Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 21
1.1. Понятия « свободно-радикальное окисление» и « окислительный стресс» 21
1.1.1. Свободные радикалы: их характеристика. «Окислительный стресс» 21
1.1.2. Механизмы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ) 25
1.1.3. Антиоксидантная защита: характеристика составляющих 30
1.1.4. Методы оценки свободно-радикального окисления и ферментативной антиоксидантной защиты рганизма 34
1.2. Окислительный стресс при сахарном диабете при СД 2 40
1.2.1. Источники образования свободных радикалов пи СД 2 типа, их взаимосвязь 40
1.2.2. Выраженность окилительного стресса у больных СД 2 типа в зависимости от компенсации углеводного обмена и длительности заболевания, выраженности осложнений 44
1.2.3. Антиоксидантная защита у больных СД 2 типа в зависимости от компенсации углеводного обмена и длительности заболевания, выраженности осложнений 47
1.2.4. Значимость лабораторных показателей в оценке окислительного стресса у больных СД типа 2 типа 50
1.3. Роль окислительного стресса в развитии сахарного диабета 2 типа и его поздних осложнений 52
1.3.1. Окислительный стресс - центральное звено патологических процессов, лежащих в основе развития сахарного диабета 2 типа и его осложнений и ассоцированных заболеваний 52
1.3.1.1. Окислительный стресс и не ферментативное гликозилирование 52
1.3.1.2. Окислительный стресс и повышение активности протеинкиназы С 53
1.3.1.3. Окислительный стресс и активация транскрипционного ядерного фактора NF-kB 54
1.3.1.4. Окислительный стресс, дисфункция эндотелия и гемостаз 55
1.3.1.5. Окислительный стресс и концепция « метаболической памяти» у больных СД 2 типа 60
1.3.2. Роль окислительного стресса в развитии-сахарного диабета (роль в развитии инсулинорезистентности и дисфункции бета клеток) 61
1.3.3. Роль ОС в развитии осложнений сахарного диабета 63
1.3.3.1. Окислительный стресс и диабетическая невропатия 66
1.3.3.2. Окислительный стресс и диабетическая ретинопатия 67
1.3.3.3. Окислительный стресс и диабетическая нефропатия 68
1.3.3.4. Окислительный стресс и макроангиопатии 69
1.3.3.5. Окислительный стресс и артериальная гипертензия у больных сахарным диабетом 2 типа 73
1.4. Возможности коррекции окислительного стресса у больных СД 2 типа с помощью антиоксидантов 75
1.4.1. Антиоксидантные эффекты базисной терапии больных СД 2 типа 75
1.4.2. Существующие противоречия и нерешённые проблемы при использовании антиоксидантной терапии: возможные причины неуспеха антиоксидантной терапии 76
1.4.3. Обоснование применения антиоксидантов в терапии больных СД 2 типа 84
1.4.3.1. Ограничение окислительного стресса и активизации антиоксидантных ферментов под влиянием антиоксидантов 84
1.4.3.2. Влияние антиоксидантов на процессы неферментативного гликозилирования 85
1.4.3.3. Влияние антиоксидантов на активность протеинкиназы С 85
1.4.3.4. Влияние антиоксидантов на ядерный фактор транскрипции NK кВ 86
1.4.3.5. Влияние антиоксидантов на гликемические показатели, инсулинорезистентность, липидный спектр крови 86
1.4.3.6. Влияние антиоксидантов на дисфункцию эндотелия , тромбоцитарно - сосудистый и плазменный гемостаз 87
1.5. Обоснование применения антиоксидантов (альфа-липоевая кислота, мексидол, дибикор) в данном исследовании 89
Глава 2. Материалы и методы исследования. 93
2.1. Характеристика обследованных больных 93
2.2. Методы исследования 101
2.3. Методы статистической обработки 121
Глава 3. Выраженность окислительного стресса у больных СД 2 типа в зависимости от компенсации углеводного обмена, длительности заболевания 123
3.1. Перекисное окисление липидов у больных СД 2 типа в зависимости от компенсации углеводного обмена и длительности заболевания 123
3.2. Окислительная модификация белков у больных СД 2 типа в зависимости от компенсации углеводного обмена и длительности заболевания 128
3.3. Содержание метаболитов оксида азота у больных СД 2 типа в зависимости от компенсации углеводного обмена и длительности заболевания 135
Глава 4. Состояние липидтранспортной системы и свободно радикального окисления у пациентов СД 2 типа в зависимости от компенсации углеводного обмена и длительности заболевания 139
4.1. Содержание жирных кислот в сыворотке крови больных СД, интенсивность свободно-радикального окисления и общая антиоксидантная защита 139
4.2. Содержание общего холестерина, триглицеридов, липопротеидов низкой и высокой плотности, интенсивность,молекулярные продукты свободно-радикального окисления,ферментативная антиоксидантная; защита 142
Глава 5. Эндотелиальная дисфункция, состояние тромбоцитарно сосудистого, плазменного звеньев гемостаза и выраженность свободно радикального окисления, активность антиоксидантной защиты в зависимости от компенсации и длительности сахарного диабета 2 типа 149
5.1. Дисфункция эндотелия у больных СД 2 типа и выраженность окислительного стресса в зависимости от компенсации и длительности заболевания 149
5.2. Агрегация тромбоцитов и свободно-радикальное окисление 152
5.3. Плазменный гемостаз и свободно-радикальное, окисление 161
Глава 6. Взаимосвязь морфо-функциональных и структурных показателей, характеризующих поздние осложнения сахарного диабета, с показателями свободно-радикального стресса и антиоксидантной защиты 167
6.1. Дистальная диабетическая полиневропатия, свободно-радикальное окисление, антиоксидантная защита 167
6.2. Вегетативная нейропатия у больных СД 2 типа и окислительный стресс 170
6.3. Диабетическая ретинопатия, свободно-радикальное окисление, антиоксидантная защита 178
6.4. Диабетическая нефропатия, свободно-радикальное окисление, антиоксидантная защита 179
6.5. ИБС, свободно-радикальное окисление, антиоксидантная защита 180
6.6. Цереброваскулярные заболевания, свободно-радиальное окисление, антиоксидантная защита 186
6.7. Артериальная гипертензия, свободно-радикальное окисление, антиоксидантная защита 193
Глава 7. Новые способы диагностики выраженности свободно радикального окисления у больных СД 2 типа 196
7.1. Метод клиновидной дегидратации для оценки выраженности окислительного стресса и оценки эффективности проведённой терапии 196
7.2. Метод инфракракной спектроскопии для оценки выраженности свободно - радикальных реакций и эффективности проведённой терапии 208
7.3. Белки острой фазы (СРБ, гаптоглобин, церулоплазмин) — как маркёры свободно-радикального окисления и активности антиоксидантной защиты у больных СД 2типа 210
7.4. Аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, у- ГТП косвенные маркёры свободно-радикального окисления и антиоксидантной защиты у больных СД 2 типа 217
7.5. Гематокрит как маркёр выраженности окислительного стресса 219
Глава 8. Влияние антиоксидантной терапии на инсулинорезистентность, секреторные возможности инсулярного аппарата поджелудочной железы 223
Глава 9. Влияние антиоксидантной терапии на клинико-лабораторно инструментальные характеристики у больных, страдающих СД 2 типа, в процессе терапии и в течение года наблюдения 226
9.1. Влияние антиоксидантной терапии( альфа - липоевой кислоты, мексидола, комбинации альфа - липоевой кислоты и мексидола, дибикора) на показатели окислительного стресса у больных сахарным диабетом в процессе курса терапии 226
9.2. Влияние дифференцированной антиоксидантной терагада (мексидола, альфа-липоевой-кислоты, их комбинации) на липидный спектр крови в процессе курса терапии и в течение 1 года наблюдения 233
9.3. Влияние антиоксидантной терапии (мексидола, альфа-липоевой кислоты, их комбинации ) на тромбоцитарно-сосудистое и плазменное звено гемостаза в процессе курса терапии 236
9.4. Влияние антиоксидантной терапии (мексидола, альфа-липоевой кислоты и их комбинации) на маркёры воспаления- белки острой фазы (фибриноген, С-реактивный белок, гаптоглобин, церулоплазмин) 241
9.5. Влияние антиоксидантной терапии (мексидола, альфа — липоевой кислоты) на выраженность эндотелиальной дисфункции в процессе терапии 242
9.6. Влияние антиоксидантной терапии ( мексидола, альфа - липоевой кислоты и их комбинации ) на электромиографические показатели в процессе терапии 243
9.7. Влияние антиоксидантной терапии ( мексидола, альфа - липоевой кислоты) на вариабельность сердечного ритма в процессе терапии 246
9.8. Влияние антиоксидантной терапии ( мексидол, альфа - липоевой кислоты, комбинации альфа - липоевой кислоты и менксидола) на t спектральные, скоростные характеристики церебрального кровотока и ТИМ в процессе терапии 247
Глава 10. Катамнез пациентов, получавших антиоксидантную терапию в течение 5 лет в составе комплексного лечения сахарного диабета 250
Глава 11. Заключение 255
Выводы .289
Практические рекомендации 292
Список использованной литературы 293
- Механизмы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ)
- Обоснование применения антиоксидантов (альфа-липоевая кислота, мексидол, дибикор) в данном исследовании
- Вегетативная нейропатия у больных СД 2 типа и окислительный стресс
- Катамнез пациентов, получавших антиоксидантную терапию в течение 5 лет в составе комплексного лечения сахарного диабета
Введение к работе
Актуальность проблемы
Сахарный диабет является (СД) одной из самых насущных проблем современности, учитывая прогрессирование распространённости патологии, тяжесть и полиорганность поражения, раннюю инвалидизацию и большую летальность вследствии прогрессирования макро и микроангиопатий (Дедов И. И., Шестакова М. В., 2010).
В настоящее время общепризнана роль хронической гипергликемии в развитии поздних осложнений СД. Гипергликемия натощак и в постпрандиальном периоде, а также острые колебания содержания глюкозы приводят к избыточному гликозилированию и активации окислительного стресса, что способствует развитию и прогрессированию осложнений сахарного диабета. (Аметов А.С. 2008,L.Monnier 2009, Zaccardi F. et al, 2009) Окислительному стрессу у больных сахарным диабетом 2 типа и его роли в генезе самого диабета и его поздних осложнений посвящены многочисленные исследования (Балаболкин М. И., 2000, 2004; Недосугова Л. В, 2006; Ланкин В. З., Тихазе А. К., Кумскова Е. М.., 2008,2009; Baynes J. W., 1991, 1996; Rsen P. et al, .2001; Evans J. et al, 2002; Ceriello A., 1999,2000,2006,2008,2009;), тем не менее существует ряд нерешённых вопросов. Данные литературы об изменениях активности антиоксидантной системы и выраженности свободно-радикального окисления у больных СД 2 типа весьма противоречивы. До настоящего времени не существует единого мнения о терапевтической тактике ведения больных СД 2 типа с применением антиоксидантов с целью профилактики развития и прогрессирования диабетических осложнений и инсулиновой недостаточности. В то же время показана целесообразность использования антиоксидантов в лечении этих больных (Балаболкин М. И., Клебанова Е. М. 2004; Недосугова Л. В., 2006; Ланкин В. З., Тихазе А. К., Беленков Ю. Н. , 2006). Остаются не разработанными принципы дифференцированной антиоксидантной терапии в зависимости от выраженности осложнений, включая дозы препаратов и продолжительность курсов, не отслежено влияние антиоксидантной терапии на отдалённые результаты лечения больных.
Таким образом, вопрос о роли свободно-радикального окисления в развитии и прогрессировании поздних осложнений сахарного диабета остаётся принципиально важным для выработки тактики ведения пациентов, страдающим сахарным диабетом 2 типа. Решению данной проблемы посвящена настоящая работа.
Цель исследования:
Оценить роль окислительного стресса в развитии и прогрессировании поздних осложнений сахарного диабета 2 типа и уточнить возможности медикаментозной антиоксидантной терапии в коррекции этих осложнений.
Задачи исследования:
-
Комплексно оценить параметры окислительного стресса у больных сахарным диабетом 2 типа в зависимости от компенсации углеводного обмена, длительности заболевания, уточнить их взаимосвязь.
-
Изучить состояние липидного обмена и взаимосвязь его параметров с основными показателями свободно-радикального окисления у больных СД 2 типа.
-
Уточнить взаимосвязь окислительного стресса с тромбоцитарно-сосудистым и плазменным гемостазом, дисфункцией эндотелия у больных СД 2 типа.
-
Проанализировать взаимосвязь параметров окислительного стресса с морфо-функциональными и структурными характеристиками хронических осложнений у больных СД 2 типа (микро-и макроангиопатий, полиневропатии, жировым гепатозом).
5. Оценить возможности дифференцированной антиоксидантной терапии (альфа - липоевая кислота, мексидол, их комбинация, дибикор) в коррекции окислительного стресса у больных СД 2 типа.
6. Исследовать влияние различных антиоксидантов (альфа - липоевая кислота, мексидол и их комбинация) на функциональные возможности инсулярного аппарата, вариабельность гликемии в течение суток, выраженность инсулинорезистентности, дислипидемию, дисфункцию эндотелия и на коагуляционный (тромбоцитарно - сосудистый и плазменный) гемостаз непосредственно в ходе комплексного лечения больных СД 2 типа.
7. Оценить динамику состояния больных СД 2 типа и лабораторно – инструментальных показателей через 1 год и 5 лет с использованием антиоксидантов (альфа – липоевая кислота, мексидол, комбинация этих препаратов)
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Сахарный диабет тип 2 характеризуется резкой интенсификацией процессов свободнорадикального окисления, коррелирующей со степенью компенсации углеводного обмена, длительностью заболевания.
-
Достижение компенсации углеводного обмена у больных СД 2 типа сопровождается снижением активности окислительного стресса, однако только достижения компенсации углеводного обмена недостаточно для нормализации свободно-радикального окисления, тромбоцитарно-сосудистого и плазменного гемостаза, липидного спектра, функции эндотелия, предотвращения прогрессирования поздних осложнений СД 2 типа.
-
Окислительная модификация белков при СД 2 типа является связующим звеном между перекисным окислением липидов и эндотелиальной дисфункцией.
-
Подключение к базисной терапии больных СД 2 типа антиоксидантов приводит к статистически значимому ограничению свободно – радикального окисления и повышению антиоксидантной активности у больных СД 2 типа.
-
Добавление к базисной сахароснижающей терапии антиоксидантов способствует улучшению гликемического контроля, сохранению секреторных возможностей инсулярного аппарата, снижению инсулинорезистентности, уменьшению вариабельности гликемических колебаний в течении суток, уменьшению степени и скорости агрегации тромбоцитов, улучшению показателей, характеризующих плазменный гемостаз, липидный спектр, функцию эндотелия, вегетативную регуляцию сердца, электронейромиографических показателей у больных СД 2 типа, позволяет замедлить прогрессирование полиневропатии.
Научная новизна исследования:
Проведена комплексная оценка выраженности окислительного стресса у больных сахарным диабетом 2 типа в зависимости от длительности заболевания, компенсации углеводного обмена.
Уточнена взаимосвязь составляющих окислительного стресса (молекулярных продуктов перекисного окисления липидов и ферментативной антиоксидантной защиты, спонтанной и индуцированной окислительной модификации белков, неферментативной антиоксидантной защиты).
Определена взаимосвязь отдельных составляющих СРО, ферментативной антиоксидантной защиты с уровнем метаболитов оксида азота в плазме крови, характеризующими эндотелиальную дисфункцию.
.Показана взаимосвязь окислительного стресса, антиоксидантной защиты с тромбоцитарно-сосудистым и плазменным гемостазом, выявлена статистически достоверная корреляционная взаимосвязь компонентов плазменного гемостаза и активности антиоксидантных ферментов.
Оценена взаимосвязь окислительного стресса с морфо-функциональными и структурными характеристиками микро - и макроангиопатий у больных СД 2 типа. Оценены возможности комплексной терапии больных СД 2 типа с подключением дифференцированной антиоксидантной терапии (альфа - липоевая кислота, мексидол, их комбинация, дибикор) в коррекции окислительного стресса.
Проведёна комплексная оценка динамики лабораторно – инструментальных показателей в процессе курса терапии, а также отдалённых результатов через 1 год и в через 5 лет лечения пациентов СД 2 типа с использованием антиоксидантов (альфа – липоевая кислота, мексидол, комбинация этих препаратов)
Практическая значимость работы:
Результаты исследования обосновывают целесообразность назначения антиоксидантных препаратов (альфа - липоевой кислоты, мексидола, комбинация альф-липоевой кислоты и мексидола) в качестве патогенетической терапии как самого сахарного диабета 2 типа целью сохранения секреторной активности бета-клетки, снижения инсулинорезистентности, уменьшения вариабельности гликемических колебаний, так и для профилактики и лечения хронических осложнений диабета.
С помощью двойного – слепого исследования обоснована эффективная доза мексидола и длительность курса его применения.
Для оценки выраженности свободно-радикального окисления у больных сахарным диабетом, комплексной диагностики декомпенсации сахарного диабета типа 2 предложено использовать метод клиновидной дегидратации (уведомление о поступлении и регистрации заявки от 08.06.2009 № 2009121919/ 15 (030335).
Предложен метод диагностики ИБС у больных СД 2типа с помощью метода клиновидной дигидратации (уведомление о поступлении и регистрации заявки от 04.05.2009 № 2009116989/15 (023353).
Показан новый способ диагностики сахарного диабета (Заявка № 200910618/15 (008305). Решение о выдаче патента на изобретение от 09.06.2010.
Предложены лабораторные критерии, позволяющие в обычной клинической практике оценить интенсивность и направленность свободно-радикального окисления у больных СД 2типа в процессе лечения (отношение гаптоглобина к церулоплазмину, АЛАТ, Г Т, значение гематокрита)
Издано пособие для врачей « Окислительный стресс в развитии диабетической полинейропатии. Роль альфа-липоевой кислоты в коррекции нарушений», Н. Новгород, 2002г
Созданы методические рекомендации для врачей «Терапия метаболических нарушений у больных сахарным диабетом 2 типа пожилого возраста», Н. Новгород, 2004.
Издано учебно- методическое пособие « Диабетическая нейропатия. Вопросы патогенеза и патогенетической терапии. Н. Новгород, 2006г.
Реализации результатов исследования:
Результаты исследования внедрены в практику работы нейроэндокринологического и хозрасчётного отделений Нижегородской областной клинической больницы им. Н. А. Семашко, эндокринологического отделения МЛПУ « Городская больница № 4» г. Нижнего Новгорода, терапевтического отделения МЛПУ « Городская больница № 3» г. Нижнего Новгорода, в учебный процесс кафедры госпитальной терапии им. В. Г. Вогралика Нижегородской государственной медицинской академии, в обучающий процесс терапевтов, эндокринологов, неврологов г. Нижнего Новгорода и области по системе телемедицина, создание программы « Виртуальный кабинет эндокринолога»
Апробация работы: Материалы и основные положения диссертации доложены на международной конференции в Эссене (1999); конференции молодых учёных Поволжья и Северного Кавказа (Н. Новгород, 2000), IV Всероссийском конгрессе эндокринологов (Санкт - Петерберг, 2001г), 3-ем и 4-ом Всероссийских диабетологических конгрессах (Москва 2004 , 2006 соответственно), конференции « Достижения и трудности современной кардиологии», посвящённой памяти профессора В. П. Померанцева и 35-летию кафедры госпитальной терапии № 1 лечебного факультета Московского государственного медико- стоматологического университета» (Москва, 2005), днях диабета в Приволжском федеральном округе (Н. Новгород, 2005, 2008, 2009), конференции « Артериальная гипертензия в практике врача терапевта, кардиолога, эндокринолога» (г. Москва, 2006г., 3-е место в конкурсе); очередном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006, диплом II степени в номинации « Лучшая научно-исследовательская работа года); областной конференции, посвящённой проблемам изучения артериальной гипертензии (Н. Новгород, 2007), Всероссийской конференции с международным участием « Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению» (Москва, 2008, 2009г), Российской конференции « Артериальная гипертония: спорные и нерешённые вопросы»: посвящена 65 – летию Ярославской государственной медицинской академии и 110 – летию со дня рождения А. Л. Мясникова (Ярославль, 2009), совместном заседании проблемной комиссии « Внутренние болезни ….» и сотрудников кафедры госпитальной терапии им. В. Г. Вогралика (г. Нижний Новгород, 2009), Всероссийском конгрессе « Современные технологии в эндокринологии» (Москва, 2009), V Всероссийском диабетологическом конгрессе ( Москва, 2010), областной конференции врачей ( г.Нижний Новгород, 26-27 июня 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 64 печатных работ, в том числе 8 статей в журналах, включённых ВАК Минобрнауки России в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание учёных степеней доктора и кандидата медицинских наук».
Изданы 1 методические рекомендации для врачей , 2 пособия для врачей, оформлено 2 заявки на изобретение, получено 2 патента на изобретение.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 300 страницах машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, девяти глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии. Указатель литературы содержит 270 источников отечественных авторов и 333 - иностранных. Работа иллюстрирована 67 таблицами, 35 рисунками, 4 схемами.
Личный вклад исследователя: Исследователем лично проведено клиническое обследование и лечение пациентов, включённых в исследование, составление базы данных, статистическая обработка полученного материала.
Механизмы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ)
Реакция ПОЛ играет исключительную роль в клеточной патологии. Она протекает в несколько стадий: инициирования, продолжения, разветвления, обрыв цепи [56]:
Инициирование: радикал гидроксила (НО ) в толще липидного слоя вступает в реакцию с полиненасыщенными жирными кислотами (LH) с образованием липидного радикала (L ): НО + LH ПЮ + L . Продолжение: липидный радикал в ступает в реакцию с молекулярным кислородом с образованием радикала липоперекиси (LOO"). : L+02 LOO .
Атака фосфолипидов заканчивается образованием гидроперекиси липида (LOOH) и нового липидного радикала: LOO +LH LOOH + L Чередование двух последних реакций и представляет собой цепную реакцию ПОЛ.
Разветвление цепи происходит в присутствии небольших количеств Fe2+ с образованием алкоксильного липидного радикала (LO): Fe2+ + LOOH Fe3 HO"+LO"
Образующиеся алкоксильные липидные радикалы инициируют новые цепи окисления липидов:
LO + LH LOH + U
L4-02 LOO.
Обрыв цепи наступает при взаимодействии с ионами металлов переменной валентности (Fe2), друг с другом, с антиоксидантами (InH):
LOO+Fe2 + H+ LOOH
LOO + InH In
LOO" + LOO" молекулярные продукты [56].
Наиболее изучены три прямых последствия ПОЛ [56]: Первое -окисление тиоловых (сульфгидрильных групп) мембранных белков, что приводит к неферментативной реакции SH — групп со свободными радикалами липидов. Значимая роль принадлежит ПОЛ в инактивации ион — транспортных ферментов, в активный центр которых входят тиоловые группы, в первую очеред Са2+ - АТФаза, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждению клетки. Кроме того, повреждение тиоловых групп мембранных белков приводит к дефектам в липидном слое, изменению разности потенциалов, повреждению митохондрий. Второй результат — увеличение ионной проницаемоти липидного бислоя для ионов водорода и кальция, в связи с чем митохондрии теряют способность осуществлять синтез АТФ, возникает энергетический голод, что также повреждает клеточные структуры.
Третий результат — уменьшение стабильности липидного слоя. Что приводит к « электрическому пробою» мембраны собственным потенциалом, вследствие чего мембрана утрачивает свои барьерные функции.
АФК, наряду с ПОЛ, вызывают окислительную модификацию белков, приводящую к нарушению их структуры и функции- агрегации и фрагментации [18, 93]. Большая группа работ посвящена изучению механизмов образования долгоживущих гидропероксидов протеинов и их роли при состоянии окислительного стресса (Gebiski J. М.; 1997, Gebiski S. Gebiski J.M, 1999) [93].
Сценарий окисления белков тот же, что и липидов, имеет тот же цепной характер, что и ПОЛ [93]. Первой ступенью ОМБ является участие ОН в отщеплении водорода от а- углеродного атома полипептидной цепи с образованием углеродного радикального центра.
Высокой чувствительностью к окислению обладают ароматические и серосодержащие аминокислотные остатки, метальные и метиленовые группы, гистидиновые и метиониновые остатки протеинов. Образовавшийся карбонильный радикал быстро реагирует с Ог с образованием алкилпероксирадикального промежуточного соединения, которое далее переходит в алкилпероксид, затем в алкоксирадикал и в гидроксилпроизводное протеина. Образовавшиеся алкил-, алкил-пероксил, алкоксирадикальные продукты тем же путём могут вступать в реакции с другими аминокислотными остатками протеинов, образуя новые углеродрадикальные центры. В присутствии кислорода образование радикальных центров приводит к фрагментации протеинов [93]. Анализ полученных экспериментальных данных позволил связать механизм окислительной модификации белков с образованием нескольких типов радикалов аминокислотных остатков и самого полипептидного скелета протеина (Hawkins С. L., Davies М. J., 2001): 1) углеродные радикалы, локализованные в глубине молекулы протеина (carbon - centered); 2) пероксирадикалы; 3) алкоксирадикалы; 4) тиильные радикалы; 5) азотистые радикалы (nitrogen - centered); 6) ароматические радикалы аминокислотных остатков ( ring - derivated) [93].
В настоящее время предложены следующие механизмы ОМБ. Первый механизм - окисление при участии АФК с образованием цистеин -сульфеновой, цистеин - сульфиновой, цистеин — сульфоновой кислот, сульфоксида метионина [169], о- тирозина, о,6- дитирозина, 3-хлортирозина, 3-нитротирозина, дигидроксифенилаланина, дисульфидов. протеинов, метионина сульфоксида, гидропероксидов изолейцина, лейцина, валина, карбинильных производных протеинов - 2-оксогистидин [435]. Первичные продукты окисления протеинов в результате взаимодействия свободных радикалов и протеинов являются прямым указателем выраженности окислительного стресса [435].
Второй механизм - конъюгация липидных пероксидов с аминокислотными остатками гистидина, цистеина, лизина [169]. Продукты окисления протеинов в результате взаимодействия протенов с продуктами окисления липидов, аминокислот называют вторичными [435]. К ним относят карбоксиметил-лизин, карбоксэтил-лизин, пентозидин, КПНГ и др. По мнению Nerlich A. G, Schleicher Е. D. (1999), наиболее значимый маркёр глиоксидации карбоксиметил-лизин является маркёром локального окислительного стресса в тканях [435]. Карбонильные производные белков - стабильные продукты, образующиеся при участии аминокислотных остатков пролина, аргинина, лизина, треонина, с образованием аддуктов Михаэля, а также при участии аминокислотных остатков лизина, цистеина, гистидина с продуктами перекисного окисления липидов при металкатализируемом окислении липидов [169].
Существуют различные взгляды на взаимодействие составляющих СРО.
По мнению Dean R. Т. et al (1991), в состоянии ОС АФК атакуют не липиды, а, в первую очередь, белки плазматических мембран [247].Такого же мнения придерживаются и другие авторы [93, 134].
По мнению Osawa Y. ,Williams М. S. (1996), токсический эффект протеиновых радикальных центров проявляется в протеиново опосредованной инициации ПОЛ, в транслокации радикальных центров от одного аминокислотного остатка к другому через внутримолекулярные и внешнемолекулярные механизмы [93]. Окислительное повреждение протеинов, связанное с образованием радикальных центров,- является, причиной инактивации энзимов. По данным Tsuchiya Y. et al(2007), при ОС 4-HNE (а, Р - ненасыщенный альдегид) вызывает деструкцию протеинов, инактивирует ряд энзимов, включая глицеральдегид — 3 — фосфатдегидрогеназу, глюкозо - 6 - фосфат - дегидрогеназу, глутатион - S-трансферазу, глутатионредуктазу [93].
По мнению авторов (Губский Ю. И. и соавт., 2005),ОМБ имеет прямое отношение к механизмам токсической гибели клетки [247].
По данным Levine R. L. et al. (2002) к ОМБ предложено относить гликирование и гликоксидацию лизиновых и аспарагиновых остатков [449].
Walters D. М. et al. (2008) установили, что активация ряда генов, содержащих антиоксидант — респонсивные элементы, регулируется по механизму карбонилирования. Например, Nrf2 (NF-E2- related factor 2), являющийся основным представителем таких генов, активируетсяв ответ на ОС: транслоцируется в ядро клетки и экспрессирует гены, содержащие антиоксидант-респонсивные элементы, вследствие чего повышается активность АОЗ [593]. Wong Chi Ming et Cheema Amrita предложили новый механизм взаимодействия ОМБ с эндотелином [598].
Обоснование применения антиоксидантов (альфа-липоевая кислота, мексидол, дибикор) в данном исследовании
Альфа — липоевая кислота
В настоящее время накоплен большой опыт применения альфа -липоевой кислоты, изучены её антиоксидантные свойства. Изначально препарат использовался в качестве патогенетического лечения диабетической полиневропатии как периферической, так и автономной, чему посвящены многочисленные исследования: 7 месячное мультицентровое рандомизированное исследование (ALADIN III Study) [579]; 2-х годовое мультицентровое рандомизированное исследование (ALADIN II Study) [578], 4-х месячное рандомизированное контролируемое исследование с использованием альфа-липоевой кислоты в лечении кардиальной автономной нейропатии (DEKAN Study) [368].
Г. Т. Сивоус и соавт. (2002) сообщила об эффективности применения таблетированных форм ЛК у детей и подростков [266].
С. В. Подачина и Е. С. Гуменюк (2007) отмечали значительную эффективность лечения нейропатических поражений нижних конечностей препаратами липоевой кислоты у больных сахарным диабетом [191].
М. И. Балаболкин, В. М. Креминская, Е. М. Клебанова (2005) указывали на возможности коррекции ОС у больных СД препаратами ЛК [26]
Потом появились сообщения об эффективном применении препарата в лечении катаракты, для предотвращения гломерулярного аппарата почек [238]. В клинических исследованиях с использованием ЛК отмечены улучшение микроциркуляции, ограничение ПОЛ, нормализация содержания оксида азота и стресс- белков, улучшение эндотелий — зависимой реакции сосудистой стенки [238]. Доказано влияние на активность протеинкиназы С, содержание NFkB. Однако не оценено влияние АЛК на ОМБ, не отслежены отдалённые результаты при использовании данного препарата в повседневной врачебной практике. Дибикор
Накоплен опыт применения и отечественного метаболического препарата таурина - дибикор. Препарат был разработан сотрудниками Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ, Института биофизики МЗ РФ и Волгоградского государственного медицинского университета МЗ РФ ( патент РФ 2024256,№001698/01 и № 2054936).
Действующим веществом является таурин- сульфоаминокислота, являющаяся конечным продуктом, обмена серосодержащих аминокислот метионина, цистеина, цистеамина. Таурин является естественным метаболитом. Доказана эффективность применения, препарата» в кардиологической практике: при сердечной недостаточности (патент РФ 2001616), при мягкой коррекции.артериальной гипертензии (Е.П. Елизарова, 2008), в том числе и у подростков (Жуков Б. И. 2007). Отмечено положительное влияние дибикора на состояние клеточных мембран (Недосугова Л. В., 2006) [164 - 166], снижение агрегации и повышение деформируемости ([Кахновский И. М., Королёва Е. В. [6].
Было показано, что терапия дибикором в течении 6 месяцев улучшает микроциркуляцию с сосудах конъюнктивы( Кахновский И. М., Королёва Е. В., Захарченко В. Н., Ларионов С. М, .1997) [6]
Было доказано, что таурин является скевенджером (уборщиком) гипохлорной кислоты. Хлор присоединяется к таурину по аминогруппе. образования N- хлортаурина (Weiss S.J., Klein R., Slivka A.,et al., 1982). Хлортаурин ингибирует супероксидные радикалы, а, следовательно, осуществляется эндотелиопротекция. Кроме того, препарат способствует повышению активности супероксиддисмутазы [6]. Однако не уточнено влияние препарата на другие антиоксидантные ферменты, а также его влияние на ОМБ у больных СД 2 типа, что, возможно, расширит сферу его применения.
Мексидол;
В последние 2 десятилетия наблюдается интенсивное развитие химии и биологии производных 3 - оксипиридина, относящихся к простейшим гетероциклическим аналогам ароматических фенолов и представляющих структурный аналог соединений группы витамина В6. Большой активностью в изученном ряду соединений обладает соединение 2-этил — 6 - метил-3-оксипирин сукцинат (мексидол). В случае с мексидолом структуре витамина В6 придали антиоксидантные свойства за счёт экранирования алкильными группами фенольного гидроксила [182]. Все эффекты препарата реализуются, по крайней мере, на двух уровнях нейрональном и сосудистом. Препарат повышает резистентность клеток к кислородозвисимым патологическим состояниям, обладает свойством стабилизировать биологические мембраны, в частности, мембранные структуры клеток крови, а также свойством модулировать мембраносвязанные ферменты (фосфодиэстеразу, аденилатциклазу), ионные каналы, рецепторные комплексы, улучшать синаптическую передачу и взаимосвязь структур мозга [94]. Изначально препарат был использован, только в неврологической практике. Актуальные направления применения, антиоксиданта озвучила профессор Т. А. Воронина, Т. А. (2001) [63]. В.настоящее время накоплен опыт использования препарата мексидол в лечении больных наследственными нервно-мышечными заболеваниями [196], оценена эффективность препарата в терапии ишемического инсульта [167], а также в лечении хронической недостаточности мозгового кровообращения у пациентов со стенозирующе - окклюзирующим поражением магистральных брахиоцефальных сосудов [269]. Кроме того, есть опыт использования мексидола в комплексном лечении больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей [74], синдрома диабетической стопы [129 ].Отмечен хороший результат при использовании препарата у гериатрических больных с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза [153]. Препарат с эффектом был использован в комплексной терапии стабильной и нестабильной стенокардии [57], артериальной гипертонии у молодых людей [45].
Принимая во внимание тот факт, что препарат эффективен и в экстремальных ситуациях (при стрессорных повреждениях печени [77], при остром панкреатите [101, 159], остром холецистите [195] и остром гепатите [250], в интенсивной терапии пациентов с мультиорганной недостаточностью [50] и постреанимационном периоде [9], для премедикации в стоматологической практике [73], целесообразно, было уточнить механизмы действия препарата.
Учитывая- имеющиеся данные о нормализации эндотелиальной дисфункции под влиянием мексидола [21], о снижении ПОЛ сыворотки крови при его использовании [244], о положительном влиянии на гемостаз [108,127], о возможности ингибирования NO и NO2" и перевода их в менее активные соединения [69], о коррекциии препаратом ОС у больных ГБ, осложнённой гипертоническим кризом по церебральному варианту [68], положительный клинический опыт при лечении пациентов с атеросклеротическим поражением сосудов различных локализаций [57,74, 129,153,167,269], целесообразно было оценить возможности препарата в комплексном лечении больных СД 2типа, осложнённым микро - и макроангиопатиями. Ранее В. И. Мазуров и М. Е. Болотова (2008) сообщили о хорошем эффекте при лечении больных с метаболическим синдромом [144], а И. А. Волчегорский, М. Г. Москвичёва, Е. Н. Чащина (2007) представили информацию об эффективности препарата в терапии полиневропатии у больных сахарным диабетом И. А. [61].
При комбинированной терапии ( альфа-липоевая кислота и мексидол) возможно достичь усиления антиоксидантного эффекта.
Вегетативная нейропатия у больных СД 2 типа и окислительный стресс
Вегетативная нейропатия, являющаяся СД, характеризуется ранней и диссеминированнои нейрональной дегенерацией малых нервных волокон как симпатического, так и парасимпатического трактов [409]. В 1984 г было предложено подсчитывать в течение каждого часа наблюдения за ЧСС количество пар последовательных интервалов RR, различие между которыми превышает 50 мс, т.е. величину NN50 [378]. Использование параметра NN50 оказалось эффективным при исследовании больных СД: его снижение оказалось ранним диагностическим признаком диабетической нейропатии. Ранним и чувствительным признаком ДН является падение LF в дневное время и HF - в ночное (Spallone V, Bernardi L, Ricordi L et al). Ее надежным индикатором является характер дневной ВСР (Murakawa Y, Ajiki К, Usui М et al). ВРС несет в себе не только прогностически негативную информацию, но и предваряет клинические проявления вегетативной нейропатии [378]. Сообщалось также о выявлении пониженной абсолютной мощности НЧ и ВЧ компонентов в контролируемых условиях у диабетических пациентов без признаков вегетативной нейропатии [547]. Однако при рассмотрении отношения НЧ/ВЧ компонентов или выражения этих параметров в нормализованных единицах достоверных различий в сравнении с контрольной группой выявить не удалось. Таким образом, вероятно, что начальные проявления этой нейропатии затрагивают оба эфферентных звена вегетативной нервной системы [547].
Было показано, что снижение ВРС, выявленное у больных при 24-часовом холтеровском мониторировании, обладает большей прогностической значимостью по сравнению с 5-минутными исследованиями [146]. Нами изучена вариабельность сердечного ритма как в режиме 24-часового мониторирования, разделяя отдельно дневные и ночные часы, так и в режиме оценки 5-минутных интервалов.
По нашим данным, низкий уровень всех показателей временного анализа пациентов был отмечен уже на фоне компенсации углеводного обмена (р 0,05), что свидетельствует о наличии автономной нейропатии у исследуемых пациентов. Декомпенсация статистически значимо ухудшала средний уровень показателей, свидетельствуя о тесной взаимосвязи между метаболическими и вегетативными нарушениями. Длительность сахарного диабета значимо коррелировала с SDNN ( г= - 0,603, р=0,029) и с SDANN ( i= -0,602, р=0,026).
С увеличением длительности- заболевания статистически значимо снижался и показатель pNN50 (р=0,034), подтверждая мысль отом, что данный показатель является не только ранним диагностическим критерием автономной нейропатии, но и критерием, объективно оценивающим выраженность автономной нейропатии и определяющим его зависимость от компенсации сахарного углеводного» обмена и длительности заболевания. Кроме того, нами было замечено достоверное снижение с течением длительности заболевания критерия SDNN. Приведены нормы временного анализа вариабельности сердечного ритма по Л. М.Макарову [ 146] (таб 27, Рис. 16).
При проведении спектрального анализа вариабельности сердечного ритма были найдены следующие закономерности. Общая мощность спектра (Tot Р) была увеличена как на фоне компенсации, так и декомпенсации сахарного диабета, при этом значимо не отличаясь при длительности диабета до 5 лет, что свидетельствовало о напряжённости адаптационных реакций уже при компенсированном углеводном обмене при небольшой длительности заболевания. Статистически значимое снижение волн как низкой частоты, так и высокой частоты , а также отсутствие достоверных различий коэффициента Lf/Hf свидетельствовало о вовлечении в процесс как парасимпатических, так и симпатических волоков. Кроме того, при небольшой длительности заболевания как на фоне компенсации, так и декомпенсации углеводного обмена, по сравнению с контролем, отмечается преобладание парасимпатической активности (уменьшение Lf/Hf), и этот коэффициент снижается с увеличением длительности заболевания( табл. 28). Нормы спектрального анализа приведены по данным Европейского общества кардиологов и Североамериканского общества электрофизиологов [403].
Для уточнения взаимосвязи выявленных нарушений с выраженностью окислительного стресса нами проведена корреляция между основными характеристиками, характеризующими вегетативную регуляцию сердца и молекулярными продуктами перекисного окисления липидов и антиоксидантной активностью (ферментативной и общей).
Тотальная мощность спектра статистически достоверно положительно коррелировала с общей антиоксидантной активностью как в абсолютных значениях (г=0,674, р=0,04), так и в нормализованных единицах (г=0,578; р=0,04), подтверждая постулат о том, что нервное волокно очень зависит в силу своих особенностей от дефицита антиоксидантной защиты. Нормализованные единицы используют для того, чтобы подчеркнуть реципроктные отношения парасимпатического и симпатического отделов автономной нервной системы и для того, чтобы свести до минимума эффекты изменений общей мощности на величины её компонентов LF и HF [213].
Отмечена статистивеска значимая взаимосвязь тотальной мощности спектра с активностью КАТ (г=0,85, р=0,02), ГП ( г = 0,824, р = 0,03). При оценке взаимосвязи составляющих спектра ВРС с активносностью ОАА отмечена статистическая значимость во всех случаях. При этом достоверная взаимосвязь с антиоксидантными ферментами (КАТ, ГТ) была найдена для всех частот, а с СОД коррелировали лишь.ТЖ и Hf ( г= 0,658, р=0; 03 и г= 0,632, р= 0,02 соответственно). Вероятно, этим можно объяснить и ограничение интенсивности свободно-радикального окисления в данном случае. Найденная взаимосвязь между Ulf, Hf и СОД, а также связь всех составляющих мощности спектра ВРС с антиоксидантными фементами второй линии защиты свидетельствует о необходимости коррекции антиоксидантного статуса у больных СД 2 типа. Отмечены статистически значимые обратные корреляционные зависимости молекулярными продуктами ПОЛ и показателями спектрального анализа вариабельности сердечного ритма в любом диапозоне .
Симпатовагальный индекс статистически значимо коррелировал с уровнем гликозилированного гемоглобина (г=- 0,66;р=0,024), отрицательно - с I max (г=- 0,88;р=0,02), положительно с активностью СОД (г=0,475;р=0,02). Учитывая, что СОД - первый антиоксидантный фермент, принимающий участие в удалении свободных радикалов, следует предположить, что данный индекс отражает напряжённость адаптационных систем и его снижение следует расценивать как истощение антиоксидантов и прогрессирование окислительного стресса ( табл.30 )
Катамнез пациентов, получавших антиоксидантную терапию в течение 5 лет в составе комплексного лечения сахарного диабета
По нашим данным, количество первичных конечных точек в течение 5-летнего наблюдения к пациентов, принимающих различную терапию, было различным .Так, в группе сравнения, в течение 5лет смерть наступила у 2 пациентов, слепота имела место у 1 пациента, ХПН, потребовавшая проведения гемодиализа, у 2- пациентов, ампутация нижней конечности проведена у 1 больного. В группе пациентов, получавших альфа-липоевую кислоту(п= 22 ), в-течение 5-летнего периода наблюдения, смерть наступила у 1 пациента, слепота- у 1 пациента, ХИН,, потребовавшая гемодиализа, не наступила. Ампутация проведена у одного больного. В группе пациентов, получавших мексидол (п=14); в течение 5 летнего периода летальных исходов диагностировано не было, слепота -О, ХПН-0. Ампутаций не было. В группе, получающих комбинированную терапию ( мексидол плюс альфа-липоевая кислота) (п=13), летальных исходов, слепоты, ХПН, диагностировано не было, ампутации не проводились. Изначально группы были сопоставимы по возрасту, длительности заболевания, наличию сосутствующих заболеваний и осложнений сахарного диабеиа. Следовательно, при использовании антиоксидантной терапии дополнительно к базисной терапии у (п=49), летальный исход был зарегистрирован у 1 человека, слепота - у 1 пациента, ХПН, потребовавшая гемодиализа, не наступала, ампутация проведена у 1 пациента.
Острые сосудистые катастрофы ( ОИМ, ОНМК) были зарегистрированы в контрольной группе у 4 человек, при использовании альфа- липоевий кислоты - у двух человек, мексидола - у двух человек, при комбинации альфа-липоевой кислоты и мексидола - также у двух человек. Для уточнения различия в эффективности приёма антиоксидантов на « первичные конечные точки» нами была построена таблица сопряжённости с вычислением %2 с поправкой Иетса.( таблица 67)
По нашим данным, общая смертность в группах, где были применены антиоксиданты, достоверно не отличалась от смертности в группе сравнения (у2= 2,57,р=0,106), однако достоверно меньше шансов развия ХПН (%2= 5,55,р=0,0187). Частота наступления слепоты и ампутации нижних конечностей также достоверно не была различна в данных группах (%2= 0,65,р=0,42 и yl= 0,66, р=0,416 соответственно).
Снижение частоты развития сосудистых катастроф (ОИМ, ОНМК) в-группе, использующих антиоксиданты, недостоверно (х2= 0,58, р=0,45 и уЪ= 1,26, р=0,26 соответственно), однако имеется отчётливая тенденция к снижению данных эксцессов.
При анализе прогрессирования микро - и макроангиопатий при использовании только стандартной базистой терапии нами отмечена тенденция к увеличению микроангиопатий (ретинопатии, нефропатии, полиневропатии). При подключении антиоксидантов, прогрессирование осложнений замедленно было достоверно замедлено. ( Рис.34)
При использовании антиоксидантов, по сравнению с группой сравнения, было отмечено снижении наличия таких осложнений, как ретинопатии (на 16 %) , нейропатии - (на 22 %,) , нефропатии - (на 15 %).
При оценке дифференцированной эффективности препаратов на возникновение диабетической ретинопатии отмечается замедление развития ретинопатии при использовании мексидола и комплекса мексидол и липоевая кислота на 18 и 22 % соответственно, при использовании липоевой кислоты - отмечено снижение развития ретинопатии на 12%.
Оценивая эффективность дифференцированной антиоксидантной терапии на развитие полиневропатии по сравнению с группой сравнения отмечено максимальный результат при использовании альфа-липоевой кислоты (снижение на 20%), при использовании мексидола - на 17%, при комбинации альфа-липоевой кислоты и мексидола - на 15%.
У пациентов, использующих антиоксидантную терапию, в отличие-от группы сравнения, отмечалось снижение развития диабетической нефропатии: при использовании альфа-липоевой кислоты - на 20,4 %, мексидола- 18,2 %, при комбинированной терапии мексидола и липоевой кислоты - на 9,3%.
При использовании только базисной стандартной терапии достоверно имеет место утяжеление степени нефропатии ( критерий Мак Немана, =13,47,р= 0,0002.) При использовании антиоксидантов достоверно по-савнению с группой контроля имеет место не прогрессирование нефропатии до стадии протеинурии (критерий Мак Немана, =44,18,р 0,001).
При применении антиоксидантной терапии имело местом и уменьшения прогрессирования данных осложнений. Так при использовании1 альфа-липоевой кислоты, по сравнению с группой сравнения, уменьшилось количество тяжёлой ретинопатии (препролиферативная и пролиферативная стадия) на 7,2 %, тяжёлой нефропатии (стадия протеинурии) на 4,5%.
При использовании мексидола, по сравнению с группой сравнения, уменьшилось количество тяжёлой ретинопатии (препролиферативная и пролиферативная стадия) на 6,8 %, тяжёлой нефропатии (стадия протеинурии) на 6 %.
При применении комбинированной терапии мексидола и альфа-липоевой кислоты, по сравнению с группой сравнения, уменьшилось количество тяжёлой ретинопатии (препролиферативная и пролиферативная стадия) на 5,5%, тяжёлой нефропатии (стадия протеинурии) на 12,5%.
Нами проведён анализ дифференцированной терапии антиоксидантами на суррогатные точки, храктеризующие полиневропатию, в частности, СРВ по нижним конечностям, амплитуду М-ответа, латентный период.
При использовании стандартной базисной терапии по истечению 5-летнего срока наблюдения отмечалось снижение амплитуды М- ответа на 41,%, увеличение латентного периода на 21,1%, снижение скорости проведения импульса на 10% ( Рис.35)
При использовании альфа - липоевой кислоты - отмечалось увеличение СРВ за 5 лет возрасла на 11,7 % , латентный период уменьшился на 11,4%, амплитуда М- ответа также уменьшилась на 24,5%. Мексидол оказывад аналогичное влияние на электромиографические показатели у больных сахарным диабетом типа 2: СРВ возрасла на 6,39%, латентный период уменьшился на 5,9%, амплитуда М- ответа снизилась на 22,5%. При комбинации мексидола и альфа-липоевой кислоты нами получено потенцирующее действие данных препаратов на замедление снижения амплитуды М- ответа (на 6,5%), снижение латентного периода на 16,6%, однако такого потенцирующего влияния на СРВ не было (повышение на 7,6%).
Следовательно, при использовании данных антиоксидантных препаратов достигается значительное функциональное улучшение нервного волокна, и данный эффект максимален при комбинированной терапии с использованием альфа-липоевой кислоты и мексидола.
![Роль систематического обучения пациентов в профилактике поздних сосудистых осложнений у больных сахарным диабетом 2-го типа [Электронный ресурс]](/i/i/4315/207912.png "Роль систематического обучения пациентов в профилактике поздних сосудистых осложнений у больных сахарным диабетом 2-го типа [Электронный ресурс] Шувалова Ирина Геннадьевна")
