Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о тимусе как нейроиммуноэндокринном органе 12
1.1. Основные сведения об анатомии и особенностях онтогенетического развития тимуса 13
1.1.1. Анатомия тимуса 13
1.1.2. Особенности развития тимуса в онтогенезе 16
1.2. Особенности клеточного строения тимуса 20
1.2.1. Лимфоидные клетки и CD5 как их маркер 20
1.2.2. Клетки микроокружения тимуса 23
1.2.3. Возрастные дефекты микроокружения тимуса 27
1.3. Особенности синтеза серотонина в тимусе и его функциональное значение как фактора паракринной регуляции 32
1.3.1. Серотонин как полифункциональная молекула 32
1.3.2. Роль серотонина в тимусе 34
1.4. Фактор роста сосудов и его роль в функционировании тимуса 37
1.4.1. Основные сведения о биологических эффектах фактора роста сосудов 37
1.4.2. Экспрессия фактора роста сосудов в тимусе 40
1.5. Функциональная роль NO-синтазы в тимусе человека 42
1.5.1. Основные сведения о NO-синтазе и роль данного фермента в тимусе 41
1.5.2. NO-синтаза как маркер тучных клеток 45
1.6. CD35 и его значение в тимусе человека 48
1.6.1. Основные функции CD35 48
1.6.2. CD35 - маркерный протеин дендритных клеток 49
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Характеристика исследуемого материала 53
2.2. Подготовка препаратов тимуса и гистологическое исследование 55
2.3. Метод иммуногистохимической окраски препаратов тимуса 56
2.4. Морфометрические исследования и статистическая обработка результатов 59
Глава 3. Возрастная динамика факторов микроокружения в тимусе человека 61
3.1. Результаты светооптического исследования тимуса человека 61
3.2. Результаты иммуногистохимического исследования тимуса человека 64
3.2.1. Содержание серотонина в тимусах людей разных возрастных групп 64
3.2.2. Экспрессия фактора роста сосудов в тимусе человека 70
3.2.3. Экспрессия NO-синтазы в тучных клетках тимуса человека...75
3.2.4. Экспрессия CD35 в дендритных клетках тимуса человека 81
3.2.5. Экспрессия CD5 в тимусе человека 87
3.2.6. Корреляционный анализ результатов иммуногистохимического исследования 93
Глава 4. Роль факторов микроокружения тимуса в поддержании пула Т-лимфоцитов в процессе онтогенеза 100
Выводы 113
Список литературы 115
- Особенности развития тимуса в онтогенезе
- Основные сведения о биологических эффектах фактора роста сосудов
- Метод иммуногистохимической окраски препаратов тимуса
- Результаты светооптического исследования тимуса человека
Введение к работе
Актуальность темы
Тимус, наряду с костным мозгом, играет ключевую роль в развитии клеток иммунной системы. Образовавшиеся из стволовых клеток костного мозга предшественники Т-лимфоцитов мигрируют в тимус для созревания, где и происходит процессинг лимфоцитов, включающий отбор клеток и их клонов, которые распознают молекулярные конфигурации, значимые для защиты организма, и выбраковку аутореактивных клонов. Затем лимфоциты дифференцируются на две субпопуляции: Т-хелперы и Т-киллеры. Процесс созревания Т-лимфоцитов сопряжен с перемещением тимоцитов по компартментам тимуса и взаимодействием с клетками микроокружения, среди которых важное место занимают эпителиальные, тучные и дендритные клетки [Ярилин А.А., 1999; Ноздрачев А.Д., 2004].
Известно, что регуляция функций тимуса осуществляется большим количеством разнообразных сигнальных молекул, продуцируемых клетками микроокружения [Чернышева М.П., 1995; Полякова В.О., ' Кветной И.М., 2004], среди которых биогенные амины, нейропептиды, цитокины и другие биологически активные вещества, осуществляющие Л. нейроиммуноэндокринные взаимодействия. Так, например, показано, что эндогенный серотонин оказывает митогенное действие на пролиферацию лимфоидных клеток [Kvetnoy I.M. et al., 2003]. В тимических эпителиальных клетках синтезируется фактор роста сосудов (VEGF -vascular endothelial growth factor) - один из основных паракринных регуляторов ангиогенеза [Muller S.M. et al., 2005]. Тучные клетки экспрессируют более 20 сигнальных молекул, среди которых основной фермент, катализирующий образование свободных радикалов, NO-синтаза [MoulianN. etal.,2001].
Возрастные инволютивные изменения тимуса, играющие ключевую роль в ослаблении системы клеточного и гуморального иммунитета, связаны с динамикой секреции факторов микроокружения [Пальцев М.А.,
Кветной И.М., 2008]. В связи с тем, что старение иммунной системы инициируется процессами, происходящими в тимусе, изучение возрастной динамики локальной экспрессии факторов микроокружения в вилочковой железе и их роли в процессах пролиферации и дифференцировки тимоцитов позволят не только более глубоко понять механизмы функционирования и возрастной инволюции тимуса, но и обосновать новые подходы к профилактике и коррекции возрастных иммунодефицитов и ассоциированных с ними нейроэндокринных расстройств.
Цель и задачи исследования
Целью диссертационного исследования является верификация и изучение возрастной динамики содержания серотонина, фактора роста сосудов, NO-синтазы и белка дендритных клеток CD35 в клетках микроокружения, оценка их роли в процессах возрастной инволюции тимуса человека.
Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
Верифицировать содержание серотонина, фактора роста сосудов (VEGF), NO-синтазы в тучных клетках, маркерного протеина дендритных клеток CD35 и маркерного протеина Т-лимфоцитов CD5 в тимусе человека в разных возрастных группах;
изучить возрастную динамику содержания серотонина, VEGF, NO-синтазы и протеина CD35 в клетках микроокружения тимуса человека;
изучить возрастные количественные изменения пула Т-клеток тимуса человека по экспрессииих маркерного протеина CD5;
установить возможные корреляционные взаимосвязи между содержанием серотонина, VEGF, NO-синтазы, протеина CD35 и количеством Т-клеток на разных этапах онтогенеза человека;
5. оценить роль конкретных факторов микроокружения тимуса человека в регуляции пула Т-лимфоцитов в процессе онтогенеза и при старении.
Научная новизна
В работе впервые верифицирована экспрессия и изучена возрастная динамика содержания таких факторов микроокружения, как серотонин, NO-синтаза, CD35, VEGF, а таюке маркерного протеина Т-лимфоцитов CD5 в тимусе человека. Впервые зарегистрированы корреляции между интенсивностью продукции факторов микроокружения и состоянием популяции Т-клеток на разных этапах онтогенеза человека. Выявлено сохранение синтеза серотонина в тимусе вплоть до старческого возраста, что отражает сохранность эндокринной функции железы при старении. Зарегистрировано снижение экспрессии VEGF в тимусе при старении, что свидетельствует о вовлечении ангиогенных факторов в механизм возрастной инволюции тимуса через нарушение трофики органа. Впервые выявлено возрастание экспрессии NO-синтазы в тимусе при старении, что отражает ключевую роль возрастного накопления свободных радикалов, приводящего к структурно-функциональной инволюции тимуса. Полученные данные значительно расширяют существующие представления о роли сигнальных молекул в регуляции функций тимуса в процессе онтогенеза, демонстрируя важный вклад клеток микроокружения в поддержание деятельности тимуса в стареющем организме.
Практическая значимость
Полученные результаты позволяют оценить важную регулирующую роль факторов микроокружения в» тимусе человека на всем протяжении онтогенеза, что открывает пути разработки новых подходов для таргетной терапии возрастных иммунодефицитов и других заболеваний, ассоциированных со старением.
Положения, выносимые на защиту
Сигнальные молекулы, вырабатываемые клетками микроокружения тимуса, играют важную регулирующую роль для обеспечения межклеточных коммуникаций в тимусе на всем протяжении онтогенеза и при старении.
Серотонин, фактор роста сосудов (VEGF) и NO-синтаза являются ключевыми факторами развития инволюционных процессов в тимусе человека при старении.
Сохранность популяции Т-лимфоцитов в процессе онтогенеза регулируется экспрессией факторов микроокружения тимуса.
Возрастная динамика факторов микроокружения обеспечивает достаточный уровень нейроиммуноэндокринных функций тимуса в стареющем организме.
Связь с научно-исследовательской работой Института
Диссертационная работа является логическим продолжением исследований, проводимых при выполнении магистерской диссертации в лаборатории клеточной биологии и патологии СПб ИБГ СЗО РАМН.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ данных литературы, отражающий современные представления о функциональной морфологии тимуса и роли факторов микроокружения (серотонина, фактора роста сосудов, NO-синатзы и CD35) в процессе возрастной инволюции железы. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в данном исследовании. Глава 3 представляет собственные экспериментальные данные изучения возрастной динамики факторов микроокружения в тимусе человека. Глава 4 посвящена обсуждению результатов исследования. Текст диссертации изложен на 129 страницах,
содержит 6 таблиц, иллюстрирован 54 рисунками. Список литературы содержит 151 источник, из которых 60 отечественных.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ для опубликования материалов диссертационных исследований.
Апробация и реализация диссертации
Материалы диссертации доложены на Девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006); X Всероссийском Форуме с международным участием им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006); II научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященной памяти Э.С. Пушковой «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2006); Десятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2007); VI Европейском Конгрессе Международной Ассоциации Геронтологии и Гериатрии (Санкт-Петербург, 2007); V Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения В.Н. Черниговского — «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007); 11-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007); III научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященной памяти Э.С. Пушковой «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2007); студенческой научной конференции «Геронтологические чтения» (Белгород, 2008); VI Всероссийской
конференции с международным участием, посвященной 50-летию открытия A.M. Уголевым мембранного пищеварения - «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2008); IV научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященной памяти Э.С. Пушковой «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2008).
Особенности развития тимуса в онтогенезе
Местные компоненты тимуса формируются из третьего глоточного кармана (эктодерма) с участием третьей жаберной щели (энтодерма). Имеется мнение о том, что? эпителиальные клетки вилочковой железы являются по преимуществу производными энтодермы, в то время как, другие исследователи полагают, что эпителий глубоких слоев коры тимуса происходит из энтодермы, а эпителий субкапсулярной зоны коры и мозгового слоя — из эктодермы [Ивановская Т.Е. и др., 1996; Ярилин А.А., 1999]. Соединительнотканные элементы тимуса, как и клетки костномозгового происхождения, возникают из мезодермы.
Тимус закладывается на 4-й неделе внутриутробного развития раньше других лимфоидных и эндокринных органов. К 8-9 неделе внутриутробного развития вилочковая железа становится местом активного лимфопоэза, не зависящего от антигенного стимулирования [Shortman К., Wu L., 1996]. Такую изоляцию тимуса от антигенных стимулов внешней среды обеспечивает, в частности, плацентарный барьер. Начиная с 9 і недели, эпителиальные тяжи превращаются в рыхлую сетчатую структуру, в петлях которой располагаются округлые крупные митотически активные лимфоидные клетки. После 11 недели в железе уже можно различить мозговое и корковое вещество [Полякова В.О., Кветной И.М., 2004; Капитонова М.Ю. и др., 2006]. Основные этапы формирования тимуса у человека представлены в табл. 1.
У новорожденных тимус хорошо развит - к моменту рождения это самый крупный лимфоидный орган, его ткань активнее всех других продуцирует лимфоциты. Начиная с 7-х суток после рождения, устанавливается, свойственный взрослым людям, режим работы тимуса: в него постоянно поступают клетки-предшественники из костного мозга, которые дифференцируются преимущественно в ар+-Т-клетки, пополняющие периферический пул Т-лимфоцитов [Capone М. et al., 1998; Wilkinson В. et al., 1999; Rothenberg E.V., Dionne С J., 2002]. Срок развития тимоцитов от момента поступления клеток-предшественников в тимус до эмиграции на периферию составляет около 20 суток, хотя in vitro весь процесс дифференцировки от стадии «тройных отрицательных» (CD3 CD4 CD8") клеток до стадии «одинарно положительных» (CD4+ или CD8 ) клеток занимает всего 5 суток [Goldrath A.W., Bevan M.J., 1999]. Рост тимуса продолжается до наступления половой зрелости, масса его к этому времени составляет 30-40 г, в дальнейшем происходит инволюция железы [Бабаева Ж.Н., Споров О.А., 1987; Terra R. et al., 2002].
Возрастная инволюция тимуса характеризуется наиболее выраженными (по сравнению с другими органами) изменениями, имеющими схожие черты у различных представителей млекопитающих. Относительная масса тимуса к моменту рождения максимальна, затем она постепенно уменьшается за счет опережающего роста общей массы тела [Белецкая Д.В., Гнездицкая Э.В., 1986]. При этом абсолютная масса тимуса растет, достигая максимума ко времени полового созревания. С этого момента масса тимуса уменьшается экспоненциально, причем в большей степени за счет коркового слоя и в меньшей - мозгового, с замещением лимфоидной ткани соединительной и жировой тканями (рис.2). Имеются данные о том, что замещение паренхимы тимуса жировой тканью представляет непрерывный процесс, достигающий максимума у людей в возрасте около 50 лет и более уже не прогрессирующий. При этом исчезают тельца Гассаля, нарушается правильное расположение эпителиальных клеток, уменьшается общее число лимфоцитов, накапливаются содержащие различные включения и обломки клеток, макрофаги, плазматические и тучные клетки. Однако, есть сведения о том, что количество соединительной ткани в тимусе может не снижаться после достижения 30-летнего возраста [Балаболкин М.И., 1998; Berthiaume F. et al., 1999].
Как видно на рисунке 2, уже с пубертатного возраста начинает происходить заполнение периваскулярного пространства жировой тканью. В тимусе людей в возрасте 50 лет и старше адипоциты заполняют большую часть пространства железы, в то время как у новорожденных клетки данного типа практически не представлены.
В 1985 году Стейнман и соавторы [Steinman G.G. et al., 1985; Steinman G.G., 1986] продемонстрировали снижение функционально активности тимуса с возрастом. Обнаружение в тимусе человека двух основных компонентов — тимического эпителия, в котором происходит процесс тимопоэза, и периваскулярного пространства — было критическим моментом в понимании механизмов атрофии тимуса. Расширение периваскулярного пространства (за счет адипоцитов, периферических лимфоцитов и стромы) с возрастом приводит к изменению соотношения двух данных компонентов. Тимическое эпителиальное пространство сокращается примерно на 10% от общего количества ткани железы к 70 годам. Если экстраполировать данные, полученные Стейнманом, то можно предполагать, что тимус прекращает продукцию новых Т-клеток к 105 годам жизни человека [Graver A.L.et al., 2007].
По современным представлениям именно возрастная инволюция тимуса определяет старение иммунной системы, а вследствие этого и в значительной степени старение всего организма.
Лимфоидные клетки составляют подавляющее большинство клеток тимуса; большая часть их относится к Т-типу [Ройт А. и др., 2000]. В субкапсулярной зоне они представлены "двойными негативными" (CD4" и CD8") - клетками. В корковом веществе популяция лимфоцитов гетерогенна, и они составляют 60-80% всех лимфоцитов тимуса. Большая их часть несет антигены CD1, CD2, CD5, CD7, CD4 и CD8 ("двойные позитивные" CD4+ и CD8+ лимфоциты). В то же время здесь встречаются "двойные негативные" лимфоциты, а также зрелые, с антигеном либо CD4 (Т-хелперы/индукторы), либо CD8 (Т-киллеры/супрессоры) [Gapin L. et al., 2001]. Медуллярные CD4+CD8"- и CD4"CD8+- лимфоциты (15-20%) всех лимфоцитов тимуса) являются зрелыми Т-клетками со свойствами предшественников, соответственно Т-хелперов и Т-киллеров [Галактионов В.Г., 2004; Six Е.М. et al., 2007].
В; тимусе содержится небольшое, число В-лимфоцитов и плазматических клеток (около 1%), функция которых пока не выяснена [Ritter М.А., Palmer D.B:, 1999]. В норме они локализуются исключительно в соединительнотканном компартменте и (в меньшей степени) в мозговом слое.
Известно, что маркер. Т-лимфоцитов человека GD5 представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 67 кДа, полипептидная цепь которого состоит из 471 аминокислот. CD5 экспрессируется на тимоцитах, зрелых Т-лимфоцитах и субпопуляции В-клеток (ВГа).-- [Vila J;Mt et al., 2001; Berland R., Wortis:.H;H.;, 2003;: Rodamilans B. et al.,. 2007]. Структурно GD5 принадлежит семейству экстраклеточных рецепторов-«мусорщиков», богатых цистеином; (scavenger receptor cystein-rich - SRGR); Это семейство5 также включает в себяфецептор-«мусорщик» макрофагов I типа (type I macrophage scavenger receptor),, фактор комплемента человека Ii, рецептор морского ежа (sea urcKin speract receptor) и лимфоидныш антиген CD6 [Burgess K.E. et al., 1992; Laky К., FowlkesBU;, 2007];
Основные сведения о биологических эффектах фактора роста сосудов
VEGF - один из главных регуляторов ангиогенеза как при нормальном процессе роста и репарации, так и при патологических состояниях, таких как, например, злокачественные новообразования. Его важнейшая роль подтверждается тем, что мыши, имеющие всего один аллель нормального VEGF-A, погибают внутриутробно [Ferrara N. et al., 1996].
Семейство VEGF включает прототипную молекулу VEGF-А, а также VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, вирусный гомолог VEGF-E и плацентарный ростовой фактор (PIGF). VEGF-A повышает сосудистую проницаемость и способствует ангиогенезу, VEGF-B, как полагают, играет роль в регуляции деградации внеклеточного матрикса, клеточной адгезии и миграции, а VEGF-C и VEGF-D участвуют, главным образом, в лимфангиогенезе. P1GF в большом количестве экспрессируется тромбобластами, модулируя развитие сосудистой сети в плаценте [Vuorela P. et al., 1997]. Главные функции семейства VEGF представлены на рис. 6.
Рецепторы фактора роста сосудов (VEGF-рецепторы) обнаруживаются в сосудистом (VEGF рецептор-1 и VEGF рецептор-2) и лимфатическом (VEGF рецептор-3) эндотелии. Эффекты разных членов семейства VEGF опосредованы их взаимодействием с данными рецепторами и представлены главным образом в регуляции пролиферации эндотелиальных клеток.
У человека выделены 4 изоформы VEGF-A - VEGF121, VEGF 165, VEGF 189 и VEGF206, которые образуются в результате альтернативного сплайсинга мРНК VEGF. Более крупные формы VEGF связаны с матриксом через гепаринсвязывающие домены, в то время как VEGF 165, наиболее распространенная и значимая изоформа, и VEGF 121 находятся в состоянии, способном к диффузии. Более крупные изоформы находятся в латентном состоянии во внеклеточном матриксе до того момента, как они высвобождаются под действием протеолитических ферментов, таких как плазмин или матричная металлопротеиназа-9. Этот процесс повышает местные концентрации VEGF-A в процессе роста и перестройки тканей [Veikkola Т., Alitalo К., 1999]. VEGF-А также играет важную роль в удержании эндотелиальных клеток новообразованных кровеносных сосудов до момента рекрутмента к ним перицитов [Benjamin L.E. et al., 1998]. Новообразованные сосуды, у которых еще нет перицитов, зависят от VEGF-A, препятствующего апоптозу эндотелиальных клеток и обратному развитию незрелых сосудов [Gerber Н.Р. et al., 1999].
Рецепторы фактора роста сосудов (VEGF-рецепторы) обнаруживаются в сосудистом (VEGF рецептор-1 и VEGF рецептор-2) и лимфатическом (VEGF рецептор-3) эндотелии. Эффекты разных членов семейства VEGF опосредованы их взаимодействием с данными рецепторами и представлены главным образом в регуляции пролиферации эндотелиальных клеток. Группа ученых [Muller S.M. et al., 2005] обнаружила экспрессию гена ключевого сосудистого ростового фактора - VegfA — в эмбриональном и зрелом тимусе. Мышиные эмбрионы, утратившие две или даже одну аллель этого гена, умирают в середине беременности. Эмбриональное развитие у мышей также нарушается при экспрессии гипоморфных аллелей VegfA или, напротив, при повышенном уровне VEGF. Для установления молекулярной основы морфогенеза сосудов тимуса исследователи [Muller S.M. et al., 2005] инактивировали ключевой фактор роста сосудов, VEGF-A, в тимических эпителиальных клетках (ТЭК). Оба аллеля VegfA были удалены, используя стратегию создания «голых» мышей (nude-линии - мутация в транскрипционном факторе Foxnl (forkhead box N1). У мышей с данной мутацией ТЭК не способны дифференцироваться, и тимопоэз полностью блокируется, вызывая тяжелый иммунодефицит [Boehm Т. et al., 2003]. Инъекция Foxnl+ эмбриональных стволовых клеток в Foxnlnu/m бластоцисты восстанавливает функции тимуса (рис. 7). Анализируя клеточные популяции стромы тимуса, было обнаружено, что помимо медуллярных и кортикальных ТЭК существует еще одна значительная популяция клеток — кортикальные мезенхимные клетки. В химерном тимусе медуллярные и кортикальные ТЭК происходили от эмбриональных стволовых клеток, в то время как кортикальные мезенхимные клетки имели иное происхождение. В связи с этим, ген VegfA был удален из ТЭК, в то время как кортикальные мезенхимные клетки продолжали экспрессировать данный ген. Такая генетическая мозаика привела к гиповаскуляризации и нарушению органо-типичной архитектоники кровеносных сосудов [Muller S.M. et al., 2005], что свидетельствовало о необходимости VEGF, продуцируемого ТЭК, для нормального ангиогенеза тимуса. Таким образом, фактор роста сосудов обнаружен в тимусе, показана его критическая роль в эмбриональном развитии, но данные о возрастной динамике VEGF в литературе отсутствуют. 1.5. Функциональная роль NO-синтазы в тимусе человека 1.5.1. Основные сведения о NO-синтазе и роль данного фермента в тимусе Окись азота является первым эндогенно синтезируемым растворенным газом, для которого была доказана физиологическая роль. Опубликовано многочисленное количество работ, касающихся молекулярно-биологических, биохимических, физиологических и фармакологических аспектов функционирования этого медиатора. Показано, что окись азота синтезируется при посредстве семейства из трех изоформ фермента NO-синтазы (NOS) [Башкатова В.Г., Раевский К.С., 1998]: nNOS - нейрональная NOS (тип 1), первоначально обнаруженный в нейрональных клетках центральной и периферической нервной системы; iNOS - индуцибильная NOS (тип 2 или macNOS -макрофагальная NOS, которая, в отличие от nNOS и eNOS, не экспрессируется постоянно; синтез этого фермента может быть индуцирован в клетках различных типов; eNOS - эндотелиальная NOS (тип 3), впервые идентифицированный в клетках эндотелия кровеносных сосудов. Фермент был назван синтазой, а не синтетазой, поскольку для его работы не требуется энергия АТФ. NOS катализирует синтез NO из L-аргинина и молекулярного кислорода при участии NADPH, другим продуктом реакции является L-цитруллин (рис. 8).
Метод иммуногистохимической окраски препаратов тимуса
Для верификации в тканях тимуса серотонина, фактора роста сосудов (VEGF), протеина CD35, NO-синтазы и маркера Т-клеток CD5 был использован иммуногистохимический метод с применением авидин-биотиновой системы визуализации. Метод основан на высокой афинности авидина к биотину. Авидин — это гликопротеин с молекулярной массой 68 кДа, имеющий высокое сродство к биотину — витамину с малой молекулярной массой. Высокая чувствительность авидин-биотинового метода обусловлена химической структурой авидина, имеющего четыре участка связи с биотином.
Метод включает следующие основные этапы инкубации: 1. с немечеными первыми (специфичными) антителами; 2. со вторыми биотинилированными антителами; 3. с комплексом авидина с биотилированной пероксидазой, с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином. Высокая аффинность авидина к биотину и процесс биотинилирования делают данный метод более чувствительным, чем другие иммуногистохимические методы (прямой метод, непрямой пероксидазный метод, метод с использованием растворимых ферментных комплексов) [Эллидини В.Н. и др., 2002]. Для иммуногистохимического исследования использовали первичные моноклональные мышиные анти-человеческие антитела к серотонину (1:50, Dako), VEGF (1:50, Dako), CD35 (1:50, Dako), NO-синтазе (1:50, Dako), CD5 (1:50, Dako). В качестве вторых антител использовали биотинилированные анти-мышиные иммуноглобулины из универсального набора (Dako). Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Dako). Протокол иммуногистохимического исследования приведен ниже: Протокол постановки иммуногистохимического (авидин-биотинового) метода [по Эллидини В.Н. и др., 2002]: 1. Подготовка срезов. Стекла со срезами в контейнере разместить зигзагообразным образом, чтобы они не прилипали друг к другу, и поместить в термостат (56С) на 30 минут. 2. Депарафинизация и дегидратация (18 минут). Сразу после термостата стекла провести через батарею со, следующей последовательностью: 1 - ксилол, 2 - ксилол, 3 — спирт 96%, 4 — спирт 96%, 5 — спирт 96%, 6 - спирт 75%. В каждом растворе держать по 3 минуты. При перенесении из одного раствора в другой стекла надо хорошо встряхивать, чтобы не загрязнять последующие растворы. 3. Промывка в дистиллированной воде 3 минуты. 4. Кипячение в 0,01М цитратном буфере (рН—6,0) в скороварке. Термостойкий контейнер со стеклами поместить вг скороварку с кипящим буфером так, чтобы стекла были полностью покрыты буфером, и была исключена возможность формирования пузырей на поверхности срезов при кипячении, так как это может создать опасность получения ложноотрицательного результата. Кипятить срезы при высоком давлении 1,5-2 минуты (о достижении высокого давления свидетельствует появление струйки пара). 5. Остывание и промывка срезов. После кипячения скороварку сразу поместить под струю холодной воды. Как только опустится клапан регулятора давления можно осторожно открыть скороварку и контейнер со стеклами сразу поместить в дистиллированную воду на 1 минуту, затем в рабочий раствор TpHC-NaCl-буфера на 10-15 минут для остывания срезов. 6. Блокирование эндогенной пероксидазы. Контейнер со стеклами поместить в 3%-ый водный раствор перекиси водорода на 10 минут. 7. Промывка в 2 сменах дистиллированной воды по 5 минут. 8. Промывка в 2 сменах TpHC-NaCl-буфера по 5 минут. 9. Инкубация с нормальной неиммунной сывороткой (Novocastra) в течение 30 минут при комнатной температуре. Стекла со срезами достают по одному из контейнера, находящегося в буфере, аккуратно протирают вокруг срезов излишки буфера, оставляя срез влажным. Затем обводят срез гидрофобным карандашом (DAKO) и стряхивают стекло перед нанесением нормальной сыворотки (стряхивание стекол необходимо для избежания переразведения сывороток или антител, наносимых на срез). Наносят 50-100 мкл нормальной блокирующей сыворотки и помещают во влажную камеру. Ю.Инкубация с первыми (специфичными) антителами (DAKO). Со стекол стряхивают нормальную сыворотку и наносят 50-100 мкл первых антител. Стекла помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 60 минут в термостате при 37С. ИЛромывка в 2 сменах TpHC-NaCl-буфера по 5 минут. И.Инкубация со вторыми биотинилированнылш антителами (DAKO) в течение 10 минут при комнатной температуре (схема нанесения антител та же, что и в пункте 9). ІЗ.Промьгвка в 2 сменах TpHC-NaCl-буфера по 5 минут. Ы.Инкубация с авидин-биотин-пероксидазным комплексом 10 минут при комнатной температуре (схема нанесения антител та же, что и в пункте 9). 15.Промывка в 2 сменах TpHC-NaCl-буфера по 5 минут. Іб.Вьіявление пероксидазы хрена диаминобензидином (DAKO). Для проявления реакции требуется 5-10 минут. Длительная реакция с диаминобензидином может дать нежелательный фон. 11.Промывка в 2 сменах дистиллированной воды по 5 минут. 18.Докраска гематоксилином Майера от 5 секунд до 1 минуты. 19.Промывка дистиллированной водой. 20.Дегидратация — 15 минут в батарее со следующей последовательностью: 1 — спирт 96%, 2 - спирт 96%, 3 -карбоксилол, 4 — ксилол, 5 — ксилол. В каждом растворе по 3 минуты. 21.Заключение в бальзам или синтетическую смолу. Продукт иммуногистохимической реакции проявлялся в виде желто-коричневого окрашивания клеток тимуса.
Результаты светооптического исследования тимуса человека
Был проведен корреляционный анализ с использованием непараметрического критерия Спирмена между показателями оптической плотности и суммарной площади различных факторов микроокружения и теми же показателями протеина CD5 как маркера Т-клеток для установления присутствия или отсутствия влияния тех или иных факторов на процессы инволюции тимуса, отражающиеся в количестве присутствующих в нем тимоцитов.
Проведенный анализ позволил установить положительную корреляцию между уровнем содержания серотонина в клетках микроокружения тимуса и экспрессии CD5 на Т-клетках (по показателю суммарной площади), при этом коэффициент корреляции составил 0,107. В связи с тем, что данный коэффициент достаточно мал, мы провели повторный анализ, сравнив группы людей пожилого, старческого возраста и долгожителей. При этом, мы получили достаточно высокий коэффициент корреляции (R) = 0,87 (р 0,05) (рис. 48). Нами установлено максимальное значение суммарной площади клеток, содержащих серотонин, в тимусе людей пожилого возраста, но в ходе дальнейшего онтогенеза количество данных клеток снижается, хотя не исчезает полностью. Подобная картина снижения количества клеток наблюдается при анализе возрастной динамики маркера Т-клеток CD5.
При сравнении динамики экспрессии фактора роста сосудов клетками микроокружения тимуса и мембранного протеина CD5 на поверхности Т-клеток была установлена положительная корреляционная зависимость по показателю оптической плотности VEGF и показателю суммарной площади CD5 на начальных этапах онтогенеза (в группе плодов и детей первого года жизни). Уровень корреляции составил 0,73 (р 0,001) (рис. 49).
С помощью корреляционного анализа было обнаружено отрицательное влияние NO-синтазы на развитие Т-клеток в тимусе. При увеличении экспрессии данного фермента тучными клетками при старении (в группах людей пожилого, старческого возраста и долгожителей) количество CD5 на поверхности снижается. Коэффициент корреляции при этом составил -0,89 (р 0,05) (рис. 50).
Сравнение динамики экспрессии мембранных рецепторов CD35 на дендритных клетках и CD5 на тимоцитах показало наличие положительной корреляционной связи по показателям оптической плотности (R = 0,69, р 0,01) на начальных этапах онтогенеза (первая и вторая возрастные группы) (рис. 51).
При сравнении динамики количества тучных и дендритных клеток в процессе онтогенеза по показателю суммарной площади их маркеров (NO-синтазы и CD35, соответственно) оказалось, что в группах людей пожилого, старческого возраста и долгожителей количество указанных клеток изменяется сходным образом, коррелируя при этом с динамикой количества тимоцитов. Коэффициенты корреляции составили 0,71 (р 0,05) для тучных клеток и тимоцитов и 0,83 (р 0,05) и дендритных клеток и тимоцитов (рис. 52, 53).
Также в ходе работы удалось установить отрицательную корреляцию между интенсивностью фактора роста сосудов в тимусе и количеством дендритных клеток в процессе онтогенеза (R = -0,871, р 0,05) (рис. 54), что подтверждает данные литературы о том, что фактор роста сосудов подавляет образование дендритных клеток, необходимых для осуществления клеточного иммунного ответа [Gabrilovich D. et al., 1998; Fricke I. et al., 2007].
