В-хромосом от С-блоков аутосом позволили предположить наличие 3-его типа гетерохроматина у T. triton. В кариотипах хомячков с 2n=29 (28+1В) и 2n=30 (28+2В) не обнаружено перестроек по сравнению с нормальным 2n=28. Было выдвинуто три гипотезы происхождения В-хромосом. По первой гипотезе, они являются остаточными тельцами при центрических слияниях хромосом. Вторая состоит в том, что В-хромосомы образуются в результате дупликации гетерохроматинового материала или других элементов аутосом. По третьей гипотезе, В-хромосомы – это дупликация участков половых хромосом. У крысовидного хомячка показано сходство размеров, морфологии и дифференциальных C-, G-, Q-окрасок В-хромосом и короткого плеча Y-хромосомы, что возможно указывает на происхождение добавочных хромосом путем дупликации этого участка Y-хромосомы (Борисов, 1980, 2012).
Ранее относимый к серым хомячкам Cricetulus nestor Thomas, 1907 был описан из северокорейской популяции (район Порт-Артура). С. И. Огнев отнес крысовидного хомячка к отдельному роду с описанием Tscherskia albipes Ognev, 1914 из Приморского края. Впервые кариотип T. triton с 2n=30, C. t. nestor по сводке Эллермана и Моррисона-Скотта (1951), был исследован из корейской популяции (Makino, 1951). Позднее для хомячков из окр. Уссурийска (Приморский край) Н. Н. Воронцов и С. И. Раджабли (1969) описали кариотип с 2n=28, что дало основание отнести их к самостоятельному виду T. albipes. Дальнейшие исследования кариотипов крысовидных хомячков из популяций Кореи (Tsuchiya, Won, 1976), Китая (Wang et al., 1999) и Приморского края (Борисов, 1978; Борисов, Кораблёв, 1978; Картавцева и др., 1980), и обнаружение у этого вида В-хромосом (Борисов, 1980) показало конспецифичность T. nestor и T. albipes. Таким образом, был утвержден только один вид крысовидного хомячка – T. triton (Картавцева и др., 1980; Борисов, 2012). На территории Китая выделяют до пяти подвидов крысовидного хомячка: T. triton triton, T. t. fuscipes, T. t. collinus, T. t. incanus и T. t. canus (Wang et al., 1999). У одного из подвидов T. t. canus была описана совершенно иная структура кариотипа с 2n=24, NF=44-46 и преобладанием двуплечих хромосом. Данный подвид обитает в изолированных популяциях горных лесов на территории провинций Ганьсу, Нинся, Шэньси и Сычуань (Smith et al., 2010). На основании кариологических различий подвид T. t. canus был выделен в самостоятельный вид Cansumys canus Allen, 1928 (Yang et al., 2003). Однако по морфологическим признакам и данным молекулярного анализа D-петли мтДНК его рассматривают как подвид (Liao et al., 2007).
На территории Приморского края России выделено два подвида: T. t. albipes Ognev, 1914 и T. t. nestor Thomas, 1907 (Костенко, 1984; Картавцева, Алексеева, 1987). Добавочные хромосомы обнаружены в кариотипах крысовидных хомячков только из популяций T. t. albipes. Нами предпринята попытка установить связаны ли подвидовые различия с изменчивостью кариотипов и В-хромосом.
Дифференциальное C-окрашивание
Среди исследованных нами хомячков из природных популяций гибридов не обнаружено (Вакурин и др., 2014). Анализируя результаты Поплавской с соавторами (2012б), мы не можем согласиться с выводами авторов о полностью успешной лабораторной гибридизации. Как уже было отмечено (раздел 1.2.1.), число выводков относительно спариваний при гибридном скрещивании C. barabensis и C. pseudogriseus меньше, чем при контрольном скрещивании. При возвратном скрещивании гибридов с этими же видами потомство не получено. В эксперименте были получены только выводки от скрещивания гибридов и C. griseus (Поплавская и др., 2012б). Это может свидетельствовать о пониженной плодовитости гибридов. Обсуждая причины репродуктивной изоляции и природные условия зон возможного контакта в центральной Монголии и южной Бурятии, отмечая их давнее формирование и отсутствие потока генов, был сделан вывод, что кариоформы “barabensis” и “pseudogriseus” представляют собой “независимо развивающиеся эволюционные линии” (Поплавская и др., 2012а). Предположение о находках гибридных особей C. barabensis и C. pseudogriseus с кариотипом 2n=21 (Поплавская и др., 2011) не доказано, так как “лишняя” двадцать первая хромосома по размерам и морфологии схожа с Y-хромосомой C. barabensis. Чтобы понять является ли “лишняя” хромосома аутосомой или половой хромосомой, необходимо провести дифференциальное окрашивание (Вакурин и др., 2014). Интересно, что в лабораторной линии китайского хомячка C. griseus, входящего в надвидовой комплекс Cricetulus barabensis, была отмечена лишняя половая хромосома (Ivett et al., 1978).
Стабильность кариотипа C. barabensis (число и морфология хромосом) и отсутствие четкой внутривидовой дифференциации по содержанию гетерохроматина на обширном ареале может свидетельствовать о молодости этого вида. Аналогичный вывод применим и к C. pseudogriseus (Vakurin et al., 2011; Вакурин и др., 2014). При аллопатрическом распространении и экологической близости эти виды, возможно, все еще находятся в процессе видообразования. Рассматривая этот случай и на примере дивергенции других близких видов хомяков Палеарктики (in statu nascendi), Н. Н. Воронцов (1960, 2004) выдвинул гипотезу видообразования путем генетической изоляции – начинающегося с возникновения репродуктивной изоляции за счет хромосомных перестроек до возникновения генных или морфологических различий и завершающегося экологической дифференциацией. В то время границы ареалов и различия этих видов по другим признакам ещё не были ясны (Вакурин и др., 2014). По морфологическим данным краниометрии (Лебедев, Лисовский, 2008) и молекулярного анализа цитохрома b мтДНК и гена DBY1 Y-хромосомы (Поплавская и др., 2012а), хомячки надвидового комплекса Cricetulus barabensis рассматриваются как кариоформы одного вида. При этом в каждой работе существовали свои трудности точной дифференциации хомячков. В недавней сводке млекопитающих России (Лебедев, 2012) они также охарактеризованы как кариоформы. Однако мы придерживаемся мнения, что хомячки C. barabensis и C. pseudogriseus являются молодыми и близкими, но самостоятельными видами. В работе посвященной географическому распространению и диагностированию хомячков кариологическим методом (Кораблёв и др., 2013), авторы также склоняются к взгляду о независимом таксономическом статусе этих двух видов. Описанные нами особенности распределения гетерохроматина в кариотипах барабинских и забайкальских хомячков не выглядят критическими. Но эволюция кариотипов хомячков рода Cricetulus происходила при слиянии хромосом по Робертсоновскому типу и других перестройках (Раджабли, Крюкова, 1973; Kral et al., 1984; Romanenko et al., 2007), которыми нельзя пренебречь для обоснованного заключения. Подобные хромосомные преобразования продемонстрированы для хомячков рода Allocricetulus Argyropulo, 1932 (Romanenko et al., 2013). Наряду с этим, изменения гетерохроматина могли повлиять на стабильность генома и участвовать в формировании механизмов изоляции (Вакурин и др., 2014).
Для более четкого определения внутри- и межвидовой дифференциации между C. barabensis и C. pseudogriseus необходимо дальнейшее комплексное исследование хомячков. На наш взгляд важно изучение путей расселения, поведенческих особенностей этих видов, анализ причин репродуктивной изоляции, в том числе и этологических. Следует продолжить работы по гибридизации и молекулярные исследования, прежде всего ядерных генов. На пищухах подрода Pika, также обозреваемых в нашей работе, показано, что ген цитохрома b мтДНК не всегда пригоден для внутривидового анализа (Формозов и др., 2006), возможно это же проявляется на уровне близких видов хомячков. Проведенный нами цитогенетический анализ хомячков C. barabensis и C. pseudogriseus позволяет представить нижеследующие результаты: – структура кариотипа (2n=20, NF=38) подвидов C. barabensis стабильна, в том числе у хомячков из впервые изученных локалитетов Новосибирской области и Еврейской Автономной области; – проведенное С-окрашивание хромосом C. barabensis показало наличие изменчивости интенсивности окрашивания С-блоков, без выраженной дифференциации между подвидами; – кариотипы C. pseudogriseus из изученных локалитетов Забайкальского края стабильны по 2n, NF, числу и локализации С-блоков в хромосомах; – по характеру С-исчерченности хромосом кариотип C. pseudogriseus отличается от кариотипа C. barabensis наличием центромерного гетерохроматина на четырех акроцентрических парах аутосом, отсутствием теломерного С-блока на второй паре аутосом и иной С-окраской Х-хромосом; – среди исследованных хомячков из природных популяций гибриды нами не были обнаружены; мы рассматриваем C. barabensis и C. pseudogriseus как молодые самостоятельные виды, эволюция кариотипов которых проходила путем Робертсоновских слияний акроцентрических аутосом с потерей гетерохроматинового материала. Наряду с другими хромосомными перестройками, возможно, потеря гетерохроматина повлияла на функционирование генома и формирование генетической изоляции до дивергенции этих видов по другим признакам.
В настоящей работе изучено 25 особей крысовидных хомячков Tscherskia triton (8 самцов, 17 самок) из ранее не исследованных 6 локалитетов (№№ 28-33) Приморского края и виварного разведения особей из Хасанского района (табл. 4, рис. 1в). Анализ кариотипов и подсчет диплоидных чисел хромосом проводили не менее чем на 20 метафазных пластинках. Все особи имели кариотипы с 2n=28, NF=34: 11 пар акроцентрических аутосом, формирующих убывающий размерный ряд, и 2 пары мелких мета-субметацентрических аутосом. X-хромосома субтелоцентрическая, Y-хромосома мета-субметацентрическая (рис. 8). В кариотипах исследованных хомячков T. triton нами не обнаружено В-хромосом. По литературным данным известно, что лишь у небольшого числа хомячков в кариотипе присутствуют добавочные хромосомы. Только у 5 самцов из 45 хомячков, отловленных в Приморском крае, были обнаружены 1-2 В-хромосомы (Борисов, 1978, 1980, 2012; Картавцева и др., 1980). Добавочные хромосомы также обнаружены у T. triton из популяций Южной Кореи (2n=28+2В) (Makino, 1951) и провинции Шаньдун (Shandong) Китая (2n=28+1В) (Wang et al., 1999).
Единообразие кариотипов у подвидов Tscherskia triton из изученных локалитетов Приморского края
Барабинский C. barabensis и забайкальский C. pseudogriseus хомячки рассматриваются нами как самостоятельные виды. Подвиды C. barabensis из шести географических регионов России имеют стабильные кариотипы по диплоидному числу и морфологии хромосом (2n=20, NF=38). Для C. barabensis на двух парах аутосом выявлена изменчивость интенсивности окрашивания С-блоков гетерохроматина, без выраженной дифференциации между подвидами. Остальные пары аутосом и половые хромосомы имеют стабильные С-блоки. Слабая выраженность структурного гетерохроматина C. barabensis и небольшая выборка пока не позволяют нам сделать заключение о географической изменчивости кариотипов по этому признаку. Хомячки C. pseudogriseus из 10 локалитетов Забайкальского края также имеют стабильные кариотипы (2n=24, NF=38), в том числе по числу и локализации С-блоков в хромосомах (Вакурин и др., 2014).
Дополнительным дифференцирующим критерием двух видов хомячков является С-исчерченность хромосом: C. pseudogriseus отличается от C. barabensis наличием центромерного гетерохроматина на четырех акроцентрических парах аутосом, отсутствием теломерного С-блока на второй паре аутосом и иной С-окраской Х-хромосом. Эти данные свидетельствуют, что в кариотипах хомячков Робертсоновские слияния акроцентрических аутосом происходили с потерей гетерохроматинового материала (Вакурин и др., 2014). Такие изменения, наряду с уже известными перестройками хромосом, могли повлиять на формирование генетической изоляции между C. barabensis и C. pseudogriseus до дивергенции по другим признакам. Мы считаем, что наши данные свидетельствуют в пользу гипотезы о независимом статусе C. barabensis и C. pseudogriseus (Раджабли, Крюкова, 1973; Орлов, Исхакова, 1975; Малыгин и др., 1992; Громов, Ербаева, 1995; Картавцева, 2002а; Кораблёв и др., 2013).
На наш взгляд, дальнейшее решение вопроса о таксономической структуре надвида Cricetulus barabensis должно быть связано с анализом ядерных генов, изучением структуры хромосом методами молекулярной цитогенетики, в частности FISH-анализом, для выявления внутривидовой изменчивости и возможных генетических различий, приводящих к изоляции. Необходимо продолжение зоогеографических исследований с целью более четкого выяснения структуры ареалов в зонах возможного контакта популяций хомячков разных кариоформ. А также продолжение работ по гибридизации и наблюдению этологических особенностей хомячков этой группы.
Различий в структуре кариотипа (2n=28, NF=34) или распределении гетерохроматина у крысовидных хомячков из популяций подвидов T. triton albipes и T. triton nestor Приморского края нами не обнаружено. В-хромосомы у исследованных особей отсутствуют. Установить подвидовую дифференциацию и определить подвидовую принадлежность, по данным характеристикам, не удалось. Возможно, при исследовании внутривидового разнообразия T. triton, показательные результаты могут быть получены молекулярно-генетическими методами. Большое количество гетерохроматина в хромосомах делает T. triton удобным и перспективным объектом для изучения свойств и структуры гетерохроматина, которая, по-видимому, достаточно разнообразна у этого вида.
Нами впервые проведено первоописание кариотипа, установлены цитогенетические характеристики (2n=42, NF=84) и распределение гетерохроматина циньлинской пищухи O. huangensis из Китая. По хромосомным характеристикам O. huangensis дивергировал от основной группы видов подрода Ochotona. Диплоидное число (42) O. huangensis расширяет значения хромосомных чисел для видов подрода Ochotona (2n=46–50, 68), тем самым нарушая разграничение по этому показателю с подродом Pika (2n=38–42, 68). Таким образом, гипотеза о построении внутриродовой кариологической системы рода Ochotona только по значению 2n не подтверждается (Vakurin et al., 2012).
Кариотипы O. huangensis (NF=84) и O. alpina (NF=70–78) из подрода Pika сходны по диплоидному числу хромосом (42), но значительно различаются по общему числу плеч хромосом, распределению гетерохроматина и количеству мелких пар аутосом. Напротив, у O. huangensis и O. dauurica (2n=50, NF=80–86)
106 из подрода Ochotona более близкие значения NF, оба вида имеют прицентромерные С-блоки на всех аутосомах. Общая картина С-исчерченности хромосом O. dauurica и O. huangensis подтверждает тенденцию уменьшения количества гетерохроматина у пищух – от высокохромосомных к низкохромосомным видам.
Кариотипы (2n=40, NF=70-76) впервые исследованных пищух Еврейской Автономной области (из заповедника «Бастак») соответствуют O. hyperborea или O. mantchurica. С привлечением молекулярно-генетических и акустических результатов эти пищухи отнесены к виду O. hyperborea – северная пищуха (Фрисман и др., 2013; Vakurin et al., 2013). Нами впервые описана цитогенетическая изменчивость пищух: у O. hyperborea из Амурской области выявлена изменчивость по морфологии Х-хромосомы и соотношению мелких пар мета-субметацентрических и субтело-акроцентрических аутосом;. у самки O. mantchurica из Забайкальского края обнаружен кариотип Х0 – с одной половой хромосомой, что впервые свидетельствует об изменчивости числа половых хромосом в семействе Пищуховых Ochotonidae.
Разработка внутриродовой системы рода Ochotona требует исследования кариотипов всех видов пищух, в том числе методами дифференциального и FISH окрашивания хромосом, которые не проведены даже для некоторых ранее изученных видов пищух.
1. Изменчивость кариотипов у шести подвидов Cricetulus barabensis по диплоидному числу и морфологии хромосом (2n=20, NF=38) не обнаружена. На двух парах аутосом выявлена изменчивость интенсивности окрашивания С-блоков гетерохроматина, без выраженной дифференциации между подвидами. Хомячки Cricetulus pseudogriseus имеют стабильные кариотипы по числу и локализации С-блоков в хромосомах.
2. Дополнительным дифференцирующим критерием видов Cricetulus barabensis и Cricetulus pseudogriseus является С-исчерченность хромосом. Эти данные свидетельствуют, что в эволюции кариотипов этих видов Робертсоновские слияния акроцентрических аутосом происходили с потерей гетерохроматинового материала.
3. Крысовидные хомячки из популяций подвидов Tscherskia triton albipes и T. triton nestor не имеют цитогенетических различий (2n=28, NF=34, В-хромосом не обнаружено). Подвидовая принадлежность и дифференциация, по данным характеристикам, не установлены.
4. Впервые установлены цитогенетические характеристики циньлинской пищухи Ochotona huangensis из Китая (2n=42, NF=84). Кариотипы O. huangensis из подрода Ochotona и O. alpina из подрода Pika сходны по диплоидному числу хромосом (2n=42), что нарушает разграничение между подродами. Таким образом, гипотеза о построении внутриродовой кариологической системы рода Ochotona только по значению 2n не подтверждается.
5. Кариотипы Ochotona huangensis (NF=84) и Ochotona dauurica (2n=50, NF=80–86) из подрода Ochotona имеют близкие значения NF, оба вида имеют прицентромерные С-блоки на всех аутосомах. Общая картина С-исчерченности хромосом O. dauurica и O. huangensis подтверждает тенденцию уменьшения количества гетерохроматина у пищух – от высокохромосомных к низкохромосомным видам.
6. Кариотипы пищух из заповедника «Бастак» (Еврейская Автономная область) соответствуют Ochotona hyperborea или Ochotona mantchurica. Привлечение молекулярно-генетических и акустических данных помогло отнести этих пищух к виду O. hyperborea – северная пищуха.
7. У пищухи O. hyperborea из Амурской области выявлена изменчивость по морфологии Х-хромосомы и соотношению мелких пар мета-субметацентрических и субтело-акроцентрических аутосом. У самки O. mantchurica из Забайкальского края обнаружен кариотип Х0 – с одной половой хромосомой, что впервые свидетельствует об изменчивости числа половых хромосом в семействе Пищуховых Ochotonidae.
