Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 16
1.1. Современные представления о возбудителях гриппа 16
1.2. Пандемия гриппа A/H1N1 2009 года в мире и России 24
1.3. Особенности патогенеза и клинического течения пневмонии на фоне гриппа 30
1.4. Влияние дефензинов на течение инфекционных заболеваний 47
1.5. Повреждение эндотелия при различных состояниях 53
1.6. Полиморфизм генов цитокинов, регуляторных молекул воспаления и регуляции сосудистого тонуса при различных заболеваниях 59
1.7. Современные возможности терапии гриппозной инфекции 68
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 75
2.1. Общая характеристика обследованных больных 75
2.2. Общее клиническое обследование 76
2.3. Исследование концентрации иммуноглобулинов, цитокинов, молекулы межклеточной адгезии, дефензинов 77
2.4. Определение десквамированных эндотелиальных клеток 78
2.5. Молекулярно-генетическое исследование 78
2.6. Патологоанатомическое исследование 80
2.7. Статистическая обработка полученных результатов 82
ГЛАВА III. Клинико-лабораторная и рентгенологическая характеристика больных гриппом a/h1n1/09, осложненным пневмонией 84
3.1. Клиническая характеристика больных пневмонией на фоне гриппа A/H1N1/09
3.2. Закономерности изменения лабораторных показателей крови при пневмонии у больных гриппом A/H1N1/09 98
3.3. Характеристика микрофлоры дыхательных путей при пневмонии на фоне гриппа A/H1N1/09 107
3.4. Особенности рентгенологических проявлений пневмонии у больных гриппом A/H1N1/09 109
3.5. Анализ противовирусной и антибактериальной терапии пациентов при гриппе A/H1N1/09, осложненном пневмонией 121
ГЛАВА IV. Иммунологические изменения у больных гриппом a/h1n1/09, осложненным пневмонией 132
4.1. Особенности гуморального иммунитета при пневмонии у больных гриппом A/H1N1/09 132
4.2. Особенности содержания цитокинов при пневмонии у больных гриппом A/H1N1/09 135
4.3. Особенности содержания дефензинов при пневмонии у больных гриппом A/H1N1/09 151
ГЛАВА V. Повреждение эндотелия у больных гриппом a/h1n1/09, осложненным пневмонией 141
ГЛАВА VI. Молекулярно-генетические особенности у больных гриппом a/h1n1/09, осложненным пневмонией 146
ГЛАВА VII. Патологическая анатомия и анализ причин летальных исходов при гриппе A/H1N1/09 162
ГЛАВА VIII. Отдаленные результаты у больных, перенесших пневмонию на фоне гриппа A/H1N1/09 184
ГЛАВА IX. Прогнозирование течения и исходов при гриппе A/H1N1/09 205
9.1. Характер корреляционных взаимоотношений между изученными клинико лабораторными параметрами 200
9.2. Прогнозирование степени тяжести пневмонии на фоне гриппа A/H1N1/09 203
9.3. Прогнозирование развития ОПЛ/ОРДС при пневмонии у больных гриппом A/H1N1/09 206
9.4. Прогнозирование исхода пневмонии на фоне гриппа А/НШ1/09 209
9.5. Прогнозирование осложнений при гриппе A/H1N1/09 в зависимости от
генетических особенностей больных 212
Глава . Обсуждение полученных данных 221
Выводы 262
Практические рекомендации 266
Список сокращений 267
Список литературы
- Влияние дефензинов на течение инфекционных заболеваний
- Исследование концентрации иммуноглобулинов, цитокинов, молекулы межклеточной адгезии, дефензинов
- Характеристика микрофлоры дыхательных путей при пневмонии на фоне гриппа A/H1N1/09
- Особенности содержания цитокинов при пневмонии у больных гриппом A/H1N1/09
Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на успехи в разработке новых вакцин и противовирусных препаратов, грипп продолжает оставаться трудно контролируемой инфекцией и причиной летальных исходов среди взрослого и детского населения. Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции остаются самыми массовыми заболеваниями во многих странах мира. В России их доля в общей структуре инфекционной патологии превышает 90%, при этом регистрируется до 30 млн больных гриппом и ОРВИ (Карпухин Г.И., 2001; Деева Э.Г., 2008; Лещенко И.В., 2011). С широким распространением и негативным воздействием вирусных инфекций на население страны сегодня связан целый ряд медицинских и социально-экономических проблем. Доля острых респираторных заболеваний составляет 30 - 40% от потерь рабочего времени среди взрослого населения, а ежегодный суммарный экономический ущерб от гриппа оценивается экспертами в сумму от 40 до 100 млрд рублей в год (Ершов Ф.И., 2003; Исаков В.А., 2012).
Среди вирусов гриппа наибольшее эпидемическое значение имеет вирус типа А, он является уникальным инфекционным агентом, так как способен изменять собственную антигенную структуру и биологические свойства (Карпухин Г.И., 2001; Деева Э.Г., 2008; D. Gatherer, 2009; Львов Д.К. и др., 2010; Кисилев О.И. и др. 2012). Это приводит к тому, что коллективный иммунитет у населения, приобретенный в ответ на заражение предшествующим штаммом вируса, практически не защищает от нового варианта вируса (Van Wijk F., 2009; Кисилев О.И. и др. 2012). Изменение антигенной структуры является эволюционным механизмом приспособляемости вируса для обеспечения своей выживаемости, вследствие чего грипп продолжает оставаться одним из основных эпидемических заболеваний. Способность вируса гриппа к антигенным изменениям остается основной проблемой при производстве вакцин, так как каждый новый вариант вируса должен быть выделен и идентифицирован для того, чтобы быть включенным в вакцину (Степанова Л.А. и др., 2006). Особую обеспокоенность мирового научного сообщества вызывают периодически возникающие глобальные пандемии, являющиеся результатом появления новых шифт-вариантов вируса с радикально измененной структурой гемагглютинина и нейраминидазы, являющихся следствием реассортации генов вирусов, циркулирующих среди животных и людей или реинтродукции возбудителя из не идентифицированных до сих пор источников (Карпухин Г.И., 2001; Львов Д.К. и др., 2010; Кисилев О.И. и др. 2012).
За последние 400 лет в мире зарегистрированы 18 пандемий гриппа (Карпухин Г.И., 2001; Кисилев О.И. и др. 2012). Первой глобальной эпидемической угрозой новейшего времени стала пандемия гриппа типа A/H1N1, объявленная Всемирной Организацией Здравоохранения 11 июня 2009 года. По данным ВОЗ, пандемией было охвачено около 30% населения земного шара в 214 странах и официально зарегистрировано свыше 18 тысячи смертей от лабораторно подтвержденного гриппа (Колобухина Л.В., 2010). Одним из первых регионов Российской Федерации, где началась эпидемия и были официально зарегистрированы летальные исходы при пандемическом гриппе, стал Забайкальский край. В крае за 12 недель эпидемии ОРВИ различной степени тяжести перенесли более 128 тысяч человек (11,5% населения) (Лапа С.Э., 2010). Средняя продолжительность эпидемии составила 6,8 недель, при колебании в отдельных городах от 4 (Брянск, Краснодар, Норильск, Орел, Пермь, Якутск) до 13 недель (Чита). Наиболее высокая заболеваемость (10,2-10,3%) была зарегистрирована в городах Дальневосточного и Сибирского регионов, особенно в Чите (19,2%), Магадане (12%), Южно-Сахалинске (11,7%). Самая низкая – 5,7% в Южном федеральном округе: в Ростове-на-Дону заболеваемость составила 4,3%, в Краснодаре – 2,3% (Кисилев О.И, 2012).
Особенностью эпидемии гриппа 2009 года явилась регистрация большого количества разнообразных осложнений, в первую очередь пневмоний (Louie J., 2009; Алексеев А.М., 2009; Чучалин А.Г., 2010; Бобылева З.Д., 2010; Bautista E., 2010; Gilca R., 2011; Кисилев О.И. и др. 2012). Тяжелое течение пневмоний при гриппе А/H1N1/09 характеризовалось большим количеством осложнений, таких как развитие острой дыхательной недостаточности, синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, инфекционно-токсического шока, плевритов и абсцедирования. У ряда больных поражение легочной ткани и осложнения на этом фоне развивались стремительно, несмотря на интенсивную терапию в условиях реанимационного отделения. В Забайкальском крае было зарегистрировано 57 летальных исходов. По данным патологоанатомических исследований у всех умерших выявлены признаки острого респираторного дистресс-синдрома, отека головного мозга, синдрома ДВСК (Чарторижская Н.Н. и др., 2011).
Высокая частота развития поражения легких при гриппе A/H1N1/09 объясняется тропностью вируса к эпителиальным клеткам, в том числе и к эндотелию, что определяет характерную клиническую картину гриппа и пневмонии на этом фоне (Львов Д.К., 2010; Кисилев О.И. и др. 2012). На неблагоприятное течение пневмонии может указывать и появление признаков синдрома системного воспалительного ответа (Гельцер Б.И., 2003; Кукес В.Г., 2003; Агаджанян В.В., 2006). Повышенная проницаемость капилляров легких, а также чрезмерная индукция цитокинов, повреждение эндотелия и расстройства микроциркуляторной гемодинамики, запуск синдрома ДВСК являются основными механизмами развития системной воспалительной реакции (Белоцкий С.М., 2008; Савельева В.С., 2011). Между тем, при гриппе А/H1N1/09 многие патогенетические аспекты тяжелого течения и летальных исходов практически не исследованы. Также остаются малоизученными и отдаленные последствия после пневмонии на фоне гриппа А/H1N1/09.
В связи с этим актуальным является проведение комплексного исследования по изучению клинико-патогенетических закономерностей пневмонии на фоне гриппа А/H1N1/09 в Забайкальском крае, что позволит разработать информативные лабораторно-инструментальные критерии прогнозирования ее исходов и послужит основанием для разработки дифференцированных подходов к их профилактике и лечению.
Цель исследования: установить клинико-патогенетические закономерности пневмонии на фоне гриппа А/H1N1/09 в Забайкальском крае и разработать прогностические критерии ее исходов.
Задачи исследования:
-
Изучить и выявить закономерности клинической картины, лабораторных и рентгенологических данных, эффективность противовирусной терапии у больных гриппом А/H1N1/09, осложненным пневмонией.
-
Определить динамику содержания в крови цитокинов (IFg, TNF, IL-10), сывороточных иммуноглобулинов (Ig А, M и G), дефензинов (HNP 1-3) в зависимости от тяжести и исходов пневмонии на фоне гриппа А/H1N1/09.
-
Исследовать маркеры активации эндотелия у больных с пневмонией на фоне гриппа А/H1N1/09 по уровню содержания в крови десквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) и молекулы межклеточной адгезии (sICAM-1) в зависимости от тяжести и исходов пневмонии на фоне гриппа А/H1N1/09.
-
Выявить особенности полиморфизма генов цитокинов (TNF G308A, IL10 C592A, IL10 C819T, IL10 G1082A), гена регуляторной молекулы воспаления (CD14 C159T) и регуляции сосудистого тонуса (еNOS C786T) у пациентов с гриппом A/H1N1/09, осложненным пневмонией.
-
Проанализировать результаты патоморфологических исследований умерших от гриппа А/H1N1/09.
-
Провести катамнестическое исследование клинических, лабораторных и инструментальных показателей у пациентов после перенесенной пневмонии во время эпидемии гриппа А/H1N1/09 в отдаленный период.
-
Оценить характер корреляционных взаимосвязей между показателями, характеризующими оксигенацию артериальной крови, состояние иммунитета, повреждение эндотелия и мышечной ткани. Разработать прогностические критерии тяжести и исходов при гриппе А/H1N1/09.
Научная новизна. Комплексно изучены клинические и патогенетические закономерности течения и исходов пневмонии на фоне гриппа А/H1N1/09 в Забайкальском крае. Проведена сравнительная оценка клинических, лабораторных и инструментальных данных у больных гриппом А/H1N1/09 в зависимости от тяжести и исходов заболевания. Выявлено, что тяжелое течение гриппозной пневмонии сопровождается выраженным синдромом системного воспалительного ответа, при этом типичными клиническими проявлениями в первые дни заболевания являются - повышение температуры выше 380 С (87,3%), одышка в покое (77,2%), кровохарканье (19%), выраженные миалгии (40,5%), развитие и быстрое прогрессирование острой дыхательной недостаточности вследствие ОПЛ/ОРДС (48%). Установлено важное значение предрасполагающих факторов (отсутствие вакцинации, молодой возраст, избыточная масса тела и ожирение, артериальная гипертензия, ХОБЛ) в развитии тяжелой пневмонии на фоне гриппа А/H1N1/09; определены характерные изменения в крови - это лейкопения, лимфопения, тромбоцитопения, увеличение АСТ, АЛТ, КФК, ЛДГ; выявлены специфические рентгенологические изменения - преимущественно двусторонняя локализация пневмонической инфильтрации в нижних отделах по интерстициальному типу.
Установлены особенности изменений содержания показателей иммунитета: наиболее выраженная гиперпродукция провоспалительных цитокинов (IFg, TNFa) зарегистрирована в группе тяжелых пациентов, в том числе с ОПЛ/ОРДС в первые дни госпитализации; увеличение противовоспалительного IL-10 было выражено в большей степени при нетяжелых гриппозных пневмониях. Содержание дефензинов увеличивается при нетяжелых гриппозных пневмониях в отличие от тяжелых форм, в динамике концентрация HNP1-3 нарастала у пациентов независимо от тяжести заболевания.
Определена роль повреждения эндотелия при пневмонии на фоне гриппа А/H1N1/09, проявляющаяся увеличением числа десквамированных эндотелиоцитов в крови, возрастанием концентрации s-ICAM-1; выраженность повреждения эндотелия зависит от тяжести и исходов гриппозной пневмонии.
Выявлено, что показатели, характеризующие состояние иммунитета, активацию эндотелия изменяются в большей степени при пневмониях на фоне гриппа А/H1N1/09 по сравнению с бактериальными пневмониями вне эпидемии.
Изучены особенности полиморфизма генов цитокинов (TNF G308A, IL10 C592A, IL10 C819T, IL10 G1082A), гена регуляторной молекулы воспаления (CD14) и регуляции сосудистого тонуса (еNOS C786T) у пациентов с гриппом A/H1N1/09, осложненным пневмонией и установлено преобладание гомозиготного носительства аллели G полиморфизма (308 G/A) гена TNF (80%), G-аллели гена IL 10 (1082 G/A) (84,5%), С-аллели гена IL 10 (592 C/A) (68,2%), преимущественно в виде гомозиготного варианта, гомозиготы С/С полиморфизма (819 C/Т) гена IL 10 (65%). Встречаемость гомозиготы Т/Т гена CD14 (159 C/Т) оказалась ниже по сравнению с группой здоровых лиц (16%). Установлено преобладание гомозиготы Т/Т полиморфизма (786 C/Т) гена еNOS среди заболевших гриппозной пневмонией (47%), а носительство гетерозиготы C/Т встречалось реже по сравнению с контролем (23%). В группе пациентов с наличием «протективного» генотипа C/Т содержание молекулы межклеточной адгезии sICAM-1 было ниже, чем при других вариантах полиморфизма еNOS (786 C/Т). Гаплотипы [TNF (308 GG); IL10 (819 CC); (1082 GG)] и [TNF (308 GG); IL10 (819 CC); (1082 GG); CD14 (159 CС)] в 4,8 и 6 раз были более распространенными среди заболевших гриппом А/H1N1/09 по сравнению с контролем и ассоциированы с развитием ОПЛ/ОРДС и летальным исходом.
При аутопсии обнаружены преимущественно патоморфологические маркеры ОРДС (93,6%) на фоне диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (98%), паренхиматозной дистрофии внутренних органов (95,7%), инфекционно-токсического шока (46,8%), повреждения мышечной ткани (46,8%). Выявлены факторы риска летального исхода, среди которых наиболее частыми оказались ожирение и ХОБЛ.
Проведено катамнестическое исследование клинических, лабораторных и инструментальных показателей у пациентов через 6-12 месяцев после перенесенной пневмонии во время эпидемии гриппа А/H1N1/09. При этом отмечено, что у реконвалесцентов длительно сохраняются респираторные симптомы, астения, повышенный уровень IFg (до 6 месяцев). В отдаленный период (через 12 месяцев) у больных, перенесших тяжелую пневмонию, был сформирован пневмофиброз в 20% случаях.
Выявленные корреляционные взаимосвязи изученных показателей у больных пневмонией на фоне гриппа А/H1N1/09 позволили установить существенную роль дисбаланса иммунитета, повреждения эндотелия и мышечной ткани в формировании системного воспалительного ответа при тяжелом течении и неблагоприятных исходах высокопатогенного гриппа.
На основе дискриминантного и логистического регрессионного анализа предложены критерии для прогнозирования у больных гриппом А/H1N1 риска тяжелого течения пневмонии, развития ОПЛ/ОРДС, а также риска летального исхода.
Теоретическая и практическая значимость работы. В исследовании получены новые данные о клинико-патогенетических закономерностях развития тяжелых форм гриппа А/H1N1/09. Выделены группы риска развития пневмонии на фоне высокопатогенного гриппа, что демонстрирует необходимость вакцинации от гриппа, а также настороженного внимания в отношении лиц с избыточной массой тела и ожирением, а также при наличии артериальной гипертензии и ХОБЛ. В работе раскрыты закономерности клинического течения пневмонии на фоне гриппа А/H1N1/09 в Забайкальском крае, выделены критерии тяжелых форм заболевания, оценка которых возможна непосредственно при поступлении больных в стационар.
Установлены новые сведения о патогенетической взаимосвязи нарушения цитокинового баланса, содержания дефензинов, повреждения эндотелия и мышечной ткани, определена их роль в развитии осложнений у больных гриппом А/H1N1/09 и продемонстрирована целесообразность комплексного изучения уровня IFg, TNF, IL-10, Ig А, M, HNP; определения количества ДЭК и концентрации s-ICAM-1, а также маркеров повреждения мышечной ткани – КФК и ЛДГ.
В работе получены новые данные об особенностях полиморфизма генов цитокинов (TNF G308A, IL10 C592A, IL10 C819T, IL10 G1082A), гена регуляторной молекулы воспаления (CD14) и регуляции сосудистого тонуса (еNOS C786T) у пациентов с гриппом A/H1N1/09, осложненным пневмонией. Выявленные генотипы предрасположенности вносят вклад в понимание механизмов несостоятельности противовирусной защиты, что позволит определить категории лиц с высоким риском развития тяжелых форм гриппа.
Изучение патоморфологических изменений позволило установить маркеры ОРДС на фоне диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, паренхиматозной дистрофии внутренних органов, инфекционно-токсического шока, повреждения мышечной ткани.
Разработаны новые модели для прогнозирования риска тяжелого течения пневмонии, развития ОПЛ/ОРДС, а также риска летального исхода у больных гриппом А/H1N1/09.
Катамнестическое исследование пациентов, перенесших пневмонию на фоне гриппа A/H1N1/09, выявило длительно сохраняющиеся респираторные симптомы и астению, повышение уровня IFg (до 6 месяцев); а также формирование диффузного пневмофиброза после тяжелого течения пневмонии, что в свою очередь демонстрирует необходимость тщательного динамического наблюдения за реконвалесцентами и проведения реабилитационных мероприятий на амбулаторном этапе.
Внедрение результатов в практику. Основные положения, развиваемые в диссертации, внедрены в учебный процесс ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» на кафедрах нормальной и патологической физиологии; патологической анатомии, факультетской терапии, госпитальной терапии, поликлинической терапии с курсом медицинской реабилитации, терапии ФПК и ППС, анестезиологии и реаниматологии, в лечебно-диагностическую практику лечебных учреждений Забайкальского края. Защищен патент и внедрен в практическое здравоохранение способ ранней диагностики вирусной пневмонии (патент РФ на изобретение № 2440577).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
У больных гриппом А/H1N1/09 тяжелое течение пневмонии характеризуется преимущественно двусторонней пневмонической инфильтрацией в нижних отделах легких (55,5%) и сопровождается синдромом выраженного системного воспалительного ответа.
-
При гриппе А/H1N1/09, осложненном пневмонией, развиваются существенные нарушения в иммунном статусе, характеризующиеся гиперпродукцией провоспалительных цитокинов IFg и TNF, увеличением противовоспалительного IL-10, IgА, IgМ и уровня дефензинов нейтрофилов, а также повреждением эндотелия, проявляющимся увеличением числа десквамированных эндотелиоцитов в крови и возрастанием концентрации s-ICAM-1.
-
У пациентов с гриппозными пневмониями установлено преобладание носительства аллеля G полиморфизма (308 G/A) гена TNF и G-аллеля гена IL 10 (1082 G/A), преимущественно в виде гомозиготного варианта; С-аллеля гена IL 10 (592 C/A), в большей степени в виде гомозиготного носительства; гомозиготы С/С полиморфизма (819 C/Т) гена IL 10; Т/Т полиморфизма (786 C/Т) гена еNOS; напротив гомозиготное носительство Т/Т гена CD14 (159 C/Т) встречалось реже по сравнению с контролем. Гаплотипы [TNF (308 GG); IL10 (819 CC); (1082 GG)] и [TNF (308 GG); IL10 (819 CC); (1082 GG); CD14 (159 CС)] были более распространенными среди заболевших по сравнению с контролем, преимущественно при тяжелых формах пневмонии.
-
По результатам патоморфологических исследований умерших от гриппа А/H1N1/09 выявлена ассоциация с факторами риска, среди которых наиболее частыми оказались ожирение и ХОБЛ. При аутопсии обнаружены преимущественно патоморфологические маркеры ОРДС на фоне диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, паренхиматозной дистрофии внутренних органов, инфекционно-токсического шока, повреждения мышечной ткани.
-
У пациентов, перенесших пневмонию на фоне гриппа А/H1N1/09, длительно сохраняются респираторные симптомы, астения, повышенный уровень IFg (до 6 месяцев); после тяжелой пневмонии в 20% случаях формируется диффузный пневмосклероз.
-
Ряд изученных клинических, лабораторных и генетических параметров обладают независимой прогностической значимостью в плане риска тяжелого течения пневмонии, развития ОПЛ/ОРДС и летального исхода у больных гриппом А/H1N1.
Апробация работы. Результаты исследования доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Итоги эпидемии гриппа А/H1N1» (Чита, 2010); II международной научно-практической конференции «Экология. Здоровье. Спорт» (Чита, 2010); ХVIII Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011); V Байкальской межрегиональной конференции (Иркутск, 2011); IV Съезде врачей-пульмонологов Сибири и дальнего Востока (Благовещенск, 2011); XXI Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Уфа, 2011); Всероссийской научно-практической конференции «Итоги эпидемии гриппа А/H1N1», посвященной закрытию Всероссийского фестиваля науки (Челябинск, 2011); VI Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2011); ХIX Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012); научно-практической конференции с международным участием «Болезни органов дыхания: от ребенка к взрослому» (Чита, 2012); III съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2012); II Всероссийской научно-практической конференции «Профилактика гриппа и острых респираторных инфекций» (Челябинск, 2012); ХХII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2012); Congress European Respiratory Society (Vienna, 2012, 2013); I съезде терапевтов Забайкальского края (Чита, 2013); Всероссийской конференции посвященной 60-летию ЧГМА (Чита, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 научных работ, в том числе 15 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ; опубликована глава в монографии «Организация и проведение противоэпидемических мероприятий в период эпидемии гриппа А/H1N1/09 в октябре-декабре 2009 г. в Забайкальском крае» под редакцией академика Г.Г. Онищенко, получен 1 патент на изобретение №2440577 «Способ ранней диагностики вирусной пневмонии».
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 315 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 9 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 241 работу отечественных и 215 зарубежных авторов; иллюстрирована 61 таблицей и 29 рисунками.
Влияние дефензинов на течение инфекционных заболеваний
Нуклеопротеин — внутренний белок вириона, взаимодействующий с белком Ml, РНК, белками-полимеразами, составляет 17-20% от всей массы белков вириона. РНК-связывающая активность нуклеопротеина требуется для транскрипции вирусного генома [55, 374, 388].
Относительное содержание отдельных химических компонентов в вирусных частицах (РНК, белки, липиды, углеводы) может колебаться, так как популяция вирусов гетерогенна, а также потому, что состав частицы вируса зависит от системы клеток, в которых культивируют вирус. Вирусные частицы, обладающие инфекционными свойствами, содержат приблизительно 0,8-1,1% РНК, 70-75% белка, 20-24% липидов и 5-8% углеводов [54, 55].
Классификация типов вирусов гриппа основана на антигенных различиях двух поверхностных гликопротеинов — гемагглютинина и нейраминидазы. Согласно этой классификации вирусы гриппа подразделяют на три типа - А, В. и С [91,127, 173,237,301,317].
Вирусы гриппа типов В и С выделены только от человека. Вирус гриппа В способен изменять свою антигенную структуру, однако эти процессы выражены меньше, чем при гриппе А. Вирусы типа В обычно являются причиной локальных вспышек и эпидемий и могут совпадать с активацией гриппа типа А или предшествовать ему. Грипп типа В обычно вызывает заболевания в более мягкой форме. Вирус гриппа С мало изучен. Известно, что в отличие от вирусов А и В он содержит только 7 фрагментов нуклеиновой кислоты и один поверхностный антиген, антигенная структура не подвержена существенным изменениям. Симптомы болезни обычно очень легкие либо не проявляются вовсе [7, 58, 115, 173,194, 237,239,282, 300, 413].
Вирусы гриппа типа А в большей степени обладают способностью к изменению структуры гемагглютинина и нейраминидазы. Вирусы гриппа А широко распространены в природе и поражают как людей, так и целый ряд млекопитающих и птиц [12, 24, 53, 56, 59, 60, 100, 102, 120, 127, 129, 194, 236, 260, 265, 351]. Некоторые из вирусов гриппа А способны циркулировать одновременно в разных организмах, например, в людях и свиньях, птицах и свиньях. Это способствует изменчивости вирусов и их распространению в окружающей среде. Известно множество подтипов вируса типа А, которые классифицируются по поверхностным антигенам - гемагглютинину и нейраминидазе: на настоящий момент известно 16 типов гемагглютинина и 9 типов нейраминидазы [7,24, 35, 86,190, 322, 335, 360, 368].
Большинство вирусов видоспецифичны, то есть вирус птиц не может поражать свинью или человека и наоборот. Но многие ученые полагают, что некоторые животные могут служить природными резервуарами, где при определенных условиях может происходить «обмен» (рекомбинация) антигенными структурами между разными подтипами вирусов гриппа А. Все подтипы гриппа А обнаруживаются у водоплавающих птиц и лишь некоторые у человека, свиней, лошадей и т.д. [7, 24, 60, 86, 120, 129, 260, 303, 329, 393, 421]. В популяции человека до настоящего времени были выявлены вирусы гриппа, А только трех подтипов с гемагглютининами HI, Н2 и НЗ. При этом вирусы содержат только два типа нейраминидазы - N1 и N2.
Фрагментарность генома вируса гриппа обусловливает возможность получения генетических рекомбинантов (реассортантов), т.е. вирусов, сформировавшихся в результате одновременной репродукции в клетке двух различных штаммов вируса гриппа одного серотипа, обменявшихся в процессе сборки вириона генетическим материалом [53, 70, 127,129,145,451].
Невозможность получения рекомбинантов между вирусами гриппа А и В свидетельствует об их принадлежности к разным биологическим видам. Вирусы гриппа А значительно более вирулентны и контагиозны, чем вирусы гриппа В и С. Вирусы гриппа типа А подвергаются двум видам антигенных изменений [58, 100, 120,282,317].
Формирование вируса, отличающегося по антигенной характеристике от родоначальника цикла, называется антигенным дрейфом. Антигенный дрейф происходит в результате точечных мутаций в геноме, что приводит к изменению антигенных детерминант белков, и они перестают распознаваться иммунной системой хозяина. Мутации (точечные и множественные) представляют собой изменение в геномной последовательности в результате замены (транзиции, трансверсии), выпадения (делеции) или вставки (инсерции) одного или нескольких нуклеотидов. Именно мутации ответственны за возникновение новых антигенных вариантов. Отдельные гены вируса гриппа человека аккумулируют мутации почти с постоянной скоростью, что позволяет говорить о «молекулярных часах» вируса гриппа. Антигенные (дрейфовые) варианты вирусов гриппа А появляются и доминируют в течение 2-8 лет и только потом замещаются следующей антигенной разновидностью. Гетерогенность штаммов, циркулирующих в один эпидемический сезон, является основой природной селекции. Антигенный дрейф вирусов гриппа A(H1N1) не столь интенсивен, как у вирусов гриппа A(H3N2). Считается, что вирусы гриппа A(H1N1) часто эволюционируют по так называемому «молчащему пути», когда мутации в гене гемагглютинина не определяются до тех пор, пока их аккумулирование не приведет к появлению вируса с антигенными и генетическими свойствами, оптимальными для эпидемического распространения. Подобные штаммы служат причиной эпидемий гриппа А(НШ1), в отличие от вирусов гриппа A(H3N2). Характерной чертой циркуляции вирусов этого подтипа являются достаточно длительные периоды «затишья» между эпидемиями [12, 24, 50, 53, 55, 56, 70, 83, 86, 120, 138,161,190, 259,303,313, 346].
Второй вид антигенной изменчивости, который описан только для вируса гриппа А, включает более неожиданные и драматические изменения, которые называют антигенным шифтом (сдвигом). Такие сдвиги отмечены появлением антигенно новых вирусов, к которым популяция не имеет иммунитета и что влечет за собой появление пандемий. Этот вариант заключается в резкой смене гемагглютинина и (или) нейраминидазы [32, 53, 59, 63, 86, 127, 264, 298, 311, 317, 335, 404].
Исследование концентрации иммуноглобулинов, цитокинов, молекулы межклеточной адгезии, дефензинов
В работе Е.А. Байгозиной при изучении нозокомиальных пневмоний риск развития заболевания оказался выше у носителей генотипов G/A + А/А. У больных при носительстве генотипа А/А гена TNF наблюдалась максимальная концентрация данного цитокина в сыворотке крови по сравнению с генотипами G/G и G/A, что обуславливало патогенетическое действие данного полиморфизма [9,174].
Из приведенных результатов следует, что функциональный полиморфизм гена TNFa, связанный с повышенной продукцией данного цитокина, служит фактором риска развития тяжелых проявлений инфекционных заболеваний и развития аутоиммунных расстройств. С другой стороны, нарушения механизмов иммунной защиты от патогенов больше ассоциируется с низкопродуцирующим вариантом полиморфизма гена TNFa.
Для избежания избыточных проявлений системного воспаления в организме включаются механизмы контроля, опосредованные продукцией противовоспалительных цитокинов. Нарушение продукции, секреции и рецепции противовоспалительных цитокинов приводит к серьезным дефектам антиинфекционной защиты и усугубляет прямое повреждающее действие микроорганизмов и их токсинов на легочную ткань. IL10 - наиболее активный противовоспалительный цитокин. При нарушении синтеза IL10 повышается восприимчивость к вирусной и бактериальной инфекциям. В.М. Schaaf et al. обнаружили, что концентрация IL10 в сыворотке крови у больных с сепсисом с генотипом -1082 G/G была выше по сравнению с носителями генотипов А/А или A/G. Это ассоциировалось с высоким уровнем летальности [343, 408]. P.M. Gallagher и соавт. (2003) выявили ассоциацию между -1082 G/G генотипом и степенью тяжести пневмонии и уровнем летальности [257]. M.N. Gong и соавт. (2006) продемонстрировали взаимосвязь между генотипом -1082 G/G и развитием ОРДС [197, 342]. О.Н. Сабитова и соавт. (2010) выявили, что носительство генотипа GG гена IL10 (-1082) в комплексе с клиническими данными позволяет прогнозировать затяжное течение внебольничной пневмонии, развитие осложнений [196, 197].
Из немногочисленных данных о роли полиморфизма (592 С/А) гена IL 10 при инфекционных заболеваниях известно, что у больных с туберкулезом преобладало гомозиготное носительство аллели А. При этом у пациентов выявлены максимальные уровни IL10, а у больных с генотипом С/С обнаружен наиболее низкий уровень изучаемого цитокина [5, 218].
М. Helminen и соавт. (1999) установили, что гаштотип IL-10-1082A/-819C-592С связан с более низкой стимулированной продукцией IL-10, чем -1082G/-819С/-592С гаштотип, и повышает чувствительность к развитию вирусных инфекций, в частности к вирусу Эпштейна-Барра [197, 323]. A. Wattanathum и соавт. (2005) выявили, что гаштотип IL10 -592C/734G/3367G у пациентов с внебольничной пневмонией ассоциируется с риском летального исхода в первые 28 суток и полиорганной недостаточностью у пациентов в критическом состоянии с сепсисом легочной этиологии в отличие от больных, у которых причины возникновения сепсиса внелегочные [41, 197, 344].
Известно, что в основе поражения различных органов и систем большую роль играют циркуляторные расстройства, в этой связи особый интерес представляет выявление предрасположенности к нарушениям в системе регуляции сосудистого тонуса. К эндотелиальным факторам дилатации относится и оксид азота (NO). Кроме того, NO угнетает пролиферацию клеток в гладкомышечном слое сосудов, ингибирует агрегацию тромбоцитов и адгезию нейтрофилов к эндотелию сосудов, также способен вызывать повреждение клеток, в частности эндотелия, путем генерации свободных радикалов [20]. В работе К.С. Marco (2011) установлено, что к уменьшению концентрации NO в кровеносном русле предрасполагает вариант -786 С гена eNOS [292]. В связи с вышесказанным, поиски генетических маркеров развития осложнений при гриппе A/H1N1 являются перспективными как в теоретическом, так и в практическом отношениях. После эпидемии гриппа в Забайкальском крае в 2009 году в ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» проведен ряд исследований в этом направлении. Так, А.А. Петровым, Ю.А. Витковским (2012) выявлено, что генотип СС полиморфизма CD14 С159Т ассоциирован с тяжелым и осложненным течением гриппа A/H1N1/09, а гаплотип [CD 14 (159СС); FCGR2A (166Arg/Arg)] приводит к летальному исходу заболевания. Также обнаружено, что G-аллель полиморфного маркера TNFa у больных со средней и тяжелой тяжестью высокопатогенного гиппа встречается чаще, чем у здоровых [26, 40]. Выявлено, что развитие ТЭЛА у больных гриппом A/H1N1 ассоциируется с носительством Т-аллели MTHFR С677Т. У пациентов с летальным исходом гриппа A/H1N1, осложненного ТЭЛА, встречается только гомозиготное носительство полиморфизма тканевого фактора D-12081 (генотипы DD и II). Среди больных высокопатогенным гриппом без тромботических осложнений и у здоровых лиц преобладает гетерозиготное носительство гена TF D1208I [172].
В работе Гергесовой Е.Е. (2011) установлено, что распределение частот встречаемости полиморфных вариантов генов тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина р3) (Leu33-Pro) и тромбоцитарного рецептора коллагена GPIa (интегрина х2) (С807-Т) практически не различается среди здоровых лиц и больных гриппом A/H1N1/2009. У больных-носителей гомозиготного 807 ТТ генотипа тромбоцитарного рецептора коллагена GPIa (интегрина аг) способность тромбоцитов взаимодействовать с лимфоцитами усиливается, а спонтанная и коллаген-индуцированная агрегация снижается [43].
Характеристика микрофлоры дыхательных путей при пневмонии на фоне гриппа A/H1N1/09
У умерших пациентов вследствие ОРДС при заключительном рентгенологическом исследовании описывалась картина двустороннего поражения легочной ткани, причем в 5 случаях имел место субтотальный патологический процесс. Двум пациентам не удалось провести лучевое исследование по причине стремительно развившейся ОДН и летальным исходом на этом фоне. В среднем летальный исход отмечен на 6±4,4 сутки пребывания в стационаре.
Таким образом, по данным лучевых исследований специфической особенностью пневмонии при гриппе A/H1N1/09 явился интерстициальный тип инфильтрации легочной ткани и более частая регистрирация двухстороннего поражения легких, при которой в половине случаев наблюдалось развитие ОПЛ/ОРДС. У 28% пациентов по рентгенологическим данным регистрировались легочные осложнения (плевриты, абсцедирование, ТЭЛА) преимущественно при тяжелых формах заболевания. При заключительном лучевом исследовании нормализация структуры легкого наблюдалась лишь в 14% случаях, преимущественно у пациентов с нетяжелыми пневмониями. В 18,2% регистрировались постпневмонические изменения в виде диффузного пневмосклероза, плевральных спаек, наличия сухой полости в легочной ткани. Наиболее информативным методом в диагностике пневмонии и ее осложнений на фоне гриппа A/H1N1 явилась КТ легких.
Доказано, что раннее (в первые 48 часов заболевания) назначение противовирусной терапии позволяет снизить частоту осложнений и улучшить прогноз больных при гриппе A/H1N1 [2, 55, 82, 123, 131, 132, 160, 162, 211, 213, 373]. Адекватная антибактериальная терапия также рассматривается в качестве ведущего фактора, позволяющего улучшить исход при пневмониях и сократить пребывание пациента в стационаре [30, 96]. В связи с этим проведен анализ эффективности лечения противовирусными и антибактериальными препаратами у пациентов с пневмониями на фоне гриппа A/H1N1/09.
До поступления в стационар противовирусную терапию получали 66 больных (48,2%). На амбулаторном этапе пациенты самостоятельно либо по назначению врачей первичного звена принимали этиотропную терапию преимущественно арбидолом - 60 человек (91%), в единичных случаях использовались ремантадин - 3 (4,5%), тамифлю - 3 (4,5%). Некоторые пациенты лечение противовирусными препаратами сочетали с приемом индукторов интерферона (интерферон, циклоферон). Однако ретроспективно было сложно оценить соответствие схем приема препаратов больными. Из них в дальнейшем нетяжелое течение пневмоний отмечалось у 28 пациентов (42,4%), тяжелое у 38 (57,6%), в том числе с развитием ОПЛ/ОРДС у 20 человек (30,3%) (таблица 16).
При госпитализации больных противовирусная терапия назначалась с первых суток. При этом выбор препарата зависел от ранее начатого лечения, тяжести состояния пациента и наличия лекарственных средств в отделении. Озельтамивир назначался в 75 случаях (54,7%), в основном при тяжелых пневмониях. Арбидол использовался у 54 больных (39,4%), в 32 случаях (23,4%) в сочетании с кагоцелом. Ингавирин применялся у 5 человек (3,6%) (таблица 16). Отсутствие положительной динамики у 22 пациентов (16%) потребовало продолжения или смены ранее назначенных противовирусных препаратов в 13 случаях на озельтамивир, в 7 - на арбидол и в 2 - на ингавирин (таблица 16). Все препараты назначались преимущественно в рекомендуемых дозах согласно инструкциям по применению. У 3 крайне тяжелых пациентов, с развившимся ОРДС, дозу тамифлю увеличивали в 2 раза, в 1-м случае — безуспешно.
Арбидол при тяжелых пневмониях первоначально назначался 19 больным, у 13 больных в дальнейшем препарат заменяли на озельтомивир. При нетяжелых пневмониях арбидол применялся в 35 случаях, в 2-х случаях потребовалось продолжить этиотропную терапию озельтамивиром и ингавирином. При анализе средних сроков назначения арбидола от первых симптомов гриппа у пациентов с различной степенью тяжести отмечено достаточно раннее начало терапии — первые 48 часов (таблица 17). Причем при нетяжелом течении пневмонии раннее назначение препарата выявлено в 11,7% случаях, при тяжелом - в 20,4%, в том числе с развитием ОПЛ/ОРДС - в 10,2%.
Этиотропная терапия озельтамивиром при поступлении в стационар в группе тяжелых пациентов назначалась в 50 случаях, из них у 23 пневмония осложнилась развитием ОПЛ/ОРДС, в дальнейшем у 10 пациентов наступил летальный исход. Использование ингибитора нейраминидазы у умерших больных продолжалось в среднем 3,8±2,8 суток. При госпитализации больных с нетяжелыми пневмониями озельтамивир назначался в 19 случаях. В первые 48 часов назначался у нетяжелых пациентов в 3, при тяжелом течении - в 6 случаях. У больных с развитием ОПЛ/ОРДС этиотропная терапия тамифлю в ранние сроки не начиналась. Сроки начала использования ингибитора нейраминидазы от первых симптомов гриппа при различной тяжести заболевания достоверно не отличались (таблица 17).
Особенности содержания цитокинов при пневмонии у больных гриппом A/H1N1/09
В 56,5% случаев был получен рост Enterococcus faecium, реже - Enterobacter cloace (21,7%), Ecserichia coli (17,4%), Staphylococcus epidermidis (13%), Candida albicans (13%). В единичных случаях встречались Staphylococcus aureus, Staphylococcus warneri, Streptococcus pneumonae, Staphylococcus haemoliticus, Klebbsiela pneumonia, Acinetobacter, Citrobacter youngae (4,3-8,7%) (таблица 44).
Наиболее часто выявляемые энтерококки являются представителями нормальной микрофлоры кишечника человека. Ряд авторов [116] высказывают предположение, что при заражении вирусом гриппа A/H1N1/09 происходило поражение эпителия пищеварительной трубки, вследствии чего происходила транслокация микроорганизмов кишечника в общий кровоток, что отличало вирусемию. Косвенно на такой механизм заражения указывают у некоторых симптомы поражения ЖКТ - рвота и диарея. При патоморфологическом исследовании выявлены густая лимфоидно-плазматическая инфильтрация стромы слизистой оболочки кишки, неравномерное кровенаполнение сосудов и стаз, некроз с десквамацией эпителия кишки на большом протяжении. Вероятнее всего, через поврежденный эпителий кишечника происходила транслокация бактерий в кровяносное русло, а затем в легкие.
Постоянно регистрировались изменения во внутренних органах: в печени, почках, сердце, поджелудочной железе и других органах - сущность которых состояла в поражении мелких артерий и артериол (утолщение стенок сосудов за счет плазматического эндотелия) с нарушением их проницаемости, а прилежащая паренхима подвергалась мелкоочаговым дегенеративным изменениям (рисунок 21,23).
Во всех наблюдениях выявлен отек головного мозга (рисунок 25, 26), макроскопически на разрезе ткань мозга была как бы «изъедена» молью. В 15 случаях (32%) обнаружены диапедезные кровоизлияния в белом веществе головного мозга, в 4 случаях (8,5%) — субарахноидальные симметричные очаговые кровоизлияния в лобно-теменных долях. При микроскопии во всех случаях отмечен выраженный периваскулярный и перицеллюлярный отек, кровоизлияния петехиального и мелкоочагового характера. Изменения нервных клеток в изученных отделах мозга носили мозаичный характер с признаками гидропической дистрофии, процесса вакуолизации, гиперхроматоза и укрупнением ядер. Значительно менее выраженные изменения отмечены в клетках глии. В мозговых оболочках воспалительные изменения носили, как правило, очаговый или мелкоочаговый характер. Сравнительно редко был выявлен очаговый глиоз в субэпендимарных отделах и глубоких слоях больших полушарий.
Геморрагический синдром различной степени выраженности был выявлен во всех случаях. Кровоизлияния в кожу наблюдались в 80% случаев, в висцеральной и париетальной плевре обнаружены в 82% случаях, в эндокарде левого желудочка сердца в 53%, в надпочечниках в 20%, в брюшине (рисунок 24), в эпикарде в 25%. Характерными проявлениями ДВС-синдрома в желудочно-кишечном тракте явились кровоизлияния в слизистую оболочку (рисунок 22), эрозии, острые язвы, отмеченные в 20 случаях (42,6%).
В 22 наблюдениях (46,8%) макро- и микроскопические изменения в органах были оценены как инфекционно-токсический шок.
При исследовании селезенки у 1А умерших отмечена гиперплазия, увеличение массы в 1,5 раза. В 20% случаях отмечены множественные инфаркты с явлениями организации и фибринозным периспленитом, вследствие тромбоза селезеночной вены. Выявленная в трех случаях локальная венозная обструкция портальных вен не вызвала острого снижения функции печени. При микроскопии в селезенке и лимфатических узлах в случаях с небольшой продолжительностью болезни отмечена гиперплазия лимфоидной ткани с некрозом реактивных центров, в синусах скопления макрофагов и сидерофагов, а в более поздние сроки - опустошение как В-, так и Т-зон с редукцией лимфоидных фолликулов.
Повреждения сердца, как правило, были представлены расстройствами кровообращения в виде субэпикардиальных кровоизлияний (рисунок 20). В 14 случаях (29,9%) диагностирован серозный миокардит.
Характеризуя гистологические изменения во внутренних органах, необходимо подчеркнуть, что своеобразным морфологическим критерием наличия инфекционного процесса являлись признаки эндотелиальной дисфункции/деструкции и васкулиты, которые, в зависимости от локализации, подразделялись на эндартерииты, мезартерииты и периартерииты.
При исследовании скелетной мускулатуры на фоне геморрагии выявлены вакуольная дистрофия миоцитов и миоцитолиз, а при исследовании почек в просвете канальцев отмечено скопление миоглобиновых цилиндров (миоглобинурийный нефроз). Учитывая эти изменения, а также прижизненное повышение в анализах крови соотношения АСТ/АЛТ, уровня КФК и ЛДГ, наиболее вероятно предположить наличие рабдомиолиза при тяжелом течении гриппозных пневмоний. В связи с этим представлялось интересным более детально изучить патоморфологические изменения в почках у умерших больных. С целью идентификации миоглобина в просветах канальцев почек был использован чувствительный и максимально селективный метод -иммуногистофенотипирование. Иммуногистохимическое исследование было выполнено с использованием парафиновых срезов паренхимы почек биотин-стрептавидиновым иммунопероксидазным методом с антителом к человеческому миоглобину (Rabbit Anti-Human Myoglobin Polyclonal Antibody) производства Spring Bioscienc (USA).
В результате данного исследования выявлено наличие миоглобина в просвете канальцев почек в 22 случаях (47%). Патоморфологические изменения при поражении почек миоглобином подобны острому канальцевому некрозу другой этиологии (рисунок 27, 28). Но патогномоничной особенностью явилось наличие в просвете капсул клубочков и канальцев белка миоглобина. Визуализировалась следующая картина пигментного нефроза: - неравномерное и слабое кровенаполнение сосудов стромы, капилляров клубочков; в просвете капсул многих клубочков гомогенные массы; - извитые канальцы многих клубочков расширены, в просветах зернистый детрит; - канальцевый эпителий с набухшей, слабо зернистой цитоплазмой; - в просветах многих канальцев слабо зернистые и достаточно гомогенные массы, давшие яркую реакцию с диаминобензидином (буро-рыжего цвета).
Также отмечалась очагово-диффузная инфильтрация стромы лейкоцитами, наличие скоплений лейкоцитов в просветах отдельных канальцев.
Таким образом, при анализе смертельных исходов при гриппе A/H1N1 в Забайкальском крае в 2009 году выявлена ассоциация с факторами риска, среди которых наиболее частыми оказались ожирение и ХОБЛ. У всех умерших обнаружены патоморфологические маркеры ОРДС на фоне диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, паренхиматозной дистрофии внутренних органов. По результатам иммуногистохимического исследования паренхимы почек в половине всех случаев выявлено наличие миоглобина в просвете канальцев, что подтверждает повреждение мышечной ткани при гриппе A/H1N1/09.
Выражаем благодарность заведующей кафедрой патологической анатомии, к.м.н. Чарторижской Наталье Николаевне и ассистенту кафедры патологической анатомии Сеппу Андрею Валентиновичу за оказанную помощь при выполнении работы над данной главой «Патологическая анатомия и анализ причин летальных исходов при гриппе A/H1N1/09».
