Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о тимусе как нейроиммуноэндокринном органе 11
1.1. Анатомия, особенности онтогенеза и гистофизиология тимуса... 14
1.1.1. Анатомия вилочковой железы 14
1.1.2. Особенности развития тимуса в онтогенезе 16
1.1.3. Гистофизиология вилочковой железы 18
1.1.3.1. Субкапсулярная зона .' 18
1.1.3.2.Кортикальная зона 19
1Л .3.3 .Медуллярная зона 20
1.1.3 АВнутридольковые периваскулярные пространства 22
1.2. Динамика возрастной инволюции тимуса человека 24
1.3. Функциональные расстройства тимуса у детей 26
1.3.1. Акцидентальная инволюция 28
1.3.2. Тимомегалия 29
1.4. Функциональная роль нейроиммуноэндокринных взаимодействий в тимусе 31
1.5. Особенности экспрессии серотонина в тимусе и ее функциональное значение 33
1.6. Экспрессия эндотелина-1 в тимусе и ее значение в деятельности тимуса 43
1.7. Особенности экспрессии гормонов инсулина и глюкагона в
тимусе 46
1.7.1. Экспрессия инсулина в тимусе 46
1.7.2. Экспрессия глюкагона в тимусе 53
1.8. Экспрессия хромогранина А в тимусе и ее значение в деятельности тимуса 57
Результаты собственных исследований 65
Глава 2. Материал и методы исследования 65
2.1. Характеристика исследуемого материала 65
2.2. Обработка стекол 65
2.3. Протокол постановки иммуногистохимического (авидин-иотинового) метода 66
2.4. Компьютерный анализ микроскопических изображений и статистическая обработка результатов 68
Результаты исследования и их обсуждение 69
Глава 3. Возрастная динамика экспрессии гормонов в тимусе человека ..69
3.1. Морфологическая структура тимуса у людей разного возраста 69
3.2. Иммуногистохимическое исследование особенностей экспрессии хромогранина А в клетках тимуса людей разного возраста 70
3.3. Иммуногистохимическое исследование особенностей экспрессии серотонина в клетках тимуса людей разного возраста 78
3.4. Иммуногистохимическое исследование особенностей экспрессии эндотелина-1 в клетках тимуса людей разного возраста 85
3.5. Иммуногистохимическое исследование особенностей экспрессии инсулина в клетках тимуса людей разного возраста 92
3.6. Иммуногистохимическое исследование особенностей экспрессии глюкагона в клетках тимуса людей разного возраста 101
Заключение 109
Выводы 111
Указатель литературы
- Особенности развития тимуса в онтогенезе
- Динамика возрастной инволюции тимуса человека
- Протокол постановки иммуногистохимического (авидин-иотинового) метода
- Иммуногистохимическое исследование особенностей экспрессии хромогранина А в клетках тимуса людей разного возраста
Введение к работе
Актуальность темы
Тимус является ключевым органом в системе
нейроиммуноэндокринной'регуляции, выполняет роль иммунного органа и эндокринной железы, осуществляя при этом важные функции, обеспечивающие структурное и функциональное созревание иммунокомпетентньгх клеток. Основная функция тимуса направлена на> формирование рециркулирующего пула зрелых Т-лимфоцитов, что включает в себя дифференцировку Т-лимфоцитов (в частности, появление у них антиген-распознающих рецепторов), разделение Т-клеток на субпопуляции и отбор (селекцию) клонов Т-лимфоцитов, способных распознавать чужеродные антигены. Указанные процессы контролируются сигнальными молекулами клеток микроокружения4 путем их влияния на предшественники Т-лимфоцитов и созревающие тимоциты.
Реализуя эндокринную- функцию, тимус способен продуцировать различные биологически активные вещества, играющие ведущуккроль не только в иммунологических, но и в других физиологических процессах. В тимусе животных и человека была обнаружена экспрессия хромогранина A [Brelinska R., Ostalska D., Zabel M., 2000], который играет роль кофактора во внутриклеточной продукции гормонов. Также показано, что в тимусе птиц и млекопитающих синтезируется ряд биогенных аминов и пептидных гормонов, характерных для других органов и тканей. Ранее в тимусе была показана экспрессия серотонина, мелатонина, глюкагона, инсулина, гастрина [Гордон Д.С., Сергеева В.Е., Зеленова И.Г., 1982; Milicevic N.M., Appassamy P.M., Glic M., et al., 1994; Kvetnoy I.M., Polyakova V.O., Trofimov A.V., et al., 2003].
Известно, что возрастные изменения тимуса играют ключевую роль в ослаблении системы клеточного и гуморального иммунитета у лиц
пожилого и старческого возраста [Полякова В.О., Кветной И.М., Коновалов С.С., и др., 2007]. Сосудистое русло является неотъемлемым компонентом всех органов и играет чрезвычайно важную роль в их функционировании. Таким образом, возрастные изменения сосудов микроокружения могут в значительной степени отразиться на функции тимуса. Основным вазоактивным,гормоном является эндотелин-1, однако данных об экспрессии эндотелина-1 в тимусе в литературе' не обнаружено.
Несмотря на то, что в последнее время большое внимание уделяется изучению эндогенных факторов, препятствующих возрастной инволюции* тимуса, в частности, неспецифических тимусных гормонов, роль неспецифических гормонов в тимусе остается малоизученной, хотя для некоторых показано наличие рецепторов на клетках иммунной системы. Учитывая тот факт, что локальная продукция* гормонов, а также присутствие рецепторов к ним на* иммунокомпетентных клетках могут играть существенную роль в регуляции возрастных изменений в тимусе, верификация и изучение возрастной динамики экспрессии неспецифических гормонов в тимусе является актуальной проблемой современной биогеронтологии.
Цель и задачи исследования.
Целью диссертационного исследования является верификация и изучение возрастной динамики экспрессии гормонов серотонина, эндотелина-1, инсулина, глюкагона и хромогранина А в тимусе человека на разных этапах онтогенеза.
Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи: 1. Верифицировать экспрессию серотонина, эндотелина-1, инсулина,.
глюкагона и хромогранина А в тимусе человека на разных этапах
онтогенеза;
Изучить возрастную динамику экспрессии серотонина, эндотелина-1, инсулина, глюкагона и хромогранина А в тимусе человека;
Выявить корреляции между динамикой экспрессии указанных гормонов и старением у человека;
Оценить вклад возрастных изменений экспрессии исследуемых гормонов в процессы старческой инволюции тимуса.
Научная новизна
В работе впервые верифицирована экспрессия гормонов -хромогранина А, серотонина, инсулина, глюкагона и эндотелина-1 в тимусе человека на всех этапах онтогенеза и установлена возрастная динамика их паракринной секреции. Установлена гистогенетическая и топографическая-вариабельность секреции указанных гормонов на всех этапах онтогенеза и показана возможность выработки гормонов во всех клеточных и тканевых компартментах тимуса.
Впервые зарегистрирована- корреляция между интенсивностью экспрессии гормонов и возрастом, при этом показано, что гормональная активность тимуса продолжает сохраняться на высоком уровне даже при возрастной инволюции органа. Усиление экспрессии ключевого нейроэндокринного маркера хромогранина А в тимусе человека при возрастной инволюции органа свидетельствует о сохранении гормональной функции тимуса в стареющем организме. Установлено, что уровни экспрессии серотонина и глюкагона в тимусе человека постоянны на всех этапах онтогенеза, тогда как интенсивность экспрессии эндотелина-1 и инсулина достоверно увеличивается с возрастом.
Эти факты свидетельствуют о компенсаторной гиперфункции тимуса для гормонотропной регуляции процессов иммуногенеза при старении. Стабильный уровень экспрессии глюкагона и усиление синтеза инсулина в тимусе человека в процессе старения отражает их
важное значение'не только в локальной регуляции иммуногенеза, но и как общегомеостатических гормонов, играющих значительную роль в эндогенных геропротекторных механизмах.
Достоверное усиление экспрессии вазоактивного и иммунотропного гормона эндотелина-1 в тимусе человека с возрастом, наряду с сохранением высокого уровня экспрессии серотонина, также обладающего иммунотропными свойствами, является важным, звеном в сигнальных механизмах поддержания иммунных процессов у пожилых и» старых людей.
Результаты исследования свидетельствуют о важной роли неспецефических гормонов в паракринной регуляции развития и функционирования тимуса человека на всех этапах онтогенеза, в том числе при старении.
Практическая значимость
Впервые зарегистрирована возрастная компенсаторная эндокринная' гиперфункция тимуса, направленная на обеспечение гормонотропной' регуляции процессов иммуногенеза при старении. Результаты исследования' свидетельствуют о важной роли тимуса не только как иммунного, но и как эндокринного органа, обеспечивающего поддержание гормональной регуляции в стареющем организме, несмотря на развитие инволюционных процессов. Полученные данные открывают перспективы для разработки подходов к стимуляции угасающих иммунных процессов при старении через регуляцию локальной секреции гормонов в тимусе человека.
Положения, выносимые на защиту
1. Тимус человека является активно функционирующим эндокринным органом. На всех этапах онтогенеза в тимусе зарегистрирована
экспрессия хромогранина А, серотонина, инсулина, глюкагона, эндотелина-1.
Экспрессия указанных гормонов гистогенетически вариабельна и верифицируется в различных клеточных и тканевых элементах тимуса: тимоцитах, эпителиальных клетках, клетках микроокружения, сосудах, структурах жировой и соединительной ткани.
Гормональная, активность, тимуса* не подвергается возрастной инволюции. Для хромогранина А, эндотелина-1 и инсулина< зарегистрировано даже усиление их секреции с возрастом.
Возрастная. эндокринная гиперфункция- тимуса носит компенсаторный характер и направлена на обеспечение гормонотропной-регуляции процессов иммуногенеза при старении.
Связь с научно-исследовательскойфаботой Института
Диссертационная- работа является логическим продолжением, исследований, проводимых при выполнении магистерской диссертации в і лаборатории клеточной биологии и патологии СПб ИБГ СЗО РАМН.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ данных литературы по функциональной морфологии тимуса и роли гормонов в регуляции иммунных и эндокринных функций железы. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в данном исследовании. Глава 3 представляет собственные экспериментальные данные изучения возрастной динамики экспрессии гормонов в тимусе человека. В разделе «заключение» обсуждаются полученные результаты. Текст диссертации изложен на 128 страницах, содержит 8 таблиц, иллюстрирован 37 рисунками. Список литературы содержит 149
источников, из которых отечественных — 38;
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ. Из них статей - 1, тезисов докладов —12.,
Апробация и реализация диссертации
Материалы; диссертации доложены на-Всероссийской! конференции молодых: исследователей. «Физиология? и медицина» (Санкт-Петербург, 2005); Девятой Всероссийской* медико-биологической конференции; молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006); II научно-практической; геронтологической? конференции с международным: участием; посвященной памяти Э.С. Пушковой «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2006); конференции «Медицинская иммунология»» (Санкт-Петербург, 2006); Десятой^ Всероссийской? медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2007); VI Европейском Конгрессе Международной Ассоциации Геронтологии- и Гериатрии (Санкт-Петербург, 2007); III научно-практической? геронтологической конференции с международным участием, посвящеппой; памяти Э.С. Пушковой «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2007); V Всероссийской конференции с международным участием; посвященной;100-летию со дня рождения В.Н. Черниговского «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007); Г 1-й Путинской международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2007).
Особенности развития тимуса в онтогенезе
В эмбриогенезе тимус формируется раньше других лимфоидных образований (Кемилева 3., 1984). Местные компоненты тимуса формируются из третьего глоточного кармана (эктодерма) с участием третьей жаберной щели (энтодерма) (Manley N.R., 2000; Zou D., Silvius D., Davenport J., et al., 2006). Некоторые авторы считают, что эпителиальные клетки вилочковой железы являются по преимуществу производными энтодермы, в то время как другие исследователи полагают, что эпителий глубоких слоев коры тимуса происходит из энтодермы, а эпителий субкапсуллярной зоны коры и мозгового слоя - из эктодермы (рис. 2). эктодерма? мезенхима нервного гребня эндодерма третьего глоточного наиз кармана отпочковывание и рост зачатка паттернинг и дифференцировка начинается через взаимодействие эпителий-тимоцит мезенхимальной капсуле
Формирование зачатка тимуса у мыши (по Manley N.R., 2000. Рисунок отображает наиболее ранние стадии развития тимуса мыши вплоть до инициации взаимодействий эпителий-тимоцит; ЕЮ, Ell, Е12.5 - дни внутриутробного развития.
Вилочковая железа у человека закладывается на 4 неделе внутриутробного развития и существует первоначально как эпителиальная структура. На 3-м месяце в неё проникают элементы мезенхимы, формирующие в дальнейшем соединительнотканные структуры стромы органа (ретикулярную ткань, сосуды и междольковые перегородки), формируются тимические тельца (Jenkinson W.E., Rossi S.W., Jenkinson E.J., et al., 2005). Источником предшественников лимфоцитов тимуса в эмбриональный период служит гемопоэтическая-ткань печени, клетки которой заселяют орган (Manley N.R., Blackburn С.С., 2003). Первые лимфоциты в тимусе появляются у человека на 7-9 неделе внутриутробного развития. Число лимфоцитов в вилочковой железе растёт наиболее быстро в периоды с 12" по 15 неделю и с 18 по 22 неделю внутриутробного развития. При этом число Т-лимфоцитов составляет около 80-85% от общего количества клеток и не меняется до момента рождения. С 12 недели внутриутробного развития начинается заселение Т-лимфоцитами периферических лимфоидных органов по мере их созревания, начиная с селезёнки (Анисимова В ТВ, 1994). Число В-лимфоцитов в тимусе составляет около 1% и мало, меняется как в период внутриутробного развития, так и после рождения (Ярилин А.А., Пинчук ВТ., Гриневич Ю.А., 1991).
Все структурные компоненты вилочковой железы обнаруживаются уже на 12 неделе эмбрионального развития. На 4 месяце внутриутробного развития происходит эмиграция Т-лимфоцитов и заселение ими периферических лимфоидных органов (Askin D.F., Young S., 2001). К моменту рождения тимус структурно и функционально сформирован полностью и является самым крупным лимфоидным органом, масса его, в среднем, составляет 15-20 грамм.
Начиная с 7-х суток после рождения, тимус начинает функционировать как у взрослых людей. Срок развития тимоцитов от момента поступления клеток-предшественников в тимус до эмиграции зрелых Т-лимфоцитов на периферию составляет 20 суток (Askin D.F., Young S., 2001; Goronzy J.J., Weyand СМ., 2005). Начиная с первого года і жизни, происходит постепенная инволюция тимуса (Быков В.Л., 1997; , Полякова В.О., Кветной И.М., Хавинсон В.Х. и др., 2001; Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Южаков В,В. и др., 2003). Возрастная (физиологическая) инволюция вилочковой железы подразумевает уменьшение с возрастом массы и объёма паренхимы органа с замещением ее жировой тканью.
Динамика возрастной инволюции тимуса человека
Начиная с первого года жизни, происходит постепенная инволюция тимуса (Быков.В.Л., 1997; Полякова В.О., Кветной И.М;, Хавинсон В.Х. и др., 2001; Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Южаков В.В. и: др., 2003). Возрастная (физиологическая) инволюция вилочковой железы представляет собой уменьшение с возрастом массы и объёма паренхимы органа с замещением жировой тканью. Объём и масса истинной паренхимы вилочковой железы несколько увеличивается в первые месяцы жизни, а затем прогрессивно снижается с довольно большой скоростью до 40 лет, после чего скорость инволюции замедляется (АнисимоваВ.П., 1994).
Выделяют следующие этапы возрастной инволюции вилочковой железы:
I — 1-10 лет - атрофия паренхимы идёт со скоростью Г,5% в год. Превышающий эту скорость рост ВПП и междольковои стромы ведёт к увеличению массы железы. Уровень продукции тимических гормонов и Т-лимфоцитов максимальный.
II — 11-25 лет - атрофия паренхимы усиливается, её скорость сравнивается со скоростью роста ВПП, что поддерживает общую массу вилочковой железы. Начинает снижаться продукция гормонов и уменьшаться популяция Т-лимфоцитов.
III — 26-40 лет - атрофия паренхимы достигает скорости 5% в год. Уменьшается объём ВПП. Среди тимических телец начинают часто встречаться обызвествлённые формы. Этот признак, а также очаги склероза стромы, атрофия части долек являются свидетельствами перенесённых в течение жизни различных неблагоприятных ситуаций, в том числе заболеваний.
IV — старше 40 лет - медленная атрофия паренхимы со скоростью 0,1% в год, усиливается атрофия ВПП.
С возрастом снижаются все показатели Т-клеточного иммунитета, включая число Т-лимфоцитов в периферической крови и лимфоидных органах и продукцию цитокинов.
В 70-90 лет выработка тимических гормонов падает на 50-70%, а продукция Т-лимфоцитов хоть и сохраняется, но на более низком уровне (Анисимова В,П., 1994). Снижение функции вилочковой железы с возрастом по-видимому является причиной развития иммунодефицитов при старении, что приводит к учащению иммунопатологических процессов и онкологических заболеваний с возрастом (табл. 2) (Анисимова В.П., 1994; Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Южаков В.В. и др., 2003).
Возрастная инволюция обусловлена прежде всего внутритимическими факторами и генетически запрограммирована. В таблице 2 приведен список вполне убедительных последствий инволюции тимуса. Инволюция тимуса может увеличить продолжительность жизни, благодаря низкой встречаемости периферических аутореактивных Т-клеток, или наоборот, может сокращать продолжительность жизни за счет снижения периферического иммунного ответа. Однако, остается открытым вопрос, как и в каком соотношении реализуются эти возможности, и влияет ли тимэктомия на продолжительность жизни.
В детском возрасте могут наблюдаться нарушения функций тимуса, связанные с такими заболеваниями, как акцидентальная инволюция тимуса (АИТ) и тимомегалия (табл. 3).
АИТ представляет собой быстрое- уменьшение массы и объема тимуса, что сопровождается падением количества Т-лимфоцитов и снижением продукции тимических гормонов.
Тимомегалией принято считать увеличение объема и массы тимуса выше предельных возрастных значений с сохранением нормальной гистоархитектоники органа.
Эти заболевания часто сопровождаются тяжелыми патологическими состояниями, требующими своевременной,- адекватной. диагностики иммунологического статуса.
Причиной, АИТ могут явиться различные чрезмерно сильные стрессирующие факторы, такие как травма, инфекции, интоксикации, и-другие. Морфологически АИТ сопровождается массовой миграцией лимфоцитов из тимуса в кровоток, интенсивной-гибелью лимфоцитов в тимусе и. фагоцитозом погибших клеток макрофагами (иногда, фагоцитозом нормальных, не погибших лимфоцитов), разрастанием эпителиальной основы тимуса и усилением синтеза тимозина, стиранием границы между корковой и мозговой частью долек. Ведущее значение в этом процессе отводится влиянию глюкокортикостероидов (Капитонова М.Ю., Кузнецов, С.А., Клаучек СВ. и др., 2006; Roggero Б., Perez A.R., Tamae-Kakazu М., 2006).
Акцидентальная инволюция развивается в виде 5 фаз:
1. Первая фаза-АИТ характеризуется-увеличением массы тимуса в пределах 50% от возрастной нормы за счет расширения его корковой зоны с накоплением в субкапсулярной зоне лимфобластов.
2. Вторая фаза связана с началом инволютивных изменений. Она характеризуется возникновением картины «звездного неба» в корковом веществе в результате увеличения в коре количества макрофагов. Со стороны тимических телец изменений не наблюдается. Развивается1 отек стромы, выраженное полнокровие, иногда — кровоизлияния в ткань тимуса.
3. В третьей фазе АИФ на: первый план: выступает нарастающая І гибель лимфоцитов корковой» зоны,при-;сохранности их в,мозговой;зоне. Возникают изменения со: стороны, тимических; телец: их- количество? увеличивается; большей» частью? они; мелкие;, начинают появляться не только Bt мозговом веществе;, но и? в: области коры;. Происходит увеличение" числа щ размеров внутри- и межклеточных кист ВІ медуллярной зоне.
4. Вчетвертой фазе; прогрессирующий; процесс: гибёлш лимфоцитов ведет к опустошению: медуллярной-: зоны- тимуса. Тимические; ДОЛЬКИ: принимают вид однородных образований; состоящих из: сморщенных эпителиальных; клеток.. Встречаются? гомогенезированные тимические-тельца с резко: уплощенными эпителиальными: клетками» по: периферии, некоторые из них обызвествляются; Соединительнотканная капсулам расширена,.междольковаяісоединительная-ткань гиперплазирована;.в нош встречаются:островки:жировой ткани шгиализированные сосуды.
5; Ш пятой фазе АИТ, которая; является необратимой, нарастает коллагенизация стромы. От тимических долек местами остаются лишь узкие тяжи; клеточных: скоплений С включенными в них тимическими тельцами, частично или полностью обызвествленными: (Ивановская Т.Е., Зайратьянц О.В., Леонова Л.В; и др;, 1996). Крупные сосуды и капсула, как правило;, резко склеротезированы. Среди стромы часто можно видеть островки жировой клетчатки;
Протокол постановки иммуногистохимического (авидин-иотинового) метода
1. Подготовка срезов. Стекла со срезами в контейнере размещали зигзагообразным образом, чтобы они не прилипали друг к другу, и помещали в термостат (+56С) на 30 минут.
2. Депарафинизация и регидратация (18 минут). Сразу после термостата проводили через батарею со следующей последовательностью: 1 — ксилол, 2 — ксилол, 3 - спирт 96%, 4 — спирт 96%, 5 - спирт 96%, 6 — спирт 75%. В каждом растворе держали по 3 минуты. При пернесении из одного раствора в другой контейнер со стеклами хорошо стряхивали, чтобы не загрязнять последующие растворы.
3. Промывка в дистиллированной воде 3 минуты.
4. Кипячение в 0,0ЧМ цитратном буфере (пункты 4 и 5 применительно к серотонину, эндотелину-1 и хромогранину А). Термостойкий контейнер со стеклами помещали в Paskal S2800 с кипящим буфером так, чтобы стекла были полностью покрыты буфером, и была исключена возможность формирования пузырей на поверхности срезов при кипячении, так как это может создать опасность получения ложноотрицательного результата. Кипятили срезы при высоком давлении 1,5-2 минуты.
5. Остывание и промывка срезов. Контейнер со стеклами сразу помещали в дистиллированную воду на 1 минуту, затем в рабочий раствор TpHC-NaCl-буфера на 10-15 минут для остывания срезов.
6. Блокирование эндогенной пероксидазы. Контейнер со стеклами помещали в 3% водный раствор перекиси на 10 минут. 7. Промывка в 2 сменах дистиллированной воды по 5 минут. 8. Промывка в 2 сменах TpHC-NaCl-буфера по 5 минут. 9. Инкубация с первыми (специфичными) антителами Использовались моноклональные мышиные антитела к хромограниу А человека (1:150, Dako), моноклональные мышиные антитела к серотонину человека (1:50, Dako), моноклональные мышиные антитела к эндотелину-1 человека (1:150, Dako), моноклональные антитела морской свинки к инсулину свиньи (1:100, Dako), моноклональные антитела к глюкагону человека (1:75, Dako). Со стекол стряхивали буфер и наносили 50-100 мкл первых антител. Стекла помещали во влажную камеру и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. 10. Промывка в 2 сменах TpHC-NaCl-буфера по 5 минут. 11. Инкубация со вторыми биотинилированными антителами (Dako) в течение 10 минут при комнатной температуре (схема нанесения антител та же, что и в пункте 9). 12. Промывка в 2 сменах TpHC-NaCl-буфера по 5 минут. 13. Инкубация с авидин-биотин-пероксидазным комплексом 10 минут при комнатной температуре (схема нанесения антител та же, что и в пункте 9). 14. Промывка в 2 сменах трис-ИаО-буфера по 5 минут. 15. Выявление пероксидазы хрена диаминобензидином (Dako). Проявление реакции наблюдали под световым микроскопом при увеличении х 10. 16. Промывка в 2 сменах дистиллированной воды по 5 минут. 17. Докрашивание гематоксилином Майера от 5 секунд до 1 минуты. 18. Промывка водой. 19. Дегидратация — 15 минут в батарее со следующей последовательностью: 1 - спирт 96%, 2 - спирт 96%, 3 — карбоксилол, 4 — ксилол, 5 — ксилол. В каждом растворе стекла держали по 3 минуты. 20. Заключение в бальзам.
Для оценки интенсивности иммуноокрашивания были проведены морфометрические исследования с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений Nikon Eclipse Е400 и лицензионной программы Videotest Morphology 5.0. Изучались два параметра: оптическая плотность (в условных единицах) и суммарную площадь (в процентах) иммуноокрашенных структур. Измерение оптической плотности позволяет оценить интенсивность экспрессии гормона в каждой конкретной клетке и вычислить среднее значение для среза в целом. Суммарная площадь показывает, какая доля среза приходится на позитивно окрашенные клетки.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы Statistica 5.0. Для оценки достоверности использовался двухсторонний t-критерий Стьюдента {t=(Mr M2)/sGD(l/ni+l/n2)}.
Иммуногистохимическое исследование особенностей экспрессии хромогранина А в клетках тимуса людей разного возраста
Используя: иммуногистохимический метод нами выявлена экспрессия серотонина в тимусе людей изучаемых возрастов (рис. 10-14).
В группе плодов, умерших антенатально, специфическое окрашивание на серотонин обнаружено в следующих структурах тимуса: стенках сосудов медуллярной и кортикальной зон, эритроцитах в просветах сосудов; ш паренхиме тимуса, (в случае кровоизлияния); крупных клетках неправильной формы в медуллярной зоне и соединительнотканной строме тимуса. В отдельных случаях слабое окрашивание наблюдается в тельцах Гассаля (рис. 10).
По сравнению с первой возрастной группой на срезах тимуса детей, умерших в первый год жизни, отмечается интенсивное иммуноокрашивание телец Гассаля. В ВПП наблюдаются небольшие скопления иммуноокрашенных клеток округлой формы, которые, видимо формируют эндотелий новообразующихся сосудов. Также иммуноокрашивание наблюдается в стенках сосудов и эритроцитах (рис.11).
На препаратах тимуса людей пожилого возраста наблюдается иммуноокрашивание крупных одиночных клеток неправильной формы, локализованных в медуллярной зоне и внутридольковых периваскулярных пространств. Также интенсивно окрашены капсулой. Наблюдается слабое окрашивание эпителиальных клеток в медуллярной зоне (рис. 12).
В группах людей старческого возраста и долгожителей тимус практически полностью замещен жировой тканью. Специфическое иммуноокрашивание на серотонин наблюдается в паренхиме немногочисленных тимусных долек в скоплениях клеток, возможно, принадлежащих тельцам Гассаля. Также окрашенные клетки обнаруживаются в субкапсулярной зоне (рис.13, 14).
Подсчет оптической плотности иммуноокрашенных клеток показал, что в группе детей, умерших антенатально интенсивность экспрессии составляет 1,972±0,006 у.е., в группе детей первого года жизни 2,090±0,002 у.е., в группе людей пожилого возраста 1,996±0,002 у.е., у людей старческого возраста 2,028±0,002 у.е., у долгожителей 2,054±0,000 у.е. (рис. 15). Следует отметить, что наши данные не противоречат результатам ранее проведенных исследований, показавших усиление экспрессии серотонина в тимусе человека с возрастом (Kurihara Y.,Kurihara Н., Maemura К. Et al., 1995).
Экспрессия серотонина в клетках тимуса человека. Оптическая плотность иммуноокрашенных структур в разных возрастных группах. Группа 1 - плоды, умершие антенатально; Группа 2 - дети первого года жизни; Группа 3 - люди пожилого возраста; Группа 4 — люди старческого возраста; Группа 5 - долгожители; -достоверное отличие от группы 2 (р 0,05); -достоверное отличие от групп 2 и 5 (р 0,05).
Подсчет суммарной площади окрашенных структур показал, что в тимусе плодов, умерших антенатально, этот показатель составляет 1,952±0,399%, у детей, умерших на первом году жизни, суммарная площадь экспрессии составляет 1,640±0,207%; для группы людей пожилого возраста этот показатель составляет 2,164±0,311%; в группе людей старческого возраста - 1,522±0,057%; в группе долгожителей -2,370±0,322% (рис. 2).
Достоверно меньшей оказалась площадь экспрессии на препаратах тимуса детей первого года жизни и людей старческого возраста по сравнению с группой пожилых людей, и группой долгожителей. Также достоверным было отличие между площадью экспрессии в тимусах плодов, умерших антенатально Экспрессия серотонина в клетках тимуса человека. Процент суммарной площади иммуноокрашенных структур в разных возрастных группах. Группа 1 - плоды, умершие антенатально; Группа 2 - дети первого года жизни; Группа 3 — люди пожилого возраста; Группа 4 — люди старческого возраста; Группа 5 - долгожители; -достоверное отличие от групп 3 и 5 (р 0,05); -достоверное отличие от групп 1, 3 и 5 (Р 0,05).
Полученные нами данные демонстрируют, что площадь экспрессии серотонина примерно одинакова на препаратах тимуса детей первого года жизни и людей старческого возраста, а на срезах тимуса долгожителей площадь экспрессии достоверно не отличается от таковой в тимусах плодов. Кроме того, нами обнаружен довольно высокий уровень экспрессии этого гормона в период эмбриогенеза (19-22 неделя внутриутробного развития) и в период раннего онтогенеза (первый год жизни). Ранее показано (Kvetnoy I.M., Polyakova V.O., Trofimov A.V. et al., 2003), что серотонин в тимусе экспрессируется, начиная с 12 недели внутриутробного развития. Таким образом, экспрессия серотонина в период становления тимуса как лимфоидного органа может свидетельствовать в пользу того, что эндокринная функция тимуса на ранних этапах развития является приоритетной.
В литературе имеются данные, сообщающие о положительных корреляционных связях между усилением экспрессии серотонина в эпителиальных клетках тимуса человека с возрастом и усилением пролиферативной активности тимоцитов в корковом веществе тимуса (Kurihara Y.,Kurihara Н., Maemura К. Et al., 1995). В тимусе, подвергшемся возрастной инволюции, когда паренхима в значительной степени замещена жировой тканью, и значительно снижены все показатели Т-системы иммунитета экспрессия серотонина поддерживается на высоком уровне.
В данной работе нами обнаружена одинаковая интенсивность экспрессии этого гормона в тимусе плодов, умерших антенатально, детей первого года жизни и людей старше 60 лет. Анализ собственных результатов и сравнение их с данными литературы позволяет заключить, что роль тимуса как эндокринной железы, остается существенной в организме человека даже после значительного угасания иммунной функции тимуса. Это дает основание предположить, что эндогенный серотонин вовлечен в поддержание функций иммунной системы у людей старшего возраста.
