Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные взгляды на генетическую основу, патогенез, клиническую и морфологическую диагностику, терапию и прогноз множественной миеломы. поиск средств целенаправленной терапии (обзор литературы)
1.1 Общие сведения 16
1.2 Генетика и патофизиология множественной миеломы 21
1.3 Критерии диагностики, терапия и прогноз 47
1.4 Патологическая анатомия множественной миеломы 54
1.5 Вместо заключения: классификация и диагностика опухо лей, современные тенденции 67
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования
2.1 Морфологическое (и иммуногистохимическое) исследование 70
2.2 Исследование пролиферации, адгезии, миграции 79
2.3 Статистический анализ 94
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
3.1 Патологоанатомическое исследование костного мозга у больных множественной миеломой 95
3.2 Пролиферация миеломных клеток под действием цитокинов и основных ингибиторов сигнальных каскадов 125
3.3 Исследование адгезии миеломных клеток к внеклеточным белкам 135
3.4 Сравнительное исследование адгезии, стимулированной цитокинами и ионами марганца, роль синдекана-1 148
3.5 Исследование роли серглицина и остеопонтина в патогенезе миеломной болезни 162
3.6 Механизмы передачи сигнала, стимулирующего адгезию, от рецепторов цитокинов 173
3.7 Изучение миграции миеломных клеток под действием цитокинов 182
3.8 Изучение влияния низкомолекулярного ингибитора c-met
на пролиферацию, адгезию и миграцию миеломных клеток 193
ГЛАВА 4. Обсуждение собственных данных 201
Заключение 233
Выводы 235
Практические рекомендации 237
Список литературы
- Генетика и патофизиология множественной миеломы
- Вместо заключения: классификация и диагностика опухо лей, современные тенденции
- Исследование пролиферации, адгезии, миграции
- Пролиферация миеломных клеток под действием цитокинов и основных ингибиторов сигнальных каскадов
Введение к работе
Целесообразность любого научного исследования в медицине определяется в конечном итоге пользой для больного (непосредственной или в перспективе) - возможностью более точного диагноза и более эффективной' терапии. Сегодня, когда традиционная патология (патологическая анатомия) приобрела общие грани с фундаментальными биологическими дисциплинами - молекулярной и клеточной биологией и генетикой, и широко пользуется молекулярными методами в диагностике и определении прогноза многих-заболеваний, прежде всего, опухолей, стало возможным объединить возможности разных методов исследования для решения общих задач.
Изучение миеломной болезни было и остается одной из актуальных задач медицины. В предисловии к первой изданной в СССР монографии по миеломной болезни (Г.А. Алексеев и Н.Е.Андреева, 1966) выдающийся* гематолог акад. АМН СССР И.А.Кассирский писал: «Можно без преувеличения сказать, что за последние годы изучение миеломной болезни из частного вопроса гематологии переросло в общепатологическую проблему современной лейкозологии и даже онкологии». Эта мысль отражала скачок в понимании миеломной болезни, связанный с осознанием ее как опухоли из плазматических клеток, способных продуцировать аномальный белок -«биохимическую метку злокачественности», по терминологии И.А.Кассирского. Действительно, в 1953 г. был введен иммуноэлектрофо-рез, который сделал возможной точную идентификацию миеломных белков, а в 1956 L. Korngold и R. Lipari (фамилии авторов увековечены в обозначениях легких цепей иммуноглобулинов — к и X) обратили внимание на то, что протеины Вепсе-Jones и миеломные белки в сыворотке крови имеют отношение к нормальному сывороточному у-глобулину. Качественный скачок в терапии ММ относится к 60-м годам XX века. В 1953 г. в СССР был
синтезирован сарколизин, на основе которого получен мелфалан (алкеран). В 1958 г. впервые показан клинический эффект сарколизина у миеломных больных (акад. Н.Н.Блохин). В 1969 R. Alexanian продемонстрировал эффект сочетания мелфалана с преднизолоном - сочетания, ставшего классическим. Таким образом, успехи в изучении ММ в 50-60-е гг XX века не только позволили улучшить ее диагностику и лечение, но и открыли пути к пониманию ряда физиологических закономерностей развития В-клеточной лимфоидной популяции, а также, фундаментальных закономерностей онко-генеза.
Но в дальнейшем на протяжении 30 лет существенного прогресса в терапии ММ не было. Совершенствовались схемы химиотерапии, но проведенный в 1992 году мета-анализ (Gregory W.M. et al.) показал, что ни одна из схем не имеет преимущества над комбинацией мелфалан-преднизолон. Болезнь остается неизлечимой до настоящего времени. Современные высо-кодозные схемы с последующей трансплантацией костного мозга позволили увеличить выживаемость больных, но едва ли способны обеспечить длительную безрецидивную жизнь или излечение.
Поэтому сегодня мы осознаем миеломную болезнь как пример заболевания, проявляющего удивительное упорство и сопротивление современным методам терапии, а следовательно, использующего в своем развитии и прогрессировании еще неизвестные общебиологические закономерности. Таким образом, исследования множественной миеломы сохраняют актуальность и, как и 50 лет назад, могут служить решению ряда проблем общебиологического значения.
С точки зрения патологоанатомической, диагностика миеломы кажется рутинной процедурой, суть которой заключается в том, чтобы выявить очаги опухолевого роста в костном мозге и классифицировать опухолевые клетки как клетки с плазматической дифференцировкой. Но и здесь еще остаются вопросы. С уточнением диагностических критериев возника-
ет необходимость определения истинного количества плазматических клеток в костном мозге, их пролиферативного потенциала, черт фенотипа, которые могут иметь диагностическое и прогностическое значение.
С позиций общебиологических - множественная миелома представляет собой, пожалуй, наиболее яркий пример того, как злокачественная опухоль сохраняет чрезвычайную зависимость от сигналов, поступающих из микроокружения (в данном случае, костномозгового). Действительно, по современным представлениям, первичные онкогенные мутации В-клеток при ММ происходят в ходе рекомбинации в гене тяжелых цепей со сменой изотипа иммуноглобулина (т.е. на уровне постфолликулярной клетки в периферических лимфоидных органах (Tricot G., 2000)), после чего трансформированные клетки перемещаются в костный мозг (Hallek M.et al., 1998). Вплоть до последних стадий болезни костный мозг остается чуть ли не единственным местом их локализации (Алмазов В.А. и соавт., 1993), несмотря на циркуляцию в крови трансформированных клеток, способных к размножению. Однако такая зависимость миеломного клона от факторов микроокружения означает и его уязвимость. Можно надеяться, что исследования механизмов зависимости ММ от костномозгового микроокружения позволят разработать пути подавления этой зависимости и получить терапевтический результат.
В настоящем исследовании мы попытались еще раз проанализировать структуру опухоли с позиций патологоанатомической диагностики (на текущем материале за 1988-2003 гг), суммировать данные о фенотипе опухоли, а также изучить некоторые важнейшие стороны структуры и физиологии опухолевых клеток, в частности, пролиферацию, адгезию и миграцию, с применением как классических морфологических, так и ряда современных методик, которые позволяют действительно расширить понятие «структуры» в патологии до молекулярного уровня. Установление молекулярных механизмов пролиферации, адгезии и миграции миеломных кле-
ток является основой для разработки средств целенаправленной терапии заболевания.
Цель исследования: изучить патологическую анатомию ММ на материале трепанобиоптатов, изучить закономерности и механизмы пролиферации, миграции и адгезии миеломных клеток к матриксным белкам.
Задачи исследования
Проанализировать структуру опухоли с позиций патологоанато-мической диагностики, суммировать данные о фенотипе, изучить клеточный состав миеломного клона на материале трепанобиопсий. Изучить зависимость клеточного состава и ряда других параметров от клинической стадии ММ.
Установить зависимость пролиферативного индекса от клинической стадии ММ на материале трепанобиопсий. Изучить пролиферацию клеток миеломных клеточных линий, их чувствительность к важнейшим цитокинам и ингибиторам сигнальных каскадов.
Оценить экспрессию некоторых молекул адгезии на материале трепанобиопсий. Оценить экспрессию интегринов на клетках основных миеломных клеточных линий. На материале миеломных клеточных линий и клеток пациентов миеломной болезнью изучить способность миеломных клеток к адгезии к основным внеклеточным белкам, механизмы ее усиления и возможности подавления с помощью ингибиторов.
Охарактеризовать механизмы адгезии миеломных клеток к фибро-нектину при стимуляции цитокинами и двухвалентными катионами, уточнить роль интегринов и синдекана в адгезии миеломных клеток к матриксным белкам.
На модели миеломных клеточных линий и клетках пациентов ММ изучить роль фактора роста гепатоцитов (HGF) в биологии миеломных
клеток. Изучить возможность блокирования HGF-зависимых функций с помощью ингибитора рецептора HGF.
Изучить возможную роль остеопонтина и серглицина в патогенезе миеломной болезни. Исследовать продукцию их миеломными клетками и клетками стромы (остеопонтин). Изучить клеточную локализацию серглицина в миеломных клетках.
Проанализировать обнаруженные эффекты стимуляторов и ингибиторов пролиферации, адгезии и миграции с позиций поиска объектов для целенаправленной терапии.
Научная новизна
Впервые на материале трепанобиопсий проведено исследование клеточного состава миеломного клона с выделением четырех основных типов миеломных клеток (по J.E. Goasguen и соавт.), показаны различия в клеточном составе опухоли в зависимости от клинической фазы, подтверждена корреляция пролиферативного индекса с клинической стадией миеломы и клеточным составом.
Впервые в рамках одного исследования проведен скрининг 7 клеточных линий миеломы на предмет зависимости пролиферации от действия цитокинов и ингибиторов важнейших внутриклеточных сигнальных каскадов и на этом материале продемонстрирована крайняя гетерогенность молекулярной организации разных миеломных клонов.
Получены новые данные об ускорении пролиферации клеток миеломных линий при адгезии их к белкам матрикса. Впервые показано, что фактор роста гепатоцитов (HGF) является активным стимулятором адгезии и миграции миеломных клеток.
Впервые показано, что цитокин-стимулированная адгезия клеток миеломы к белкам матрикса требует участия синдекана, что приводит к колокализации синдекана и интегрина VLA-4.
Продемонстрировано, что ионы Мп стимулируют адгезию миеломных клеток к фибронектину. Это может иметь значение для фиксации миеломных клеток в зонах резорбции кости.
Впервые показано, что остепонтин может быть субстратом для адгезии миеломных клеток. Установлено, что клетки миеломных клеточных линий синтезируют и в большинстве своем секретируют серглицин. Серг-лицин на поверхности миеломных клеток может усиливать адгезию миеломных клеток к белкам матрикса.
Впервые на модели клеточной линии миеломных клеток INA-6 показано, что адгезия и миграция клеток критически зависит от активности фосфатидилинозитол-3 киназы (PI-3K), при этом сигнал не передается ни через комплекс АКТ, ни через mTOR. Миграция оказалась зависима не только от PI-3K, но и от митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК), что может служить теоретической основой для разработки новых лекарственных средств.
Таким образом, получены данные об особенностях регуляции пролиферации, адгезии и миграции миеломных клеток, обозначающие новые мишени для целенаправленной терапии множественной миеломы.
Практическая значимость
Критерии диагностики ММ включают количественные параметры -процентное содержание клеток с плазматической дифференцировкой в костном мозге. Подсчет количества клеток с плазматической дифференцировкой в препаратах трепанобиоптатов костного мозга, окрашенных различными красителями и с иммуногистохимической реакцией на CD 13 8, показал, что в препаратах с иммуногистохимической реакцией на CD 13 8 выявляется, в среднем, на 30% клеток больше, чем при использовании гистологических методик. Таким образом, рекомендация обязательного проведения иммуногистохимической реакции на CD 138 способ-
на существенно улучшить диагностику ММ. Особенно это касается наблюдений с малым (<10%) количеством клеток с плазмоцитарной диффе-ренцировкой, по данным обзорных исследований. Кроме того, в иммуно-гистохимических препаратах существенно легче оценить тип и распространенность поражения костного мозга при ММ.
В настоящем исследовании показано, что плазмобластный вариант ММ существенно отличается от остальных вариантов по критериям клеточного состава и индекса пролиферации. Это позволяет рассматривать его как самостоятельную форму болезни.
Новые данные об особенностях регуляции пролиферации, адгезии и миграции миеломных клеток имеют общебиологическое значение и уже учитываются при проведении дальнейших научных исследований по проблеме. Они позволяют лучше понять биологическую основу существования миеломных клонов. Кроме того, молекулярные механизмы поддержания пролиферации и выживания миеломных клонов могут рассматриваться как мишени для разработки средств целенаправленной терапии множественной миеломы.
Результаты работы используются в диагностике и преподавании патологической анатомии в Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования и Санкт-Петербургском городском патоло-гоанатомическом бюро.
Апробация работы
Апробация работы состоялась 11 декабря 2007 г. на совместном заседании кафедры патологической анатомии, кафедры гематологии, транс-фузиологии и трансплантологии, проблемной комиссии «Патология» и проблемной комиссии «Молекулярная медицина» Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова.
Материалы диссертации обсуждались на IX, X и XI международных конгрессах по множественной миеломе (Саламанка, Испания, 2003; Сидней, Австралия, 2005; Кос, Греция, 2007), 34-й Скандинавской конференции по гематологии (Рейкьявик, Исландия, 2003); Российско-норвежской конференции по гематологии (Санкт-Петербург, 2003); заседаниях Санкт-Петербургской ассоциации патологоанатомов (Санкт-Петербург, 2004, 2005), XX и XXI Европейском конгрессе патологов (Париж, Франция, 2005; Стамбул, Турция, 2007), IV Конференции Российских патологоанатомов «Новые методы и разработки в онкоморфологии», посвященной 100-летию со дня рождения Н.А.Краевского (Москва, 2005); Российско-американской конференции по гематологии (Санкт-Петербург, 2006); конференции с международным участием «Диагностика в медицине» (Хургада, Египет, 2007), Российско-норвежском рабочем совещании по гематологии (Санкт-Петербург, 2007), Российско-немецкой конференции по гематологии, посвященной 10-летию сотрудничества Санкт-Петербург-Гамбург (Гамбург, Германия, 2007), пленуме правления Российской ассоциации патологоанатомов (Омск, 2007).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Множественная миелома крайне неоднородна в отношении генетической основы, морфологических вариантов и стереотипов биологического поведения. По мере прогрессирования опухоли меняется клеточный состав, увеличивается количество сосудов и уменьшается количество Т-клеток. Множественная миелома характеризуется очень низкими показателями пролиферации, за исключением плазмобластного варианта. Плаз-мобластный вариант множественной миеломы необходимо рассматривать в качестве самостоятельной формы заболевания. Адгезия миеломных клеток к белкам матрикса приводит к ускорению пролиферации.
Адгезия и миграция миеломных клеток опосредуются интегрином VLA-4 (а4|31) и усиливаются при стимуляции цитокинами HGF, IGF-1 и SDF-la. Адгезия, кроме того, усиливается в присутствии ионов марганца. Усиление адгезии при стимуляции цитокинами и ионами марганца достигается различными механизмами. При стимуляции цитокинами происходит взаимодействие интегринов и синдекана на поверхности миеломных клеток с колокализацией их в активных сайтах мембраны; это не сопровождается увеличением аффинности интегринов. Усиление адгезии при стимуляции ионами марганца возникает за счет изменения кон-формации молекулы интегрина и не требует участия синдекана.
Фактор роста гепатоцитов (HGF) стимулирует пролиферацию, адгезию и миграцию миеломных клеток. В клеточных линиях и миеломных клетках пациентов существует аутокринный порочный круг, представленный HGF и его рецептором. Показана секреция HGF в культуре мезенхи-мальных стволовых клеток. Все эффекты HGF подавляются под действием ингибитора рецептора HGF - c-Met.
Цитокин-стимулированная адгезия и миграция клеток миеломы критически зависят от активности PI-3K и зависят от активности NF-kB. Миграция, кроме того, зависит от активности МАРК. Ингибирование mTOR, АКТ, протеинкиназы С, комплекса JAK2/STAT3 не оказывает влияния на адгезию и миграцию. Ключевые элементы сигнальных путей, регулирующие пролиферацию, адгезию и миграцию, могут быть мишенями целенаправленной терапии.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, собственные данные, обсуждение собственных данных), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной лите-
ратуры, содержащего 399 источников (28 - на русском и 371 - на иностранных языках). Текст иллюстрирован 16 таблицами и 79 рисунками.
Генетика и патофизиология множественной миеломы
Генетические аномалии обнаруживаются практически у всех больных MM (Zandecki М. et al., 1996). Причем у половины больных имеются дефекты четырех хромосом, а у 10% - дефекты 20 хромосом (Tricot G. et al., 1997). Но ни одна из известных генетических аберраций не встречается постоянно (или хотя бы у большей части больных). Генотип больных ММ классифицируют на гипердиплоидный и негипердиплоидный. Гипердиплоидный генотип характеризуется трисомиями преимущественно нечетных хромосом (кроме 13-й), а негипер диплоидный включает транслокации, большая часть которых происходит с участием гена тяжелых цепей иммуноглобулинов (IgH) на хромосоме 14 (q32). На обилие транслокаций в ло-кусе IgH впервые обратили внимание P.L. Bergsagel и соавт. (1996). Значение этих транслокаций в онкогенезе заключается в том, что мощные усиливающие последовательности (энхансеры) генов IgH оказываются в непосредственной близости к генам, контролирующим (прямо или косвенно) клеточный цикл, и вызывают их активацию. Партнером транслокации могут быть разные хромосомы - 11, 4, 16, 6, 8, 9, 18, 19 и др. (в порядке уменьшения частоты). Эти перестройки приводят к дисрегуляции генов, чаще всего — bcl-1 (cyclin Dl), FGFR3 (рецептора фактора роста фибробла-стов 3), протоонкогена c-Maf, а также генов, кодирующих другие регуля-торные белки. У части больных с негипердиплоидным геномом обнаруживается делеция хромосомы 13 (утрата антионкогена RBI) (Kastrinakis N.G. et al., 2000). Показано, что гипердиплоидный геном ассоциирован с большей выживаемостью, чем негипердиплоидный.
Многообразие генетических перестроек неизбежно приводит к необходимости генетической субклассификации ММ, что может быть основой для поиска средств целенаправленной терапии. В 2001 г. P.L. Bergsagel и W.M.Kuehl выделили 5 относительно изолированных групп ММ по характеру генетических дефектов (1. Без транслокации IgH-25%; 2. Транслокации с участием генов циклина D1 или D3- 25%; 3. Транслокации с участием гена рецептора 3 фактора роста фибробластов (FGFR3) - 15%; 4. Транслокации с участием c-maf or mafB -15%; 5. Другие транслокации -15%).
В дальнейшем (Bergsagel P.L. et al., 2003) было обнаружено, что вне зависимости от наличия транслокаций, непосредственно вовлекающих гены циклинов, практически во всех случаях ММ и MGUS имеются ано мально высокие уровни тРНК циклинов Dl, D2 и D3. В 2005 на X международном конгрессе по MM R. Fonseca и соавт. предложили классифицировать случаи с негипердиплоидным генотипом и транслокациями в локу-се 14q32 на три группы: а) транслокации, которые ведут к прямой стимуляции циклина D1 и/или D3 - t (11;14), t(6;14); б) транслокации, которые прямо или косвенно ведут к стимуляции циклина D2 - транслокации CCND2, а также t(4;14), t(14;16); и в) транслокации с участием других хромосом с неуточненными последствиями. Авторы полагают, что транслокации первой и второй групп - первичны на этапах онкогенеза и определяют дальнейшее направление генетических перестроек.
Таким образом, возможно, что в большинстве случаев ММ общим патогенетическим звеном является дисрегуляция циклинов D. Действительно, t(ll;14) и t(6,14) непосредственно касаются соответственно циклинов D1 и D3, t(14;16) и t(14;20), вовлекают maf-гены (maf и c-maf соответственно), продукты этих генов активируют циклин D2. Даже в опухолях, в которых не выявлена t(ll;14), наблюдается биаллельная гиперэкспрессия циклина D1. Это касается прежде всего гипердиплоидных опухолей. Во всех остальных опухолях, в т.ч. и при t(4,14), отмечается гиперэкспрессия циклина D2. Предложено классифицировать ММ на 7 групп по признакам типа транслокации и экспрессии циклинов (Bergsagel P.L. et al., 2005). Появляются первые оценки воспроизводимости клинико-лабораторных и прогностических параллелей в этих группах. Кроме того, можно ожидать активизации усилий в направлении поиска препаратов, способных ингибировать аномально высокие активности циклинов D в опухолевых клетках больных ММ. Недавно X. Huang и соавт. (2007) сообщили об успешном завершении экспериментальной фазы клинических испытаний низкомолекулярного ингибитора циклин-зависимых киназ 4/6.
Вместо заключения: классификация и диагностика опухо лей, современные тенденции
В классификации опухолей гемопоэтической и лимфоидной тканей Всемирной организации здравоохранения (2001) ММ рассматривается как неходжкинская В-клеточная лимфома из зрелых клеток. Эта классификация абсолютно преемственна по отношению к классификации REAL (1994) (и FAB, 1982 - для миелоидных опухолей). Так же как и REAL, она основана на определении фенотипа опухолевого клона и предполагает поиск нормального аналога опухолевых клеток (по морфологическим, иммунофенотипическим, генетическим, биохимическим критериям). Есть лишь одно, но фундаментальное отличие: в классификации ВОЗ отчетли во отражена современная тенденция классифицировать опухоли на основе характера генетических перестроек. В 2001 г. эта тенденция учтена в классификации хронических и острых миелопролиферативных заболеваний и при ряде лимфом (Tumors of..., 2001).
Основой классификации болезней, в том числе онкологических, является нозологический принцип. В то же время исследования последних десятилетий показывают, что в пределах одной нозологической формы опухоли у различных больных могут существенно отличаться по генетической основе и профилю регуляции. Прогресс молекулярной и клеточной биологии, молекулярной генетики позволил понять причины и основные закономерности развития опухолей и разработать концепцию целенаправленной ("targeted") терапии онкологических заболеваний. Эта концепция предполагает переход от использования цитотоксических препаратов широкого спектра действия к применению препаратов, влияющих на основной метаболический/ информационный узел опухолевой клетки, который обеспечивает неконтролируемый рост. Такой подход обладает целым рядом преимуществ. Но целенаправленная терапия возможна только в том случае, если известна мишень. Поэтому в современной онкологической практике задача диагностики уже не ограничивается установлением нозологической принадлежности опухоли, а включает и поиск такой мишени. Подробный диагноз является основой выбора лечебной тактики.
Лучшим примером целенаправленной терапии до настоящего времени остается терапия хронического миелолейкоза (ХМЛ) иматинибом и его производными - ингибиторами продукта химерного гена bcr-abl, образующегося при транслокации t(9;22)(q34;qll). Этот подход основан на универсальности указанной транслокации при ХМЛ и, соответственно, единичности мишени.
Появление в ближайшее время аналогичных препаратов для лечения ММ маловероятно. Причина этого - крайняя генетическая (и, следовательно, молекулярная) гетерогенность ММ.
Поэтому чрезвычайное значение в настоящее время приобретает генетическая (молекулярная) субклассификация ММ, т.е. изучение и выделение различных стереотипов структурной (молекулярной) организации и поведения опухоли, поиск уязвимых структурных, регуляторных и метаболических компонентов клонов ММ. Для решения этих задач патоло-гоанатомические (морфологические) исследования неизбежно интегрируются в систему комплексного изучения фундаментальных основ онко-генеза с привлечением методов молекулярной и клеточной биологии и генетики.
Настоящее исследование проводилось на материале трепанобиопта-тов пациентов с миеломной болезнью и подозрением на нее (в первичный материал вошло 350 наблюдений), а также клеток миеломных клеточных линий (INA-6, IH-1, ОН-2, ANBL-6, CAG, JJN-3, RPMI 6228 и U266), клеток линии Saos-2 остеосаркомы человека и линии мезенхимальных стволовых клеток человека (MSC). Кроме того, часть экспериментов проводили на материале миеломных клеток больных множественной миеломой. Для выделения миеломных клеток использовали материал диагностических пунктатов костного мозга больных миеломной болезнью, остающийся после проведения необходимых диагностических процедур. Проводили также исследования крови животных в экспериментальных моделях ММ, разработанных и описанных Н. Hjorth-Hansen и соавт. (1999а).
Исследование пролиферации, адгезии, миграции
Антитела, цитокины и др. реагенты Меченые фикоэритрином (РЕ) антитела к цепям интегринов: сс4 (CD49d), aL (CD1 la), aM (CD1 lb), аХ (CD1 lc), (31 (CD29), (32 (CD18) и (37 (CD61), aHTH-CD54 и анти-С056, контрольные антитела - мышиный IgGl и IgG2, нейтрализующие антитела - к а4 (CD49d) и pi (CD29), а также РЕ-конъюгированные антитела к активной изоформе CD29 (HUTS-21) — производства компании Pharmingen (Bedford, MA, США). Меченые флюоресцеина изотиоцианатом (FITC) - антитела к а5 (CD49e), av (CD51), контрольные мышиные антитела IgGl и IgG3 производства Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, США).
Для исследования экспрессии серглицина (проточная цитометрия, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия) использовали поли-клональные кроличьи антитела, полученные в InVitrogen (Oslo, Норвегия) путем иммунизации животных фрагментом пептида серглицина (25 аминокислотных остатков), коньюгированного с гемоцианином моллюска.
Для лазерной конфокальной микроскопии использовали меченые FITC антитела к а4 (CD49d) и меченые РЕ антитела к CD 138 производства Cymbus Biotechnology (Hampshire, Великобритания) и BD Biosciences (Bedford, MA, США) соответственно. Использовали также холерный токсин (В), конъюгированный с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 633 (Molecular Probes, Eugene, OR, США).
Коллаген плаценты человека IV, фибронектин плазмы, ламинин и витронектин производства BD Biosciences (Bedford, MA, США). Коллаген I производства Sigma Cell Culture (St. Louis, МО, США) , VCAM-1 производства R&D Systems (Abingdon, Великобритания). Гепаритиназа и хондроитиназа ABC получены из Seikagaku Corporation (Tokyo, Япония), гепарин - из Leo Pharma (Barellup, Дания).
Ингибиторы: ингибитор рецептора HGF c-Met - SU- 011274/ РНА-665752 (SUGEN, San Francisco, СА, США), ингибитор G-белков коклюшный токсин, ингибитор Jak2/Stat3 — AG 490, ингибитор mTOR рапамицин и ингибитор PI-3K вортманнин (Sigma, St Louis, МО, США), ингибиторы протеинкиназы С Ro 31-8220 и бис-индолилмалеимид (Bis-І), ингибитор PI-3K LY294002, ингибиторы МАРК PD98059 и U0126 (LC Laboratories, San Diego, СА, США), ингибиторы АКТ - SH-5 и SH-6 (Calbiochem, La Jolla, СА, США), ингибитор протеасом бортезомиб и ингибитор NF-KB PS-1145 (любезно предоставлены Millenium Pharmaceuticals, Cambridge, MA, США).
Ингибитор рецептора HGF c-Met РНА-665752 имеет формулу (3Z)-5-[(2,6-диxлopoбeнзил)cyльфoнил]-3-[(3,5-димeтил-4-{[(2R)-2-(пирролидин-1 -илметил)пирролидин-1 -ил] карбонил } -1 Н-пиррол-2-ил)метилен]-1,3-дигидро-2Н-индол-2-он, это соединение было синтезировано SUGEN, Inc и подробно описано J. G. Christensen и соавт. (2003).
Для стимуляции клеток использовали ряд цитокинов/хемокинов: ре-комбинантный человеческий IGF-1 производства R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, США), IL-6 производства Biosourse (Camarillio, СА, США), SDF-la производства Peprotech (London, Великобритания), стимулятор РКС форбол 12-миристат 13-ацетат (РМА) производства Sigma-Aldrich (Oslo, Норвегия). HGF был получен и очищен в лаборатории Института молекулярной медицины и исследования рака (Trondheim, Норвегия) (Вог-setM. etal., 1996).
В предварительных экспериментах использовали также морфогене-тический протеин кости-7 (ВМР-7), эпидермальный фактор роста (EGF), интерлейкин-ір (IL-lp), IL10, IL-15, интерферон-у (INF- у) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), - все производства R&D Systems Inc. (Minnea polis, MN, США). IL-21 был любезно предоставлен R. Holly, Zymo Genetics (Seattle, WA, США) а фактор некроза опухолей-а (TNFa) был получен из Genentech (South San Francisco, CA, США).
Все перечисленные вещества разводились до конечной концентрации в среде RPMI-1640 (Gibko, Paisley, UK) с добавлением L-глутамина (2mM) и гентамицина (40ig/mL) (далее в тексте - RPMI).
Клеточные культуры
Большинство экспериментов проводили с использованием линии IL-6-зависимых неадгезивных миеломных клеток человека INA-6, любезно предоставленной д-ром М. Gramazki (университет Эрланген-Нюремберг, Германия). Клетки культивировали в среде RPMI с добавлением IL-6 (1 ng/mL) и 10% телячьей сыворотки (FCS), инактивированной нагреванием. В инкубаторе с 5% СОг поддерживали температуру 37 С. Среду обновляли дважды в неделю.
В части экспериментов в дополнение к INA-6 исследовали клетки еще 7 клеточных линий — четырех IL-6-независимых и трех IL-6-зависимых. IL-6-независимые клеточные линии RPMI-8226 и U266 были получены из Американской коллекции клеточных культур, (American Туре Culture Collection, Manassas, VA, США). Клетки С AG были любезно предоставлены д-ром Joshua Epstein (Университет Арканзаса, Little Rock, AR, США), а линия JJN-3 - д-ром J. Ball (Университет Бирмингема, Великобритания). IL-6-зависимые линии включали ANBL-6, ОН-2 и IH-1. ANBL-6 была любезно предоставлена д-ром D. Jelinek (Клиника Мэйо, Rochester, MN, США). ОН-2 и Ш-1 были получены в лаборатории Института молекулярной биологии и исследования рака (Тронхейм, Норвегия) (Borset М. et al., 1994; Hjertner О. et al., 2001). Клетки культивировали в среде RPMI. IL-6 добавляли в среду для IL-6-зависимых линий (1 ng/mL для ANBL-6 и 2 ng/mL для IH-1 и ОН-2). Инактивированная нагреванием эмбриональная
Пролиферация миеломных клеток под действием цитокинов и основных ингибиторов сигнальных каскадов
Для стимуляции клеток использовали цитокины IL-6, IL-10, IL-15, IL-21,HGF,IGF-lHTNFa.
Использовали следующие ингибиторы основных внутриклеточных механизмов передачи сигналов: ингибитор Jak2/Stat3 - AG 490, ингибитор mTOR - рапамицин, ингибитор PI-3K - LY294002, ингибиторы МАРК -PD98059 и U0126, ингибитор NF-кВ PS-1145 и ингибитор протеасом бортезомиб (PS-341). Максимальные концентрации указанных веществ составляли: AG490 - 9 иМ, рапамицин - 4 ng/mL, U0126 - 7 цМ, PD98059 -40 цМ, LY2940002 - 10 цМ, PS1145 - 10 дМ и бортезомиб - 15 пМ. Точка приложения использованных ингибиторов показана на рис. 31. Указанные концентрации достигались стадийно с исследованием 3-4 промежуточных точек с более низкой концентрацией ингибиторов. Выбор концентрации осуществлялся на основе литературных сведений и собственного опыта. Пролиферацию оценивали по включению [ Н]-тимидина.
Показатели цитокин-зависимой пролиферации цитокин зависимых миеломных линий INA-6, Ш-1 и ОН-2 и подавления стимулированной пролиферации ингибиторами сигнальных молекул показаны в таблице 14. Исследованные цитокины вызывали усиление пролиферации во всех изученных клеточных линиях, но в различной степени. Наиболее универсален был IL-6, ускоряя пролиферацию клеток всех трех линий в 7-15 раз. Клетки IH-1 были высоко чувствительны к IGF-la (пролиферация увеличивалась в 10 раз), а клетки ОН-2 — к TNFa и IL-21 (в 8 и раз соответственно). Стимулирующий пролиферацию эффект цитокинов подавлялся при действии большинства изученных ингибиторов. Степень подавления варьировала от полной блокады эффектов цитокина (в таблице обозначено «+» ) до частичного, но с сохранением не более 50% эффекта. Некоторые цитокины придавали определенным клеточным линиям известную «защищенность» от действия ингибиторов. Так, почти все изученные ингибиторы в использованных концентрациях не могли полностью преодолеть эффект стимуляции клеток INA-6 интерлейкином-6, клеток
ІН-1 г интерлейкином 15 и клеток ОН-2 - интерлейкином-21 и фактором некроза опухолей а. Ингибитор ІкВ (и таким образом, NFKB) PS 1145 лишь в половине случаев полностью преодолевал эффект цитокинов. В остальных ситуациях наблюдался умеренный эффект, при стимуляции клеток ОН-2 IGF-la эффекта PS 1145 не было, а при стимуляции этой же линии HGF под действием данного ингибитора наблюдали ускорение пролиферации в 2 раза.
Изменение нестимулированной пролиферации цитокин зависимых и цитокин-независимых клеточных линий под действием ингибиторов сигнальных молекул показано на рис. 32.
Действие ингибиторов основных сигнальных путей приводило к неодинаковому подавлению пролиферации изученных клеточных линий. Не-стимулированная пролиферация цитокин-зависимых линий подавлялась обычно более эффективно и меньшими концентрациями ингибиторов. Однако отдельные цитокин-независимые клеточные линии оказались весьма чувствительны к ряду ингибиторов. Так, AG490 практически полностью подавлял пролиферацию JJN-3; LY2940002 и рапамицин при этом никак не влияли на пролиферацию JJN-3, но значительно ограничивали пролиферацию RPMI 8226 и U266 соответственно.
Изменение нестимулированной и стимулированной пролиферации некоторых цитокин-зависимых и цитокин-независимых клеточных линий под действием ингибитора протеасом бортезомиба (PS-341) показано на рис. 33.
Бортезомиб вызывал полное подавление пролиферации цитокин-зависимых линий (IH-1 и ОН-2) вне зависимости от стимуляции цитокина-ми. Можно отметить, что подавление пролиферации ОН-2 наступало в одинаковой степени при стимуляции TNF и IL-6. Учитывая, что IL-6 не приводит к стимуляции NFKB В ЭТИХ клетках (Borset М, 1999), можно полагать, что эффект бортезомиба связан не только с подавлением NFKB. Полное подавление пролиферации обнаружено и при исследовании цитокин независимой линии RPMI 8226. Эффект достигался при несколько больших (по сравнению с необходимыми для подавления IH-1 и ОН-2) дозах. Ни один из исследованных цитокинов не мог предотвратить данный эффект препарата.
Полученные данные свидетельствуют о том, что как цитокин-зивисимые, так и цитокин-независимые клеточные линии характеризуются различной чувствительностью к стимуляторам и ингибиторам сигнальных каскадов. Универсальным стимулятором пролиферации цитокин-зависимых клеточных линий является IL-6, но ускорение пролиферации отдельных клеточных линий в 5 и более раз наблюдали также в присутствии IL-10, IL-15, IL-21, IGF-1 и TNFa.
Под действием ингибиторов внутриклеточных сигнальных каскадов - JAK2/STAT3, PI-3K, АКТ, mTOR, МАРК и NFicB/протеасом наблюдали торможение пролиферации, выраженное в различной степени в изученных клеточных линиях. Парадоксальный эффект наблюдали при ингибирова-ниии 1кВ (и, следовательно, NFKB) В клетках ОН-2 - нестимулированная пролиферация возрастала в 3 раза, а стимулированная HGF - в два. Ингибитор протеасом PS-341 (бортезомиб) оказался наиболее универсальным блокатором пролиферации миеломных клеток.
![Ультрамикроскопическое исследование посттравматической регенерации периферического нерва в условиях пластики аллотрансплантатом в эксперименте [Электронный ресурс]](/i/i/4255/186414.png "Ультрамикроскопическое исследование посттравматической регенерации периферического нерва в условиях пластики аллотрансплантатом в эксперименте [Электронный ресурс] Ибрагимов Шамиль Искандерович")
![Патоморфологические изменения головного мозга при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4314/192218.png "Патоморфологические изменения головного мозга при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс] Белик Татьяна Анатольевна")
![Клинико-морфологическое исследование гастродуоденальной зоны при бронхиальной астме [Электронный ресурс]](/i/i/4471/187413.png "Клинико-морфологическое исследование гастродуоденальной зоны при бронхиальной астме [Электронный ресурс] Корабельников Даниил Иванович")
![Морфофункциональные изменения головного мозга при патологии щитовидной железы в условиях макро- и микроэлементозов (клинико-нейропсихологическое и экспериментальное исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4290/181440.png "Морфофункциональные изменения головного мозга при патологии щитовидной железы в условиях макро- и микроэлементозов (клинико-нейропсихологическое и экспериментальное исследование) [Электронный ресурс] Павлова Любовь Арнольдовна")