Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В последние десятилетия значение пневмококка, как этиологического фактора ряда распространенных заболеваний недооценивается российским здравоохранением.
Благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей установлено, что несмотря на большое значение некоторых других бактерий, именно пневмококк является ведущим возбудителем бактериальных инфекционных заболеваний ортанов дыхания. По данным различных исследователей от 40 до 90% острых пневмоний. 40-60% отитов и до 30% менингитов вызывается пневмококом (Вишнякова Л.А., 1984, Катосова Л.К., 1990, Уланова М.А., 1992). Следует отметить, что эти заболевания часто приводят к тяжелым осложнениям и даже гибели больных. Острой проблемой становится развитие пневмококковой инфекции у больных с иммунодефицитными состояниями. Чаще всего именно пневмония приводит к гибели больных после иммуносупрессии, связанной с трансплантацией органов. Антибиотикоустойчивость, прежде всего устойчивость к пенициллину, некоторых штаммов пневмококка создает дополнительную опасность при распространении пневмококковой инфекции (Уланова М.А., 1992). Последние эпидемиологические исследования показали, что в ряде случаев % пенициллинрезистентных штаммов пневмококка достигает 60%.
В связи с этим, актуальной является разработка адекватных ' методов специфической этиологической диагностики при бактериальных респираторных заболеваниях, направленных на своевременное и надежное выявление этиологии инфекции с целью проведения соответствующей терапии.
Вместе с тем, существуют определенные трудности при лабораторной диагностике пневмококковой инфекции. При бактериологическом анализе из-за особенностей идентификации пневмококка не всегда удается выявить его как этиологический -агент. Раннее применение антибиотиков существенно снижает эффективность бактериологического исследования. Поэтому особенно перспективно использовать методы иммунохи-
мической диагностики пневмококковой инфекции, позволяющие определять антитела к пневмококку, как результат развития инфекции. Для разработки препаратов для диагностики пневмококковой инфекции необходима определить, какие из бактериальных антигенов играют ведущую роль в ходе патологического процесса. В многочисленных исследованиях, посвященных этому вопросу, ранее было показано, что капсульные полисахариды пневмококка играют основную роль в стимуляции иммунного ответа и создании иммунитета к пневмококку гомологичного серотипа. В настоящее время выявлено 90 серотипов пневмококка. Несмотря на то, что некоторые из этих серотипов дают перекрестные реакции, процесс выявления пневмококка по этому признаку является сложным и требует нескольких типов, антисывороток. Выявление антител к капсульним полисахаридам затруднено по сходным причинам.
Вместе с тем, у пневмококка имеются белковые компоненты, участвующие в стимуляции выработки антител. Однако, в отличие от полисахаридных, белковые антигены пневмококка изучены недостаточно. Исследование этих антигенов позволило бы решить вопрос о возможности выявления антител к некапсульным формам пневмококка и идентификации пневмококка независимо от серотипа.
Острая пневмония, бронхит, отит являются полиэтиологическими заболеваниями, где наряду с пневмококком большую роль играют некапсульные формы Н.influenzae, B.catarrhalis (Колмогорова О.В., 1996). Однако, до сих пор не описано простого метода одновременного определения антител к этим возбудителям. Вместе с тем, применение принципа ИФА в сочетании с использованием нитроцеллюлозной мембраны в качестве носителя (иммуноблот, дот-блот) позволяет конструктировать простой и надежный препарат для серологической диагностики.
В связи с этим ЦЕЛЬЮ настоящего исследования явилось изучение состава и свойств некапсульных антигенов пневмококка и создание на их основе иммукофермент-ных систем, позволяющих осуществить иммунохимическую диагностику инфекции, вызываемой этим микроорганизмом.
Для выполнения поставленной цели нами были поставлены следующие ЗАДАЧИ:
-
Выделение и сравнительная иммунохимическая характеристика антигенных препаратов из различных штаммов S.pneumoniae.
-
Отработка условий проведения ИФА для определения антител к белковым антигенам пневмококка с использованием полистироловых планшетов.
-
Создание системы ИФА на основе дот-блота.
-
Сравнительный анализ активности реакции сывороток больных и здоровых людей с помощью разработанных систем.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведения исследований впервые дана сравнительная характеристика белковых антигенных препаратов, выделенных из различных штаммов пневмококка. Показано, что наиболее выражен антительный ответ у больных к белкам с молекулярной массой 50, 80 и 94 kD. Впервые показано, что антитела к трем различным возбудителям бактериальной респираторной инфекции -S.pneumoniae, H.influenzae и B.catarrhalis, можно определить одновременно методом дот-блот.
-
Штаммы S.pneumoniae неоднородны по своему белковому антигенному составу. Наиболее выражена реакция у больных с пневмококковой инфекцией на белки с молекулярной массой 50,80 и 94 kD,
-
Для более эффективного приготовления диагностической иммуноферментной системы для определения антител к S.pneumoniae необходимо проводить экстракцию антигенов с использованием ингибиторов протеаз, а в качестве индикатора применять ОФД.
-
ИФА на основе дот-блота может быть использован для скрининга антител к пневмококку вместо традиционного ИФА, как более простой и не менее чувствительный метод.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Разработана простая методика разрушения бактериальных клеток S.pneumoniae, позволяющая получить препараты для скрининга штаммов на наличие антигенов. Оптимизирована иммуноферментная система для определения антител к S.pneumoniae на основе его белковых антигенов. Система применяется в практическом здравоохранении РФ. Разработана новая диагностическая система на основе точечного иммуноферментного анализа (дот-блот) для одновременного определения антител к S.pneumoniae, H.influenzae и B.catarrhalis в сыворотке крови пациентов с респираторной инфекцией.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Отдельные фрагменты диссертационной работы были изложены на конференции " Состояние, проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций" (Оболенск, 1990), XV международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Стокгольм, 1994), конференциях молодых ученых НИИВСим.И.И.Мечникова (Москва 1989, 1990). Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунохимической диагностики НИИ ВС им.И.И.Мечникова РАМН (31.10.1996).
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертаця состоит из введения, обзора литературы (I глава), главы "Материалы и методы" и собственных исследований (4 главы), заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 110 страниц машинописного текста, 10 таблиц и 14 рисунков. Список литературы содержит 150 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ.
