Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль провоспалительных нейропептидов в патогенезе язвенного колита (обзор литературы)
1.1. Энтеральная нервная система в патофизиологии язвенного колита
1.2. Иммунная система и нейропептиды в механизмах язвенного колита
1.2. 1. Вещество Р при язвенном колите 17
1.2.2. Нейротензин при язвенном колите 23
1.2.3. Вазоинтестинальный пептид при язвенном колите 26
1.3. Нейропептиды в биологической терапии воспалительных заболеваний кишечника
ГЛАВА 2. Клиническая характеристика больных
ГЛАВА 3. Методы исследования 56
3.1. Определение вещества Р и вазоинтестинального пептида в сыворотке крови иммуноферментным методом без экстракции 58
3.2. Определение вещества Р и вазоинтестинального пептида в биоптатах толстой кишки иммуноферментным методом без экстракции 61
3.3. Определение нейротензина в сыворотке крови иммуноферментным методом с экстракцией
3.4. Определение нейротензина в биоптатах толстой кишки иммуноферментным методом с экстракцией
3.5. Статистическая обработка результатов 68
ГЛАВА 4. Показатели провоспалительных нейропептидов при язвенном колите (собственные данные)
4.1. Содержание вещества Р, нейротензина, вазоинтестинального пептида в сыворотке крови у больных язвенным колитом 69
4.2. Содержание вещества Р, нейротензина, вазоинтестинального пептида в слизистой оболочке толстой кишки у больных язвенным колитом 75
4.3. Содержание провоспалительных нейропептидов вещества Р, нейротензина, вазоинтестинального пептида в сыворотке крови в динамике лечения больных язвенным колитом
4.4. Содержание провоспалительных нейропептидов вещества Р, 84 нейротензина, вазоинтестинального пептида в слизистой оболочке толстой кишки в динамике лечения больных язвенным колитом
4.5. Влияние фармакологических препаратов на содержание вещества Р, вазоинтестинального пептида и нейротензина в сыворотке крови и слизистой оболочке толстой кишки
4.6. Моделирование клинического течения и эффективности терапии язвенного колита на основании провоспалительных нейропеп-тидов
Обсуждение 109
Выводы 119
Практические рекомендации 121
Список литературы 122
- Нейротензин при язвенном колите
- Определение вещества Р и вазоинтестинального пептида в биоптатах толстой кишки иммуноферментным методом без экстракции
- Содержание вещества Р, нейротензина, вазоинтестинального пептида в сыворотке крови у больных язвенным колитом
- Моделирование клинического течения и эффективности терапии язвенного колита на основании провоспалительных нейропеп-тидов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Язвенный колит (ЯК) – хроническое воспалительное заболевание слизистой оболочки толстой кишки, возникающее в результате взаимодействия между генетическими факторами и факторами внешней среды, характеризующееся периодами обострения и ремиссии. ЯК был и остаётся одной из наиболее серьёзных проблем в современной гастроэнтерологии (Комаров Ф.И., 2008). Несмотря на то, что по уровню заболеваемости ЯК значительно уступает другим гастроэнтерологическим заболеваниям, но по тяжести течения, частоте осложнений и летальности во всем мире он занимает одно из ведущих мест в структуре болезней желудочно-кишечного тракта (Халиф И.Л., 2011). Социальная значимость ЯК определяется преобладанием заболевания среди лиц молодого трудоспособного возраста – пик заболеваемости ЯК приходится на 20-30 лет, а также ухудшением качества жизни из-за хронизации процесса, а, следовательно, частого стационарного лечения (Воробьев Г.И., 2008; Ливзан М.А., 2010; Голышева С.В. и соавт., 2010).
Несмотря на достигнутые успехи в изучении ЯК, многие стороны этой проблемы охарактеризованы совершенно недостаточно. Это касается как клинических аспектов, так и, в первую очередь, иммунологических нарушений при данной патологии (Струтынский А.В., 2009; Князев О.В., 2011). У лиц с генетической предрасположенностью к ЯК в ответ на воздействие бактериальных антигенов и других повреждающих факторов происходит нарушение селективного иммунного ответа, что сопровождается активацией Т-лимфоцитов, нарушением функции макрофагов, образованием иммунных комплексов с последующим развитием воспалительно-деструктивного процесса в слизистой оболочке толстой кишки (Валуйских Е.Ю., 2011; Барановский, А. Ю., 2013; Kara J., 2007).
Иммунная система кишечника в норме располагает специальными механизмами контроля за ходом реакций иммунного ответа. В настоящее время получила признание научная идея о регуляторной роли энтеральной нервной системы кишечника (ЭНС) в иммунном ответе и реализации воспалительной реакции в толстой кишке при ЯК (Рахимова О.Ю., 2010; Gordon, J.N., 2005; Kara J., 2007). ЭНС — это протяженная диффузная сеть сенсорных нейронов, интернейронов и мотонейронов, которые контролируют разнообразные функции ЖКТ. Вовлечение ЭНС в патофизиологию ЯК обусловлено повреждением нервных волокон ободочной кишки в ходе воспалительно-дистрофического процесса и нарушением иннервации слизистой оболочки и аномальной экспрессией нейропептидов (Ткаченко Е.В., 2011; Neunlist М., 2003; Kara J., 2007). Показана посредническая роль нейропептидов в механизмах взаимодействия нейроэндокринной и иммунной систем кишечника в норме и патологии, в частности, вещества Р (SP), вазоинтестинального пептида (VIP) и нейротензина (NT) – межклеточных сигнальных молекул (Niess J.H., 2002; Kara J., 2007). Главным источником нейропептидов являются нейроны, иммунные клетки (лимфоциты, нейтрофилы, макрофаги) и энтероэндокринные клетки. На модели острого язвенного колита показано, что SР, VIP и NT способны регулировать кровоснабжение, моторную и секреторную деятельность кишечника, регенераторную активность слизистой, увеличивать капиллярную проницаемость, вызывать дегрануляцию тучных клеток, оказывать влияние на продукцию иммуноглобулинов, цитокинов, хемотаксис и фагоцитоз иммуноцитов, потенцируя, таким образом, иммуновоспалительную реакцию в толстой кишке (Комаров Ф.И., 2008; Воробьев Г.И., 2008; Рахимова О.Ю., 2010; Дмитриева В.А., 2011; Kara J., 2007). Отмечено снижение содержания VIP в слизистом/подслизистом слое толстой кишки при ЯК, что вызывало нарушения её моторики (Neunlist М., 2003; Venkova K., 2004; Gomariz R.P., 2005). Установлено возрастание секреции медиаторов воспаления тучными клетками слизистой оболочки толстой кишки в ответ на введение SP и NT (O’Connor T.M., 2004; Kara J., 2007), а NT был способен активировать одновременно несколько типов иммунных клеток при экспериментальном колите (Brun P., 2005).
Ключевыми моментами в определении стратегии и тактики лечения язвенного колита являются эффективность проводимой терапии и прогнозирование рецидива. Существующие в настоящее время клинико-лабораторные критерии эффективности фармакотерапии ЯК не всегда приемлемы в различных клинических ситуациях и мало информативны в отношении прогноза заболевания.
В связи с этим, изучение особенностей продукции провоспалительных нейропептидов (SР, VIP и NT) у пациентов с различными клиническими вариантами язвенного колита представляет теоретический и практический интерес.
Несомненно, что изучение содержания нейромедиаторов при ЯК может иметь существенное значение для оценки активности иммунопатологического процесса и прогноза течения заболевания. Это позволит уточнить механизмы хронизации иммуновоспалительного процесса в толстой кишке и открывает перспективу для разработки дополнительных диагностических критериев, прогнозирования эффективности проводимой терапии и создаёт предпосылки для поиска новых перспективных таргетных препаратов.
Цель исследования: определить клинико-диагностическое и прогностическое значение вещества Р, вазоинтестинального пептида и нейротензина у больных с язвенным колитом.
Задачи исследования:
-
Изучить продукцию вещества P, вазоинтестинального пептида и нейротензина в плазме крови и ткани толстой кишки у больных с язвенным колитом в период обострения заболевания.
-
Установить взаимосвязь между содержанием вещества P, вазоинтестинального пептида и нейротензина в плазме крови и ткани толстой кишки больных язвенным колитом, с одной стороны, и полом, возрастом, стадией, клиническими формами заболевания – с другой.
-
Проследить динамику продукции вещества P, вазоинтестинального пептида и нейротензина в плазме крови и ткани толстой кишки в ходе лечения больных с язвенным колитом при разных его результатах.
-
Разработать диагностические и прогностические критерии тяжести язвенного колита и эффективности терапии на основе данных о продукции вещества P, вазоинтестинального пептида и нейротензина.
Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное изучение особенностей содержания провоспалительных нейропептидов (SP, VIP и NT) в сыворотке крови и ткани толстой кишки у больных язвенным колитом. Установлен факт повышения уровней SP, VIP и снижения уровня NT в сыворотке крови, а также повышения содержания SP, NT и снижения уровня VIP в СОТК в период острых клинических проявлений ЯК. Не установлено зависимости уровня изучаемых показателей от половой принадлежности и возраста пациентов с ЯК. Впервые показана зависимость продукции изучаемых нейропептидов от тяжести течения, распространенности деструктивного процесса, наличия системных проявлений и индекса клинической активности ЯК. Показано, что при тяжелом, тотальном ЯК, с системными проявлениями, непрерывным характером течения и максимальной степенью активности уровень SP и VIP в сыворотке крови был наиболее высоким, а NT, наоборот, значительно снижен. В тоже время, содержание некоторых нейропептидов в СОТК отличалось от их уровня в периферической крови. Так, наибольшие уровни SP и NT и наименьшие – VIP в ткани кишки регистрировались при тяжелом течении ЯК, с системными проявлениями, тотальным поражением толстой кишки, непрерывном течении и максимальной степенью активности воспалительного процесса в СОТК. Впервые установлена положительная корреляционная зависимость между индексом клинической активности и уровнем SP и VIP в сыворотке крови, SP и NT в СОТК, и обратная – c NT в периферической крови и VIP в СОТК. Впервые охарактеризована динамика продукции SP, NT и VIP в периферической крови и СОТК больных ЯК в динамике стационарного этапа лечения и в течение 48 недель наблюдения за больными. Проведена оценка влияния основных групп препаратов на содержание SP, NT и VIP в сыворотке крови и СОТК. Установлено, что ингибитор ФНО- Инфликсимаб обладает наибольшей ингибирующей активностью в отношении продукции изучаемых нейропептидов. Впервые показано, что стойкой клинической ремиссии ЯК свойственна нормализация продукции провоспалительных нейропептидов. Впервые, с использованием математического аппарата интеллектуального классификационного анализа – нейросетевого моделирования, определена вероятность эффективности предстоящего лечения больных язвенным колитом.
Практическая значимость. Результаты диссертационного исследования имеют существенное значение для клиники внутренних болезней и практического здравоохранения в целом.
Комплексное изучение содержания провоспалительных нейропептидов, в частности вещества Р, нейротензина, вазоинтестинального пептида в сыворотке крови и ткани толстой кишки даёт возможность расширить имеющиеся научные представления о патогенезе язвенного колита.
Установленные уровни нейропептидов в периферической крови и в слизистой оболочке толстой кишки больных язвенным колитом и выявленные взаимосвязи показателей с фазой болезни, локализацией воспалительного процесса, клинической активностью, характером течения заболевания, системными проявлениями могут использоваться в качестве дополнительных клинико-диагностических критериев рассматриваемой патологии.
Охарактеризована динамика продукции провоспалительных нейропептидов больных язвенным колитом на фоне базисной терапии через 6 и 48 недель наблюдения. Показано, что в случае положительного ответа на проводимую терапию и формирование стойкой клинико-эндоскопической ремиссии содержания изучаемых нейропептидов в периферической крови и в слизистой оболочке толстой кишки нормализуется. В случае отсутствия признаков формирования клинической ремиссии, но при позитивной динамике течения болезни отмечена лишь тенденция к нормализации нейропептидов как в периферической крови, так и в слизистой оболочке толстой кишки, что отражает ограниченные возможности стандартной фармакотерапии в плане коррекции метаболических расстройств у данной группы больных и создает предпосылки для очередной атаки язвенного колита. Использование биологического препарата Инфликсимаба у больных с резистентными формами язвенного колита способствует нормализации уровней вещества Р, вазоинтестинального пептида и нейротензина в крови и слизистой оболочке толстой кишки уже в начальный период формирования клинической ремиссии язвенного колита. Установлено, что сохранению стойкой клинико-эндоскопической ремиссии язвенного колита в течение года свойственны нормальные уровни вещества P, вазоинтестинального пептида и нейротензина как в периферической крови, так и в слизистой оболочке толстой кишки.
На основании полученных результатов исследования разработаны дополнительные прогностические критерии возможного течения язвенного колита, а также предложен алгоритм ведения больных язвенным колитом врачам первичного звена здравоохранения.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- высокое содержание вещества P, вазоинтестинального пептида в периферической крови и вещества P, нейротензина в слизистой оболочке толстой кишки и снижение показателей нейротензина в сыворотке крови и вазоинтестинального пептида в слизистой оболочке толстой кишки в активной стадии язвенного колита;
- зависимость уровня вещества P, вазоинтестинального пептида и нейротензина от пола, возраста пациентов, активности воспалительного процесса, локализации, тяжести, системных проявлений и характера течения язвенного колита;
- наличие особенностей продукции вещества P, вазоинтестинального пептида и нейротензина в сыворотке крови и слизистой оболочке толстой кишки в динамике лечения язвенного колита различными группами базисных препаратов и при разных его результатах;
- возможность использования показателей исследуемых нейропептидов в сыворотке крови и ткани толстой кишки с целью прогнозирования тяжести течения язвенного колита.
Личный вклад автора. Автором лично составлен подробный обзор литературы, охватывающий современные представления о роли провоспалительных нейропептидов в патогенезе язвенного колита. Диссертантом проведено комплексное клиническое обследование, включая особенности продукции провоспалительных нейропептидов в динамике лечения больных язвенным колитом. Автором лично проанализированы полученные результаты на основе статистической обработки, сделаны объективные выводы и практические рекомендации, построена прогностическая модель и предложен алгоритм ведения больных язвенным колитом для врачей первичного звена здравоохранения.
Практическое использование полученных результатов. Результаты исследования внедрены и используются в практике работы гастроэнтерологического отделения государственного бюджетного учреждения здравоохранения Ставропольского края «Ставропольская краевая клиническая больница», гастроэнтерологического отделения государственного бюджетного учреждения здравоохранения Ставропольского края «Городская клиническая больница №2» г. Ставрополя, в учебном процессе кафедры пропедевтики внутренних болезней, кафедр факультетской и госпитальной терапии Ставропольского государственного медицинского университета.
Публикации и апробация работы. Материалы диссертации изложены в 12 научных работах, в том числе 3 из них в журналах рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Медицинский Вестник Северного Кавказа» 2013; «Фундаментальные исследования» 2013, «Современные проблемы науки и образования» 2014); доложены на 9-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (Санкт-Петербург, 2012); на II международной научно-практической конференции «Медицина: актуальные вопросы и тенденции развития» (Краснодар, 2013); на Девятнадцатой Российской Гастроэнтерологической неделе (Москва, 2013); на 10-й Юбилейной Северо-Западной научной сессии научного общества гастроэнтерологов России (Санкт-Петербург, 2013); на 13-м международном конгрессе хирургов и гастроэнтерологов (Баку, 2013); на XX Всемирном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Нью-Йорк, 2014).
Апробация работы проведена на совместном заседании кафедр пропедевтики внутренних болезней, госпитальной терапии, терапии с курсом диетологии Ставропольского государственного медицинского университета.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из обзора литературы, 4 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 85 отечественных и 124 иностранных источника. Работа изложена на 148 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 36 таблицами, 18 рисунками и 5 клиническими примерами.
Диссертационное исследование выполнено на кафедре пропедевтики внутренних болезней Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации в соответствии с планом научных исследований университета. Номер государственной регистрации 01200801277.
Нейротензин при язвенном колите
Нейротензин – пептид из 13 аминокислот, синтезируется в больших количествах на протяжении всего кишечника, а в меньшем количестве – в головном мозге [42, 53, 140, 163]. В тонкой кишке NT продуцируется специализированными клетками (N-клетки), которые локализуются между эпителиальными клетками тощей и подвздошной кишки [42, 53, 159]. NT стимулирует моторную активность ЖКТ, подавляет секрецию соляной кислоты желуд-24
ком, принимает участие в регуляции уровня глюкозы в крови, усиливает гли-когенолиз, стимулирует выброс глюкагона и подавляет высвобождение инсулина. Последние исследования указывают также на то, что нейротензин является мощным нейроиммуномодулятором [42, 127]. Показана способность нейротензина индуцировать высвобождение провоспалительных цитокинов лейкоцитами, тучными клетками и макрофагами и активировать их хемотаксис [42, 157, 159]. NT осуществляет свои функции путём связывания с двумя специфическими G-протеин- рецепторами – NT-1 (NTR1) и NT-2 (NTR2) [140, 156]. Выполненные на сегодняшний день исследования с использованием антагониста NTR1 показали, что именно этот подтип рецепторов опосредует большинство эффектов нейротензина при патологии кишечника. Установлено, что NTR1 присутствует в неизмененных колоноцитах человека и животных, а также в клетках аденокарциномы толстой кишки [42, 53, 140].
In vivo получены доказательства того, что нейротензин участвует в процессах как острого, так и хронического воспаления. Так, при остром колите, индуцированном токсином А (Clostridium difficile), нейротензин активизировал дегрануляцию тучных клеток и усиливал приток нейтрофилов в очаг воспаления, способствуя более выраженному повреждению тканей [107, 114, 157].
При патологии кишечника экспрессия эпителиоцитами и иммуноцита-ми NT и его рецептора – NTR1 зависит от повреждающего агента. Так, например, в тонкой кишке больных целиакией происходит повышение секреции NT [42, 154]. Содержание NTR1 в толстой кишке крыс снижается во время иммобилизационного стресса. Этот ответ связывают с увеличением циркуляции NT [140, 147, 179]. Однако, в другом исследовании, проведенном на крысах с токсин А -индуцированном колите, авторы описали исходно повышенную экспрессию NTR1 и NT в подвздошной кишке (до того, как произошли воспалительные изменения и секреторные расстройства в толстой кишке) [114, 159]. Brun L.S. и соавторы [140] показали наличие небольшого количества NTR1-позитивных клеток в нормальной слизистой оболочке обо дочной кишки и увеличение экспрессии этих рецепторов на уровне протеинов и мРНК в биоптатах СОТК больных ЯК. NTR1-позитивные клетки прежде всего обнаруживались в эпителиальных криптах и клетках собственной пластинки слизистой толстой кишки больных ЯК [107, 157].
В ограниченном числе исследований показано, что NT вовлекается в воспалительные реакции в кишечнике. Впервые об этом сообщили Castagliuolo D.A. и соавторы [140], которые показали, что инъекция антагониста NTR1 – SR48692 подавляет секрецию жидкости в толстой кишке, снижает проницаемость для маннитола, миграцию нейтрофилов и активацию тучных клеток в ответ на токсин А. Авторы установили функциональную взаимосвязь между NT и SP в механизмах повреждения кишки при экспериментальном колите.
Показано, что провоспалительные эффекты NT могут включать прямое взаимодействие с кишечными клетками нескольких типов, в том числе, с эпителием толстой кишки. Взаимодействие NT-NTR1 в эпителиальных клетках толстой кишки приводит к стимуляции транскрипции мощного хемоат-трактанта IL-8, что ведет к активации транскрипции NF-кB-фактора через мобилизацию резервов кальция [160, 164]. Интересно, что активация системы NF-кB также связана с экспрессией гена NT в толстой кишке. Полагают, что фактор транскрипции NF-кB тесно связан с NT-NTR1-сигналами при воспалительной реакции в кишечнике [140, 160].
Считают, что способность NТ активировать несколько типов иммунных клеток может оказаться центральным звеном в механизмах воспаления при патологии кишечника. Показано участие NT и его рецептора NTR1 в де-грануляции тучных клеток в тощей и ободочной кишке человека [42, 159, 160, 161]. NT способен влиять на передвижение, фагоцитоз и адгезию ней-трофилов [142], а также увеличивать хемотаксис лимфоцитов [140] и, взаимодействуя с макрофагами, стимулировать их фагоцитарную активность [98, 159] и синтез IL-1 [140]. Установлено, что NT через свой рецептор NTR1 способен связываться с умбиликальными васкулярными эндотелиальными клетками человека [159] и стимулировать синтез ими простациклина [140, 159], а также увеличивать их миграцию, что свидетельствует о важной роли NT в ангиогенезе [42, 161]. В предварительных сообщениях показано, что микроваскулярные эндотелиальные клетки слизистой оболочки толстой кишки больных ЯК также способны экспрессировать NTR1. Авторы полагают, что при ЯК NT может оказывать влияние на развитие эндотелиальной дисфункции, потенцируя процессы воспаления в кишке [161].
Недавно полученные результаты показывают, что NT может влиять на процессы регенерации при колите. В опытах на мышах показано, что ежедневное применение антагониста рецептора NTR1 усиливало воспалительную реакцию в кишке в ответ на повреждающее воздействие DSS (декстран сульфата натрия), тогда как инъекции NT оказывали заживляющий эффект при экспериментальном колите [114, 136]. Полагают, что антагонисты NTR1 предотвращали заживление слизистой оболочки толстой кишки в репаратив-ную фазу, вероятно, посредством блокады механизмов, ответственных за миграцию эпителиальных клеток и синтез цитопротективных простагландинов [130, 159]. В то же время, применение NT стимулировало миграцию кишечного эпителия в очаг деструкции, усиливало экспрессию гена СОХ-2 и высвобождение простагландина Е2 [130]. Интересно, что блокада синтеза цито-протективных простагландинов также опосредует секрецию хлоридов в на-тивном препарате толстой кишке человека в ответ на воздействие NT [140]. Кроме того показано, что NT способен индуцировать высвобождение адено-зина из нативной слизистой оболочки толстой кишки человека [160], а активация аденозиновых рецепторов способствует уменьшению кишечного воспаления [161]. Способность in vitro [159] и in vivo [177] стимулировать высвобождения муцина из бокаловидных клеток кишечника – один из важных эффектов NT в создании защитного барьера эпителия слизистой при колите.
Определение вещества Р и вазоинтестинального пептида в биоптатах толстой кишки иммуноферментным методом без экстракции
Определение SР и VIP в сыворотке крови проводилось в динамике лечения у 104 пациентов с ЯК. Контрольную группу составили 20 здоровых добровольцев.
Нейропептиды SР и VIP в сыворотке крови определяли методом ИФА с помощью стандартных тест-систем (Peptide Ensyme Immunoassay, Peninsula Laboratories, LLC, USA) согласно прилагаемой инструкции.
Кровь у больных для исследований получали из кубитальной вены в утренние часы, натощак. Собирали образцы крови (5 мл) в охлажденный шприц и переносили в полипропиленовую пробирку, содержащую ЭДТА (1 мг/мл крови) в качестве антикоагулянта и апротинин (500 КМЕ/мл крови) в качестве ингибитора протеаз, при 4C. Кровь центрифугировали при 1.600 g в течение 15 минут при 4C. Собирали верхний слой (плазму) в полипропиленовую пробирку и замораживали образцы при -50C для хранения.
Метод основан на принципе конкурентного иммуноферментного анализа. Антитела к специфическому пептиду, биотинилированный специфический пептид и образец пациента либо стандарт вносятся в ячейку планшета и смешиваются. Антитела к специфическому пептиду связываются со специально обработанными стенками ячеек. Биотинилированный специфический пептид конкурирует за участки связывания антител с немеченым специфическим пептидом образца или стандарта. После инкубации не связавшийся биотинилированный специфический пептид удаляется промыванием планшета, после чего в ячейки туда вносится пероксидаза хрена, конъюгирован-ная со стрептавидином, образуя при этом комплекс с иммобилизованными в ячейках антителами и биотинилированным специфическим пептидом. После промывки, в ходе которой удаляется избыток конъюгата пероксидазы хрена со стрептавидином, в ячейки вносится хромогенный субстрат - тетраметил-бензидин (ТМБ), который реагирует с пероксидазой в составе комплекса с развитием окраски. Интенсивность развивающейся окраски пропорциональна количеству биотинилированного специфического пептида, связавшегося с иммобилизованными в планшете антителами. В свою очередь количество биотинилированного специфического пептида, связавшегося с иммобилизованными антителами, обратно пропорционально количеству немеченого специфического пептида в образце. Используемые материалы:
Концентрат рабочего буфера (разводили концентрат рабочего буфера до 1000 мл деионизированной водой и тщательно перемешивали);
Один микропланшет на 96 ячеек;
Две пленки для запечатывания планшета;
Один флакон антител к специфического пептиду (лиофилизированы, добавляли 1 мл разбавителя стандарта во флакон с лиофилизированным стандартом и тщательно перемешивали на вортексе. Концентрация аналита в данном исходном растворе - 1000 нг/мл);
Одни флакон стандарта специфического пептида (лиофилизирован, добавляли 5 мл рабочего буфера во флакон с лиофилизированными антителами к специфическому пептиду и тщательно перемешиваали на вортексе);
Один флакон биотинилированного специфического пептида (лиофи-лизирован, добавляли 5 мл рабочего буфера во флакон с лиофилизированным биотинилированным специфическим пептидом и перемешивали на вортексе);
Один флакон разбавителя стандарта;
Концентрат конъюгата пероксидазы хрена со стрептавидином (15 мкл);
Раствор хромогенного субстрата (11мл ТМБ и перекиси водорода);
Стоп-раствор - 2N HCl (15 мл). Приготавливали 6 пробирок 12х75 мм. Помечали пробирки согласно таблице. В каждую пробирку добавляли разбавитель стандарта согласно таблице. В пробирку S1 вносили 25 мкл исходного раствора специфического пептида стандарта (1000 нг/мл). Тщательно перемешивали на вортексе. Переносили 200 мкл полученного раствора из пробирки S1 в пробирку S2 как показано в таблице, тщательно перемешивали на вортексе. Выполняли последующие серийные разведения согласно таблице.
Удаляли пленку, закрывающую планшет. Оставляли незанятыми 2 лунки - они использовались как «бланк» (в эти лунки вносили только по 100 мкл хромогенного субстрата и стоп-раствора на соответствующих стадиях реакции). Вносили в каждую ячейку по 25 мкл раствора антител. Инкубировали 1 час при комнатной температуре. Не промывая планшет, вносили по 50 мкл каждого приготовленного стандарта в соответствующие ячейки. Затем вносили по 50 мкл исследуемых образцов в соответствующие ячейки. Инкубировали 2 часа при комнатной температуре. Через 2 часа вносили в каждую ячейку по 25 мкл раствора биотинилированного аналита. Осторожно встряхивали планшет и закрывали его пленкой. Инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Выполнялась ферментная детекция: центрифугировали флакон с конъюгатом стрептавидина и пероксидазы хрена в течение 2 минут, после чего осторожно перемешивали на вортексе. Вносили 12 мл рабочего буфера в 15 мл пробирку. Добавляли 6 мкл конъюгата стрептавидина и пероксидазы хрена в 12 мл рабочего буфера и тщательно перемешивали на вортексе. Удаляли пленку, закрывающую планшет. Удаляли содержимое ячеек перед первой промывкой, резко стряхнув планшет. Промывали планшет 5 раз 300 мкл рабочего буфера, каждый раз высушивая планшет фильтровальной бумагой. Вносили в каждую ячейку по 100 мкл рабочего раствора конъюгата стрептавидина и пероксидазы хрена. Накрывали планшет пленкой, инкубироваали планшет 60 минут при комнатной температуре. Промывали планшет 5 раз рабочим буфером. Вносили по 100 мкл раствора хромогенного субстрата ТМБ в каждую ячейку, включая «бланк». Накрывали планшет пленкой.
Инкубировали планшет, пока раствор не разовьёт голубую окраску (в течение 1 часа. Вносили по 100 мкл стоп-раствора (р-р 2N HCl) в каждую ячейку, включая «бланк», для остановки ферментативной реакции (раствор в ячейках становился желтым). Протирали дно планшета 70% раствором этанола. Удаляли пленку, закрывающую планшет, и поместили планшет в микропланшетный ридер. Считали оптическую плотность при длине волны 450 нм. Измеряли интенсивность цветной реакции на автоматическом фотометре для микропланшетов.
Результаты ИФА регистрировали с помощью фотометра вертикального сканирования («Мультискан FC», Венгрия). Строили калибровочную кривую на миллиметровой бумаге. Отметили точки полученных средних значений поглощения стандартов на вертикальную ось Y (логарифмическая), а соответствующие концентрации аналита на горизонтальную ось X (линейная). Проводили оптимальную кривую по полученным точкам. Калибровочная кривая имела сигмоидальную форму и отражала обратную зависимость оптической плотности от концентрации аналита. Искомые концентрации находили по калибровочной кривой, результаты выражали в нг/мл.
Содержание вещества Р, нейротензина, вазоинтестинального пептида в сыворотке крови у больных язвенным колитом
NT в СОТК определяли у 45 больных ЯК и 10 здоровых людей методом ИФА с помощью стандартных тест-систем (Peptide Ensyme Immunoassay, Peninsula Laboratories, LLC, USA) согласно прилагаемой инструкции.
В период проведения колоноскопии получали биоптаты из толстой кишки. Кусочки биоптатов, полученные во время эндоскопии взвешивали (5– 10 мг), гомогенизировали в ледяном растворе 0,9% NaCl, помещали в полипропиленовую пробирку, содержащую ЭДТА (этилендиаминтетрауксусную кислоту) в качестве антикоагулянта и апротинин в качестве ингибитора протеаз, при 4C гомогенизировали в ледяном соляном растворе фосфатного буфера (pH 7,4), содержащем протеазные ингибиторы (1 мкмоль фенилме-тилсульфонилфторида (PMSF), 10 мкг/мл апротинина (aprotinin), 10 мкг/мл лейпептина (leupeptin). Гомогенаты центрифугировали при 20.000хg в течение 10 минут при температуре 4C, после чего надосадочную жидкость (су-пернатанты) собирали в полипропиленовую пробирку и хранили при –50C, затем в них определяли содержание нейротензина методом иммунофермент-ного анализа c экстракцией, как описано выше. Содержание нейротензина выражали в нанограммах на 1 грамм сырой ткани (нг/г). Содержание нейротензина в ткани толстой кишки в контрольной группе составило 0,03±0,01 нг/г.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием персонального компьютера на базе процессора "Pentium III", с помощью пакета программ «Excel», «Biostat», «Statistica 6» используя непараметрический критерий Манна-Уитни и парный t критерий Стьюдента для выборок с односторонним распределением и неравными дисперсиями, коэффициент ранговой корреляции Спирмена, программа Statistica Advanced Neural Networks for Windows v.10. с использованием многофакторного и дискрими-нантного анализа для «нейросетевого» моделирования клинического течения и прогнозирования эффективности терапии ЯК.
Моделирование клинического течения и эффективности терапии язвенного колита на основании провоспалительных нейропеп-тидов
Полученные нами результаты свидетельствуют о достоверном изменении уровня провоспалительных нейропептидов (SP, NT, VIP) в сыворотке крови и СОТК больных ЯК в зависимости от выраженности воспалительно-деструктивного процесса в толстой кишке. В этой связи нам представлялось целесообразным подойти к проблеме прогноза тяжести клинического течения ЯК на основании указанных параметров с использованием математического аппарата интеллектуального классификационного анализа, в частности, ней-росетевого моделирования [18, 39, 45, 60, 61, 72, 85].
Искусственная нейронная сеть (ИНС) — это новая структура системы обработки информации, которая создана на основе способности биологических нейронных систем, воспроизводить и обрабатывать информацию. Эта система состоит из большого числа тесно связанных между собой элементов (нейронов), работающих совместно, и используется для решения определенных задач. В приложении к прогнозированию нейронные сети дают возможность значительно повысить специфичность метода, не снижая его чувствительность. Отличительное свойство нейросетей состоит в том, что они не программируются, а обучаются на примерах.
Для ИНС характерен принцип параллельной обработки сигналов, который достигается путем объединения большого числа нейронов в так называемые слои и соединения их определенным образом. Прочность синаптиче-ских связей модифицируется в процессе извлечения знаний из обучающего набора данных (режим обучения), а затем используется при получении результата на новых данных. ИНС оказываются способными принимать решения, основываясь на выявляемых ими скрытых закономерностях в многомерных данных, что способствует определению наиболее важных характеристик заболевания [66, 67, 73, 74, 84].
Для конструирования нейронной сети использовали два типа сетей — многослойный персептрон (MLP) и радиальной базисной функции (RBF), в качестве обучения был использован алгоритм обратного распространения ошибки. Все процедуры проводились с использованием компьютерной программы Statistica Advanced Neural Networks for Windows v.10. Для определения значимости медиаторов воспаления была построена сеть, в которой анализировали 13 входных параметров: определение провоспалительных нейро-пептидов, СРБ, индекса клинической активности (DAI), характера течения ЯК и распространенности поражения толстого кишечника. Один выходной показатель был связан с промежуточным, скрытым слоем, состоявшим из 7 нейронов. Показатель на выходе ИНС устанавливался в виде номинальных значений: «тяжелое течение», «среднетяжелое течение», «легкое течение».
Модифицированная нейронная сеть, включающая параметры, характерные для больных ЯК, представлена на рис. 4.11.
Несомненный интерес представляло определение реального «вклада» различных входных параметров в прогностическую оценку тяжести ЯК, определяемого нейронной сетью. С этой целью нами использовалась функция программы Sensitivity analysis, которая позволяет ранжировать «вес» каждого из входных параметров, при этом, чем выше итоговое значение, тем более важна исследуемая переменная.
Результаты анализа приведены в таблице 4.19.
Из нейропептидов СОТК прогностически значимым является только уровень NT. Учитывая техническую сложность определения провоспали-тельных нейропептидов в ткани кишечника, значениями этих показателей можно пренебречь и для дальнейшего анализа мы решили использовать только их уровень в сыворотке крови.
Последовательность поиска наилучшей модели демонстрирует таблица 4.20, где указаны тип сети, комбинация переменных на входе с числом элементов в промежуточном слое и ошибки, соответствующие каждой модели.
Известно, что результаты всех математических моделей содержат ошибки распознания, причем, точность результатов может быть, как удовлетворительной, так и неудовлетворительной. Чтобы иметь четкое представление о приемлемости полученных результатов и количественного анализа самих ошибок классификации, используется определение чувствительности (SS) и специфичности (Sр) избранного метода. В нашем случае это набор классифицирующих правил примененного нейросетевого классификатора. Следует оговорить классификационную точность распознавательной (диагностической) модели, которая определяется следующим образом: точность = (ТР / Т) х 100%,
где T – общее количество элементов тестовой выборки, TP-истинно положительные или правильно распознанные элементы тестовой выборки.
Измерение точности модели используется в области машинного обучения и распознавания образов. где TP – истинно положительные, количество верных классификаций положительных тестовых элементов; TN – истинно отрицательные, количество верных классификаций отрицательных тестовых элементов; FP – ложно положительные, количество неверных классификаций отрицательных тестовых элементов, FN – ложно отрицательные, количество неверных классификаций положительных тестовых элементов. Чувствительность измеряет количество распознанных положительных элементов тестовой выборки. Специфичность измеряет количество исключенных отрицательных элементов тестовой выборки. Точность предоставляет общую оценку набора правил. Только результаты с высокими значениями по всем трем критериям обладают высоким уровнем доверия. В общем виде результаты определения записываются в виде четырехпольной таблицы (табл. 4.21).
В случае, когда число рассматриваемых классов распознавания более двух, в каждом из них имеются как правильно, так и ошибочно распознанные случаи. В нашем исследовании таких классов три.
Чувствительность и специфичность рассматриваемой модели распознавания степени тяжести ЯК рассчитывается по приведенным выше формулам. В таблице 4.22 приведены результаты расчетов значений чувствительности SS и специфичности Sр для трех имеющихся классов.
По полученным результатам можно сделать вывод, что специфичность Sp нечеткой классификационной модели имеет довольно высокие значения для диагностики тяжести клинического течения ЯК. Однако для распознавания средней степени тяжести течения заболевания чувствительность SS является низкой, тогда как для определения тяжелого и легкого течения чувствительность имеет достаточно высокое значение. При этом класс «тяжелое течение ЯК (Н)» наиболее четко отграничен и обособлен от остальных с минимальной нечеткостью в конкретных числовых значениях чувствительности и специфичности.
Таким образом, в ходе исследования разработана прогностическая матрица, где каждый из параметров имеет определенный информационный вес и два возможных варианта ответа, которым соответствует определенный балл (0 или 1). Значения информационных весов каждого исследуемого параметра рассчитаны при помощи многофакторного и дискриминантного анализа. Расчет суммы баллов (S) в каждом конкретном случае проводится по приведенной ниже формуле, представляющей собой сумму произведений информационного веса оцениваемого параметра и значения балла одного из его возможных состояний:
S = Xi х 0,4234 + Х2 х 0,6587 + Х3 х 0,4215,
где Xi — содержание SP в сыворотке крови (0 - менее чем в 5 раз; 1 - более чем в 5 раз), Х2 — содержание NT в сыворотке крови (0 - менее чем в 10 раз; 1 - более чем в 10 раз) Х3 — содержание VIP в сыворотке крови (0 - менее чем в 5 раз; 1 - более чем в 5 раз).
Сумма баллов, при которой у больного ЯК прогнозировалось тяжелое течение, составила от 1,0 до 1,5 усл.ед.; средняя тяжесть заболевания - при сумме баллов от 0,5 до 0,99 и легкое течение - до 0,5 усл.ед.
Применение нейросетевого моделирования позволило получить достаточно мощную прогностическую модель. Многослойный персептрон, состоящий из 13 нейронов на входе и 7 нейронов в скрытом модуле, позволяе с большой долей вероятности прогнозировать тяжелое (96%) и легкое (89%) течение ЯК и в 68 % случаев среднюю степень тяжести заболевания.
Таким образом, использование сравнительно небольшого набора данных позволило построить простую прогностическую модель, применение которой приемлемо без эндоскопического вмешательства
Учитывая данные нейросетевого моделирования, мы предприняли попытку создать алгоритм прогнозирования характера клинического течения и возможных исходов ЯК. Алгоритм отличается от существующих анализом не только традиционных клинических, инструментальных и лабораторных данных, но и показателей нейропептидов (рис. 4.12).
