Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время одним из современных направлений микробиологии является экология микроорганизмов, которая включает в себя раздел популяционной микробиологии, требующий глубокого понимания структурно-функциональных особенностей существования популяций различных микроорганизмов.
Изучению биологии, экологии, индикации и идентификации листерий посвящен целый ряд работ таких исследователей как Бакулов И.А. 1967, Меньшикова 1971, Бутко М.П. 1977, Шевелева С.А. 1999, Котлярова Г.А. 1989, Котляров В.М. 1999, Тартаковский И.С. 2002, Нитяга И.М. 2004 и другие.
В связи с участившимися случаями выявления возбудителя листериоза в объектах ветеринарно-санитарного надзора, в частности, в водоемах, кормах, продуктах питания, возникает необходимость детального исследования выживаемости и морфологических особенностей популяций листерий в указанных выше объектах.
В последнее время, наряду с психрофильными бактериями вида L. monocytogenes, свою экологическую нишу начинают занимать L. innocua. Как показывают последние исследования при выделении листерий из объектов окружающей среды, патологических и биологических материалов доля Listeria innocua часто составляет больше половины от общего числа видов листерий (Бакулов И.А., Егорова И.Ю. и др. 2009). Так, в период с 2006 по 2009 годы из пресноводной рыбы Иваньковского водохранилища листерий были выделены в 5,53 % проб, из них на долю L. monocytogenes приходилось 48 %, а на L.innocua - 52 % проб (Егорова И.Ю., Селянинов Ю.О. и др. 2009).
Особый интерес представляют данные о проявлении патогенных свойств L.innocua. Так, при постановке конъюнктивальной пробы на морских свинках со штаммами L.innocua, выделенными из свинины, говядины, сливочного
масла, была отмечена положительная реакция и зафиксирована гибель нескольких животных, во внутренних органах которых при микробиологических исследованиях обнаруживались L.innocua (Кольпикова Т.И., Котляров В.М. и др. 1998). Таким образом, авторы полагают, что штаммы L.innocua не могут относиться к непатогенным видам листерии, а наличие их в кормах и продуктах питания представляет опасность для животных и людей.
Учитывая вышеизложенное, исследования экологии популяций L.innocua, как одного из наименее изученных представителей рода Listeria, являются новыми и актуальными. Такого рода исследования будут способствовать изысканию способов предотвращения контаминации листериями продуктов питания, кормов для животных и распространению опасного патогена в окружающей среде.
Цель работы. Целью настоящей работы является изучение выживаемости и морфологии популяций L.innocua при воздействии абиотических и биотических факторов окружающей среды.
Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:
1. Разработать методические подходы к исследованию влияния
абиотических и биотических факторов на выживаемость и морфологию
популяций Listeria innocua.
-
Изучить выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua в водной среде при различных температурных режимах (in vitro).
-
Изучить выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua в молочных продуктах (in vitro).
-
Изучить выживаемость и морфологию популяций листерии в тканях листовых пластинок кормовой культуры овса.
5. Изучить процессы адгезии и колонизации Listeria innocua
комбикормов.
6. Изучить влияние растворов кластерного серебра на выживаемость и
морфологию популяций Listeria innocua.
Научные положения, выносимые на защиту.
выживаемость и морфология L. innocua при различных режимах температур в водной среде и молочных продуктах.
методика исследования выживаемости и морфологии популяции L. innocua в тканях листовых пластинок растений с использованием метода сканирующей электронной микроскопии.
-морфология популяций L. innocua при существовании в тканях листовых пластинок овса и на поверхностях частиц комбикорма.
- механизм действия растворов кластерного серебра на морфологию
популяций L. innocua методом сканирующей электронной микроскопии.
Научная новизна. С использованием метода сканирующей электронной микроскопии изучено влияние абиотических и биотических факторов на морфологию популяций Listeria innocua.
Экспериментальными исследованиями показано, что в водной среде при низких и отрицательных температурах существование популяций бактерии Listeria innocua обеспечивается образованием колоний и микроколоний, в которых бактерии погружены в межклеточный матрикс, формирующий на поверхностях покровы - биопленки различной толщины. Стратегия выживания листерий при различных температурах обеспечивается гетероморфизмом популяций с различными проявлениями L-трансформации, что расширяет возможности их персистенции в объектах окружающей среды. Показано, что в биокефирах, контаминированных Listeria innocua (in vitro), молочнокислые бактерии оказывают бактериостатическое действие.
Впервые разработана методика исследования выживаемости и
морфологии популяции L. innocua в тканях листовых пластинок растений с
использованием метода сканирующей электронной микроскопии. Показана
способность Listeria innocua проникать через корневую систему в листовые
пластинки кормовой культуры овса и персистировать в тканях растений.
Установлена способность клеток листерий адгезироваться и колонизировать
частицы комбикорма при различных температурных режимах.
Впервые методом сканирующей электронной микроскопии изучен механизм действия растворов кластерного серебра, ведущим фактором которого является повреждение клеточной стенки листерий. Установлено, что растворы кластерного серебра оказывают бактериостатическое действие на популяции листерий пока существует контакт между бактериями и растворами кластерного серебра, что подтверждено данными изучения реверсии клеток в исходное состояние.
Практическая значимость работы. На основании результатов экспериментальных исследований разработано «Методическое пособие по изучению влияния растворов различных химических агентов на морфологию популяций бактерий методом отпечатков с последующим исследованием в сканирующем электронном микроскопе», утвержденное отделением ветеринарной медицины РАСХН 11.05.2010, рекомендованное для специалистов биологических, ветеринарных и медицинских научно-исследовательских институтов.
Результаты исследований влияния абиотических и биотических факторов на выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua показали необходимость проведения микробиологического мониторинга и контроля в таких объектах как вода, молоко, молочные продукты, зеленые корма и комбикорма для предотвращения распространения листерий в окружающей среде.
Апробация работы. Материалы научных исследований, представленные в диссертации, доложены на VII международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва 2008г.), на VIII международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва 2009г.), годовых отчетах аспирантов на Ученом совете ВНИИВСГЭ (2009, 2010), межлабораторном совещании научных сотрудников ВНИИВСГЭ 19.10.2010.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 6 работ, из них четыре в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит два графика, таблицу и 33 рисунка. Список литературы включает 126 источников, включая 50 источников иностранной литературы.
