Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1.1. Общие представления о наследственном панкреатите история открытия 10
1.2. Наследственный панкреатит, обусловленный мутациями гена катионического трипсиногена (PRSS1) 16
1.3. Мутации гена панкреатического секреторного ингибитора трипсина 26
1.4. Мутации гена трансмембранного регулятора кистозного фиброза (CFTR) 40
1.5. Мутации в гене анионического трипсиногена 46
1.6. Мутации генов кератинов (К8) 47
1.7. Мутации гена химотрипсина С (CTRC) 48
1.8. Мутации гена кальций-чувствительного рецептора (CASR) 55
1.9. Мутации гена 1-антитрипсина 56
1.10. Особенности клинической картины и диагностики 59
наследственного панкреатита 59
1.11. Принципы терапии наследственного панкреатита 62
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 67
2.1. Дизайн исследования 67
2.2. Методы исследования 71
2.3. Краткая характеристика больных 84
ГЛАВА III. Клинико-лабораторные данные больных хроническим панкреатитом различной этиологии 87
3.1. Клиническая картина обследованных больных 87
3.2. Данные лабораторного и инструментального обследования у больных хроническим панкреатитом 93
3.3. Оценка стадии и тяжести хронического панкреатита 99
3.4. Ответ на фармакотерапию 100
ГЛАВА IV. Результаты молекулярно-генетического тестирования обследованных больных хроническим панкреатитом 105
4.1. Результаты тестирования мутаций в гене CFTR 105
4.2. Результаты идентификации мутации N34S (AAT AGT) в гене SPINK1 106
4.3. Результаты тестирования мутаций в гене PRSS1 108
4.4. Оценка прогноза хронического панкреатита в зависимости от 108
результатов генетического тестирования 108
Обсуждение полученных результатов 113
Выводы 130
Практические рекомендации 132
Список сокращений 133
Список литературы 134
- Мутации гена панкреатического секреторного ингибитора трипсина
- Методы исследования
- Данные лабораторного и инструментального обследования у больных хроническим панкреатитом
- Результаты идентификации мутации N34S (AAT AGT) в гене SPINK1
Введение к работе
Актуальность проблемы
Хронический панкреатит (ХП) – воспалительное заболевание поджелудочной железы (ПЖ), характеризующееся длительным прогрессирующим течением с развитием необратимых морфологических изменений паренхимы и протоковой системы (Буклис Э.Р., Ивашкин В.Т., 2006). В настоящее время ХП является относительно частым заболеванием, ведущим к временной нетрудоспособности, а в дальнейшем – и к инвалидизации, что делает ХП важной социальной и экономической проблемой современной медицины (Маев И.В. и соавт., 2005).
ХП можно охарактеризовать как полиэтиологическое и полипатогенетическое заболевание. К этиологическим факторам, вызывающим ХП, относится в первую очередь злоупотребление алкоголем, курение, патология билиарного тракта и наследственные факторы (Калинин А.В., 2006; Маев И.В., Кучерявый Ю.А., 2008).
Наследственный панкреатит (НП) в течение многих десятилетий оставался редчайшей патологией ПЖ, и только применение генетических исследований в середине 90-х годов прошлого века позволило выявить тип мутаций и классифицировать НП (Охлобыстин А.В., 1999; Lerch M.M., et al., 2010; Pitchumoni C.S., 1998; Whitcomb D.C., et al.,1996). На сегодняшний день НП является достаточно широкой и негомогенной нозологической формой, поскольку помимо предполагаемой ранее и определенной первой доминантной мутации (ген катионического трипсиногена – PRSS1), было выявлено множество рецессивных мутаций, а также полиморфизм различных генов, предрасполагающие к развитию ХП (Braganza J.M., et al., 2011; Derikx M.H., Drenth J.P., 2010). Данные проведенных клинических исследований демонстрируют особенности клинического течения и диагностические признаки различных подтипов НП, различающихся генетическими дефектами и типом наследования (Keim V., et al., 2001; Teich N., et al., 1998; Whit-comb D.С. et аl.,1996).
Мутации в генах SPINK1, PRSS1, CFTR обнаруживаются с относительно
высокой частотой у больных НП, например, в гене CFTR - 13,4-37,0%, в гене SPINK1- 20,0-23,0%, что в 2,7-7,4 раза превышает частоту носительства мутаций в данных генах у здорового населения (Keim V., et al., 2001; Lerch M.M., et al., 2010). Данные генетические изменения могут самостоятельно определить развитие ХП или быть фактором риска. Так, вероятность развития алкогольного ХП у пациента с мутацией R122H в гене PRSS1 превышает 40% (Маев И.В., Кучерявый Ю.А., 2008).
Детальных крупномасштабных исследований, посвященных тонким аспектам анализа генетических изменений, приводящих или предрасполагающих к развитию ХП, к настоящему моменту в Российской Федерации не проведено. Понимание генетических механизмов позволит предотвращать фенотипическое выражение НП у людей с генетической предрасположенностью, понять этиологию панкреатогенного рака, и возможно, выработать новые подходы к лечению и профилактике НП.
Цель исследования
Целью настоящей работы является изучение клинико-генетических особенностей течения различных форм хронического панкреатита (токсического, били-арнозависимого, идиопатического и смешанного) у взрослых пациентов и определение значения мутаций в генах SPINK1, PRSS1, CFTR в развитии и прогрессиро-вании хронического панкреатита.
Задачи исследования
-
Провести анализ клинических особенностей (возраст манифестации, частота осложнений, тяжесть течения, темпы прогрессирования, степень эндокринной и экзокринной недостаточности) у больных с различными формами панкреатита.
-
Осуществить поиск мутаций в генах CFTR, SPINK1, PRSS1 при различных хронических формах панкреатита у взрослых пациентов.
-
Выявить спектр наиболее часто встречающихся в российской популяции мутаций в генах CFTR, PRSS1, SPINK1 у больных с различными формами пан-
креатита (идиопатический, билиарнозависимый, токсический, смешанный).
4) Изучить особенности течения заболевания, провести оценку прогноза у больных с наличием мутации в генах CFTR, SPINK1, PRSS1.
Научная новизна
Впервые в рамках одномоментного исследования с контролем проведен генетический скрининг пациентов с хроническим панкреатитом. Впервые определена частота носительства мутаций в генах CFTR, SPINK1, PRSS1 при различных хронических формах панкреатита у взрослых пациентов в российской популяции. Впервые выявлены наиболее часто встречающиеся мутации в генах CFTR и SPINK1 у россиян с различными формами панкреатита (идиопатический, билиар-нозависимый, токсический, смешанный). Впервые изучены особенности течения ХП, эффективности терапии, прогноза, возможные сочетанные факторы риска у больных с наличием мутации N34S в гене SPINK1.
Практическая значимость
У больных ХП различной этиологии достоверно часто относительно здоровых лиц встречается мутация гена SPINK1 N34S, определяя более высокий риск структурных изменений поджелудочной железы, определяя более высокий риск осложнений хронического панкреатита, и являясь неблагоприятным прогностическим фактором ответа на проводимое лечение. Мутация N34S нередко встречается у лиц без панкреатита, что предполагает ее действие в качестве модификатора болезни, определяя повышенный риск хронического панкреатита и более тяжелого его течения у больных с прочими факторами риска – билиарной патологией, курением, алкоголизмом и др. Широкая встречаемость мутации N34S при увеличивающейся доступности генетических методов исследования позволит выделить пациентов в ХП, гомозиготных носителей этой мутации, характеризующихся менее благоприятным прогнозом и повышенным риском осложнений.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Между билиарнозависимой и идиопатической формами хронического панкреатита имеются наибольшие различия по длительности анамнеза, возрасту клинической манифестации, особенностям клинических проявлений, морфологическим изменениям в паренхиме и протоковой системе поджелудочной железы, ответу на консервативное лечение, наличию осложнений и исходов
-
Для идиопатического панкреатита характерны наибольшая длительность анамнеза, наименьший возраст клинической манифестации, наиболее тяжелые клинические проявления, наибольшая частота осложнений, наименее выраженный ответ на комбинированную фармакотерапию, максимальная необходимость в эндоскопических и хирургических подходах в коррекции боли и функциональных нарушений поджелудочной железы.
-
У больных хроническим панкреатитом отмечена редкая встречаемость мутаций гена трансмембранного регулятора кистозного фиброза, отсутствие гомозиготных носителей в данной мутации, а также отсутствие мутаций гена катио-нического трипсиногена, что свидетельствует об отсутствии вклада этих мутаций в патогенез хронического панкреатита у смешанного российского населения.
-
Частота гомо- и гетерозиготных мутаций N34S гена панкреатического секреторного ингибитора трипсина встречается достоверно чаще у больных хроническим панкреатитом (9,2% и 5,4%), чем у здоровых лиц (2,8% и 0,9%), что предполагает значительную роль данных генетических изменений в развитии хронического панкреатита.
-
У больных панкреатитом билиарной и смешанной этиологии частота регистрации мутации N34S в гене SPINK1 совпадает с таковой в контроле, отсутствуют случаи гомозиготного носительства мутации, что предполагает доминирование билиарных механизмов в патогенезе этих форм хронического панкреатита.
-
Наибольшая частота регистрации мутации N34S гена панкреатического секреторного ингибитора трипсина отмечена у больных идиопатическим панкреатитом относительно всех прочих этиологических форм, что предполагает значимую роль мутаций гена панкреатического ингибитора трипсина в патогенезе этих
форм хронического панкреатита у россиян.
-
Наличие мутации N34S определяет ускорение прогрессии хронического панкреатита, определяет более раннее развитие заболевания, большую вероятность выраженных структурных изменений в паренхиме и протоковой системе поджелудочной железы и развития осложнений, увеличивает риск тяжелого течения и худшего ответа на консервативное лечение.
-
Наличие мутации N34S определяет низкий риск развития хронического панкреатита без учета этиологии (ОШ 1,55), умеренный риск токсического хронического панкреатита (ОШ 2,19), высокий риск идиопатического хронического панкреатита (ОШ 4,62).
Реализация и внедрение полученных результатов
Результаты работы внедрены в клиническую практику гастроэнтерологического, терапевтического и 1 хирургического отделений ЦКБ №2 им. Н.А. Семашко ОАО «РЖД», терапевтических отделений Клиники ГБУЗ городской киниче-ской больницы № 40. Результаты исследования внедрены в педагогическую практику кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России и используются преподавателями кафедры на теоретических занятиях со студентами II-IV курсов лечебного факультета, клиническими интернами, ординаторами и аспирантами кафедры, курсантами цикла ФПДО и ФПКП, в лекционном материале и методических рекомендациях.
Апробация работы
Материалы исследования доложены на Шестнадцатой и Семнадцатой Российской гастроэнтерологической неделе (Москва 2010; 2011), XI съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2011 г.), XI Восточно-сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием «Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения» (г. Иркутск, 2011), на XIII Славяно-Балтийском научном форуме «СПб-Гастро-2011» (Санкт-Петербург, 2011).
Апробация состоялась 17 апреля 2013 года на совместном заседании кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии и кафедры госпитальной терапии №1 ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Минздрава России
Публикации
Опубликовано восемь печатных работ, в том числе четыре работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Личное участие автора в получение научных результатов
Автором лично было обследовано 240 пациентов с различными этиологическими формами хронического панкреатита и 107 здоровых лиц. В ходе подготовки к выполнению диссертационной работы были освоены методики экстракции ДНК из лейкоцитов периферической крови, секвенирования и проведения первичной ПЦР. Проведена статистическая обработка и анализ полученных результатов. Подготовлены выводы и практические рекомендации.
Структура и объем диссертации
Мутации гена панкреатического секреторного ингибитора трипсина
Согласно современным представлениям хронический панкреатит (ХП) – это группа заболеваний поджелудочной железы (ПЖ) различной этиологии, характеризующаяся вариабельной воспалительной инфильтрацией мезенхимальны-ми клетками паренхимы и протоков органа; итогом длительного персистирования такого воспаления является развитие необратимых изменений экстрацеллюлярно-го матрикса и фиброза [80,154].
В течение многих десятилетий ХП расценивался как достаточно однородное и, как правило, неизлечимое заболевание, наиболее часто встречающееся в районах с низким уровнем дохода на душу населения, который определенно влияет на качество продуктов питания и частоту злоупотребления алкоголем и табакокурением. Крупные клинические исследования последних десятилетий доказали, что подобное представление является ошибочным и в определенной мере дискриминационным, а если глубже изучить историю панкреатологии, то даже и не основанным на реальных фактах [167,195].Фиброз ПЖ с развитием функциональной панкреатической недостаточности при ХП, исходя из современных представлений, является исходом широкого диапазона экзогенных (экологических, инфекционных, нутритивных, токсических) и эндогенных (генетических, воспалительных) изменений, совокупность которых и приводит с вариабельным вкладом разных составляющих к развитию заболевания у конкретного индивидуума [44,81]. Подобный подход в понимании танатогенеза ХП поддерживается большинством современных экспертов в области панкреатологии и отражен в современных классификационных системах этого заболевания [223].
Именно наличием генетических изменений и объясняется развитие многих случаев панкреатита, его тяжести и осложнений. Следуя генетической теории развития и прогрессирования ХП, становится понятно, почему у одних лиц, длительное время злоупотребляющих алкоголем, развивается ХП, а у других – нет. Различные генные мутации и полиморфизмы, вероятно, определяют восприимчивость человека к развитию ХП, как правило, за счет ослабления протективных механизмов ПЖ [80]. Лавинообразное увеличение числа вновь открытых мутаций, появляющихся в периодической печати ежегодно, свидетельствует, что до сих пор открыта только меньшая часть возможных генетических изменений, приводящих к развитию ХП [65,154]. Поэтому, канонической стала точка зрения, что если диагноз наследственный панкреатит (НП) предполагается согласно особенностям клинического течения и семейному анамнезу, а генетический скрининг не выявляет конкретной мутации, то это не исключает диагноз НП [17].
Менее десятилетия тому назад мы определяли наследственный панкреатит как редкую патологию ПЖ, клинически проявляющийся частыми эпизодами острого панкреатита (ОП) в виде болевого абдоминального и диспепсического синдромов, характеризующийся постепенным увеличением частоты рецидивов, прогрессирующим снижением функции (экзокринной и/или эндокринной) железы, отягощённой наследственностью, высоким риском рака ПЖ [11,16]. Сегодня мы вынуждены признать, что широкий спектр возможных ассоциаций генотипа/фенотипа НП колеблется от прямых аутосомных доминирующих черт заболевания с почти полной пенетрантностью (доминантные мутации гена катиониче-ского трипсиногена - PRSS1) через мягкие генетические факторы риска без признаков менделевского наследования (мутации генов SPINK1 и CFTR) к очень тонким наследственным модификаторам болезни, которые могут только быть идентифицированы в очень крупных исследованиях (мутации генов химотрипсина С, анионического трипсиногена и др.) [154,254].
Таким образом, идентификация мутаций различных генов, в частности гена катионического (PRSS1) и анионического трипсиногена (PRSS2), генов панкреатического секреторного ингибитора трипсина (PSTI или SPINK1), кератинов и др. привела к изменению представлений о патофизиологии ХП, в некоторой степени определяя значимость влияния факторов окружающей среды на степень пенетрации НП, на выраженность клинической симптоматики и возраст начала заболевания [31,99,122].
Переходя к новым открытиям в патофизиологии НП нельзя не отметить ряд важнейших и любопытных фактов, ставших сейчас уже историей панкреатоло-гии. НП был впервые описан в клинике Мейо в Миннесоте в 1952 году M.W. Comfort и A.G. Steinberg, которые впервые предположили возможный генетический дефект в качестве причины ХП [72]. Наблюдая за семьей с 4 установленными и 2 предполагаемыми случаями рецидивирующего с раннего детства течения ХП, авторами было отмечено, что заболевание имеет аутосомно-доминантный тип наследования с неполной пенетрантностью в пределах 80%. Продолжающиеся исследования в клинике Мейо в течение последующего десятилетия выявили еще 4 семьи с похожими изменениями [102,103,104]. Любопытным фактом наблюдений явилось обнаружение аминоацидурии у членов 4-х семей из 5-ти наблюдаемых в 1962 году [104]. В том же году свет увидела первая публикация, посвященная наблюдению семьи с НП, за пределами клиники Мейо [73]. Авторы описали французскую семью из Нанта, характеризующуюся схожими признаками по сравнению с ранее изученными американскими наблюдениями. Следующее описание очередной семьи с НП вновь последовало из-за океана [97], ознаменовав, пожалуй, закат «первой волны» научных работ, посвященных описанию отдельных семей. Оживленный интерес в научных кругах к проблеме НП поспособствовал тому, что в дальнейшем свет увидели работы, включающие уже десятки семей и сотни наблюдений во всех регионах мира [68,119,164,173,228].
Безусловно, на тот период времени патогенез заболевания не мог быть не расшифрован. Именно в относительно более поздних работах с описанием серий случаев семейных панкреатитов обнаруживались те или иные часто встречаемые находки и выдвигались гипотезы патогенеза. Как правило, атаки панкреатита характеризовались повторными эпизодами выраженного болевого абдоминального синдрома в сочетании с повышением амилазы в сыворотке крови, а иногда и лихорадкой. В связи с отсутствием в те годы мощной диагностической базы, прежде всего методик визуализации, дифференциальный диагноз с семейной средиземноморской лихорадкой (периодическая болезнь) проводился только на основании имеющейся у ряда больных гиперамилаземии [50]. Что интересно, и у здоровых родственников больных, страдающих болевыми приступами, была случайно выявлена гиперамилазурия. В дальнейшем было определено, что эта особенность характерна и для других семей, члены которых страдали рецидивирующим ХП с раннего возраста [77].
В 1972 г.R.McElroy и P.Christiansen описали семью, где 10 человек имели ярко выраженные клинические признаки ХП, а ещё у 16 обследованных имелись отдельные признаки, указывающие на возможность наличия заболевания. Кроме того, авторы указали высокую частоту развития тромбоза селезеночной и воротной вен в данной семье [164], что косвенно свидетельствует о рецидивирующем течении НП, вероятно в виде атак ОП.
Методы исследования
Муковисцидоз (синдром Ландштейна-Фанкони-Андерсена, кистозный фиброз) – самое распространенное врожденное заболевание ПЖ, которое обуслов-ленно мутацией гена трансмембранного регулятора кистозного фиброза (CFTR). Ген CFTR изолирован в 1989 году и включает 230 кбаз, содержит 27 экзонов и охватывает около 250000 пар нуклеотидов, расположенных в середине длинного плеча 7-й хромосомы (7q35). В настоящее время идентифицировано более 1800 мутаций данного гена, ответственных за развития симптомов муковисцидоза [9, 75,259].
Бессимптомное носительства аномального гена CFTR в популяции составляет около 3%. Все мутации определяют аутосомно-рецессивный тип наследования болезни. Согласно законам менделевского наследования, у родителей, гетерозиготных по гену CFTR, риск рождения ребенка, гомозиготного по аномальному гену CFTR и больного муковисцидозом, составляет 25% и не зависит от последующих генераций [267].
В последние годы расшифрован патогенез муковисцидоза. Удалось определить, что трансмембранный регулятор кистозного фиброза представляет собой ре-гуляторный белок, расположенный в клеточных мембранах. Он состоит из 1480 аминокислот и обеспечивает регуляцию Cl-каналов клетки [9]. Белок CFTR состоит из 2 мембранных субъединиц, каждая из которых включает 6 фиксированных на мембране сегментов, 2 нуклеотид связывающих субъединицы и цитоплаз-менной регуляторной субъединицы с центрами для фосфорилирования цАМФ-зависимой протеинкиназы А [18].
В результате фосфорилирования и присоединения к нуклеотид связывающим субъединицам CFTR двух молекул АТФ, белок меняет свою кон-формацию, открывая Cl-каналы клетки. CFTR локализуется преимущественно в апикальных мембранах эпителиоцитов интралобулярных протоков экзокринных желез, и в результате своей активации обеспечивает цАМФ-зависимый транспорт ионов Cl- из клетки в просвет протоков [9,18].
Следом за транспортом ионов Cl- в просвет канальцев осуществляется пассивная диффузия катионов натрия и воды, активный транспорт ионов натрия посредством Na, К+-АТФазы, а также обмен анионов Cl- на катионы гидрокарбоната, это приводит к гидратации и защелачиванию первичного секрета экзокринных желез.
Кроме того, CFTR играет важную роль в процессах активации Na-каналов, трансмембранного транспорта АТФ, адгезии бактериальных клеток на клеточных мембранах, регуляции функции гликозилтрансфераз внутриклеточных везикул, построения цитоплазматической мембраны, эндо- и экзоцитоза, а также апоптоза [126,139].
Расшифровка молекулярной структуры CFTR дала возможность точно гено-типировать изменения кодирующих его кодонов. Различают четыре класса мутаций CFTR [18]: - I класс – нарушения трансляции (нонсенс, сплайсинговые мутации, сдвиг рамки считывания);
Данные изменения реализуются на клеточном уровне недостаточной гидратацией и защелачиванием первичного секрета экзокринных желез, который меняет свои физико-химические свойства. Он становится густым и вязким, в секрете увеличивается концентрация гликопротеинов, затрудняется продвижение его по протокам, которые обтурируются белковыми пробками и дилатируются [69,180,226]. В ПЖ это приводит к тому, что, как правило, еще до рождения ребенка ее протоки оказываются заблокированными, панкреатические ферменты не достигают двенадцатиперстной кишки, происходит их аутоактивация в ткани ПЖ с аутолизом последней [18].
Таким образом, для муковисцидоза патогномоничным является панкреатит с выраженной экзокринной недостаточностью, которая развивается у 75% больных муковисцидозом. Следует отметить, что у 10-15% больных функция ПЖ снижается несущественно, и заболевание проявляется рецидивирующими атаками ОП [3]. Согласно результатам одного из относительно недавних исследований, проведенном в Канаде (C.Durno и соавт., 2002), среди 1075 пациентов с муковис-цидозом 87% больных имели внешнесекреторную недостаточность ПЖ, у 3% больных с сохранной внешнесекреторной функцией, со временем все же развивалась недостаточность ПЖ, и 10% больных в течение длительного времени характеризовались сохранной внешнесекреторной функцией ПЖ. Среди обследованных больных с мутациями гена CFTR и внешнесекреторной недостаточностью ПЖ 17,3% пациентов характеризовались одним или большим количеством обострений ХП в анамнезе [84]. Однако, нельзя игнорировать данные других эпидемиологических исследований, показывающих, что частота рецидивирующего ОП у таких больных не превышает 2% [83,259]. Возможно, данный факт объясняется географической и этнической гетерогенностью мутаций и подлежит дальнейшему анализу в будущем.
Итак, повреждения ПЖ при муковисцидозе развиваются внутриутробно и напоминают таковые при ХП. Поэтому, было предположено, что мутации гена CFTR могут часто встречаться среди пациентов с ХП и быть связаны с развитием этого заболевания. Действительно, высокая частота мутаций в гене CFTR у больных ХП была выявлена двумя независимыми группами [69,226] и подтверждена в дальнейших исследованиях [37,178,256].
Итак, в 1998 году N. Sharer и J.A.Cohn в 13,4-37,0% случаев ХП описали наличие мутации гена CFTR: комбинации двух легких и одной тяжелой мутации (3849+ЮКЬСТ, CFTRdele 2,3 (21Kb), R334W) [239,241]. Согласно исследованиям J.A.Cohn и соавт., проведенным в Университете Дарема (DukeUniversityinDur-ham, Северная Каролина, США), по данным генетического анализа 27 пациентов с идиопатическим ХП, было выявлено, что 37% из них характеризовались наличием мутации в гене CFTR [69]. В одновременно проводимом исследовании N. Sharer и соавт. в Манчестерской Королевской больнице (ManchesterRoyallnfir-mary, Англия) было обследовано 134 больных ХП, в то числе и алкогольной этиологии. Было обнаружено, что 13,4% больных ХП имело генетически наследуемую мутацию в CFTR гене с частотой почти 2,5 раза большей, чем она ожидалась [226].
В исследованиях, проведенных в Японии, у 56% больных ХП были выявлены изменения «потовой пробы» (увеличение концентрации NaCl в секрете потовых желез более 60 ммоль/л), типичные для больных муковисцидозом. Однако, при исследовании генома (авторы ориентировались на 20 наиболее часто встречаемых мутаций - Е60Х, R117H, R334W, R347P, А455Е, 1507, DF508, G542X, G551D, R553X, 621+1G T, 1078delT, R1162X, S1251N, W1282X, N1303K, 1717-1G A, 2183AA G, 3659delC, 3849+10kbC T) ни одной из этих мутаций выявлено не было. По всей видимости, это свидетельствует только лишь о наличии более редких мутаций CFTR гена в Японии, не исключая этиологическую роль мутаций CFTR гена при ХП [172].
Данные лабораторного и инструментального обследования у больных хроническим панкреатитом
сравнению с референтным интервалом, причем достоверно наиболее низкие показатели были отмечены при алкогольной и смешанной этиологии ХП, по сравнению с билиарнозависимым и идиопатическим ХП (р 0,05). Аналогичная достоверная тенденция прослеживалась и при сравнении средних значений альбумина в выделенных группах. Дефицит альбумина достоверно более был выражен у пациентов с алкогольной и смешанной формами ХП, по сравнению с билиарнозависимой и идиопатической формами ХП (р 0,05).
Средние значения билирубина зафиксированы в пределах вариаций нормальных значений во всех этиологических группах ХП и эти показатели не имели существенного клинического значения.
Повышение ГГТ по сравнению с референтным интервалом было отмечено во всех анализируемых группах, с наибольшими значениями при алкогольном ХП, по сравнению с другими выделенными группами ХП (р 0,05). Достоверное увеличение средних значений ЩФ было отмечено только при билиарнозависимом и смешанном ХП по сравнению с токсическим и идиопатическим ХП (р 0,05).
При сравнительном анализе средних значений общей амилазы, панкреатической амилазы (р-амилазы) и липазы сыворотки крови было выявлено, что при всех анализируемых этиологических формах, средние значения показателей были выше референтного интервала. Наибольшие изменения выявлены при билиарной форме ХП, где отмечено статистически достоверное превышение уровней сывороточных концентраций панкреатической ферментемии по сравнению с другими анализируемыми группами (р 0,05). Необходимо отметить, что у 52 пациентов из 240 (21,7%) показатели амилазы, р-амилазы и липазы были ниже нормальных значений, что коррелировало с показателем эластазы кала: чем ниже эластаза-1 кала, тем ниже вероятность панкреатической ферментемии (положительная корреляционная связь, I=0,74; р 0,05).Умеренно выраженная панкреатическая фер-ментемия при наличии склероза паренхимы ПЖ у части (12 / 83 – 14,5%) больных идиопатическим ХП имела неясный характер. Возможно, это определялось пан 96 креатической гипертензией (с панкреатостазом и уклонением ферментов в кровь в отсутствии явных интерстициальных отечных изменений), т.к. именно у этих пациентов отмечались признаки панкреатической гипертензии (расширение ГПП). Кроме того, всего лишь у 1 пациента из 12 наблюдалась значительная панкреатическая ферментемия (5-ти кратное увеличение р-амилазы и липазы), повлиявшая на средние величины в группе.
В общем анализе крови оценивался показатель абсолютного числа лимфоцитов как маркер трофологической недостаточности, значения которого при би-лиарнозависимом, смешанном и идиопатическом формах ХП были на нижней границе референтного интервала. Статистически достоверно наибольшее снижение показателя было отмечено у больных алкогольным ХП по сравнению с другими выделенными группами ХП (р 0,05).
Таким образом, можно заключить, что исследуемые лабораторные показатели во всех сравниваемых группах ХП имели схожую динамику. Для всех групп было характерно снижение уровней общего белка, альбумина крови и абсолютного числа лимфоцитов, умеренное увеличение ГГТ, ЩФ, панкреатических ферментов. Наибольшие различия отмечены между билиарнозависимым и алкогольным формами ХП. Таблица 22- Эндокринная и экзокринная (первичная) панкреатическая недостаточность у больных с различными этиологическими формами ХП
В таблице 22 представлены полученные нами данные, проведен анализ частот встречаемости анализируемых исходов ХП в зависимости от этиологии заболевания, получены оригинальные данные. Так, эндокринная недостаточность ПЖ встречалась у 17,1% включенных больных, достоверно чаще у больных токсическим и идиопатическим ХП относительно подгруппы с билиарнозависимым ХП (p 0,05). Причины меньшей встречаемости эндокринной недостаточности у больных ХП смешанной этиологии остались для нас неясными. Вероятно это обусловлено потенциальной неоднородностью группы, частота встречаемости эндокринной недостаточности ПЖ в которой заняла промежуточное положение относительно прочих выделенных этиологических форм, при этом сравнительный анализ не выявил статистически достоверных отличий ни с одной из выделенных групп. Дополнительный анализ частот, проведенный в зависимости от степени диабета, показал преобладание тяжелых форм у больных алкогольным и идиопа-тическим ХП, что отчасти можно объяснить и более выраженными структурными изменениями ПЖ у этих больных, о чем было отмечено выше.
Первичная экзокринная панкреатическая недостаточность (обусловленная снижением секреции эластазы-1 кала) была зарегистрирована в 32,5% случаев, т.е. почти в 3 раза меньше, чем при анализе частоты стеатореи (80%) и наличия нейтрального жира в стуле при микроскопии (90,7%). Это можно объяснить фактом доминирования вторичных механизмов панкреатической недостаточности (нарушение сегрегации, СИБР, гипермоторика кишечника и др.). Данные факты подтверждает проведенный нами внутригрупповой анализ, свидетельствующий о небольшой частоте (2,5%) первичной панкреатической недостаточности у больных билиарнозависимым ХП, имеющих менее выраженные структурные изменения паренхимы и протоковой системы ПЖ. Тем более, что в этой группе зарегистри 99 рована только легкая степень недостаточности. В остальных группах сравнения первичная панкреатическая недостаточность встречалась достоверно (более, чем на порядок) чаще. Больные токсическим и идиопатическим ХП характеризовались наибольшей частотой низких значений фекальной эластазы, достоверно превышающей таковую в подгруппах больных билиарнозависимым и смешанным ХП (p 0,05 в обоих случаях). Анализ частот в зависимости от тяжести первичной панкреатической недостаточности показал, что у больных токсическим и смешанным ХП преобладали легкие степени недостаточности, в то время как у больных идиопатическим ХП все 3 степени встречались с сопоставимой частотой.
Ввиду того факта, что наша работа имела целью оценить темпы прогресси-рования у больных с различными формами панкреатита в зависимости от генетического статуса, но дизайн работы не предусматривал длительного проспективного наблюдения, единственной возможностью установить данный факт являлось определение стадии и тяжести ХП (с применением классификации M-ANNHEIM [223] –раздел 2.2.1) с проведением последующего корреляционного анализа. В связи с тем, что больных ХП отбирались в гастроэнтерологическом отделении, текущий их статус не предполагал наличия осложненных форм в реальном режиме времени. Наличие старых псевдокист, компенсированных стриктур холедоха и т.п., не предполагающих хирургического вмешательства на момент первичного скрининга суммировались со старыми осложнениями. В результате мы получили весьма сходные цифры, представленные разделом 3.1.1. и полученные в результате анализа анаместических данных. Именно эти данные применялись здесь (для расчета тяжести) и далее – для корреляционного анализа и определения рисков (Глава 4).
Результаты идентификации мутации N34S (AAT AGT) в гене SPINK1
Мутация N34S была выявлена у 22 больных ХП и у 3 человек контрольной группы, что составило 9,2% и 2,8%, соответственно (p 0,05) (Рисунок 9). При этом, гомозигот среди больных ХП также оказалось больше – 5,4% и 0,9%, соответственно (p 0,05).Мутации в равной степени встречались и у мужчин, и у женщин, что позволило нам не приводить результаты анализа по гендерным отличиям отдельно. Полученные нами данные о распространенности мутации N34S гена ПИТ в смешанной популяции Москвы и Московской области, в целом, оказались вполне близки к результатам ряда зарубежных исследований [95,192,230]. Так, в исследованиях, проведенных за рубежом на общей выборке больных ХП без акцента на этиологию заболевания, мутация N34S в гене ПИТ была выявлена у 3,9-4,1% больных ХП [212]. В связи с большой вариабельностью частоты мутации N34S в различных странах, большой интерес для нас представляют работы, выполненные в России, или на генетически близких популяциях. В первом случае мы имеем дело с единичными публикациями, показывающими низкую частоту встречаемости этой мутации в смешанной российской популяции в пределах 1,85-3,06% у больных ХП [13,30]. Однако мутации N34S выявлялась статистически достоверно чаще у больных идиопатическим ХП относительно прочих этиологических форм заболевания, что предполагает генетическую основу заболевания, по крайне мере, у части больных идиопатическим ХП [13]. С другой стороны, в генетически близких популяциях (поляки) отмечается существенно более высокая частота встречаемости мутации N34S, достигающая 10% у детей с ХП [230] и 28,6% у взрослых с идиопатическим ХП против 6,5% в контроле [95]. Возможной причиной пусть небольшого, но все же, расхождения данных, является и генетическая гетерогенность населения в разных регионах мира, и гетерогенность самой формы «хронический панкреатит», и критерии диагностики этого заболевания, применяемые в том или ином исследовании, и т.д. В этой связи весьма любопытным может быть наш внутригрупповой анализ частоты мутации N34S у больных с различными этиологическими формами ХП.
Таким образом, наиболее простым объяснением некоторых несоответствий частот выявления мутации N34S у больных ХП и здоровых лиц может служить генетическое разнообразие различных этнических групп. В нашем исследовании, включающем смешанное население Москвы и Московской области частота гомозиготной мутации гена SPINK1 составила 5,3%, что сопоставимо с большинством исследований в Европе и США. Гомозиготное носительство N34S отмечено только 1 человека контрольной группы (0,9%), что также соответствует данным других исследований (0-2,8%) [160,168,220].
Так, частота мутации у больных билиарнозависимым и смешанным панкреатитом и в контроле была одинакова, что предполагает доминирование били-арных механизмов в патогенезе этих формы ХП. Наибольшая частота регистрации мутаций N34S была отмечена у больных токсическим, и, особенно, идиопа-тическим ХП, достигшая 16,7% в целом и 13,3% для гомозигот (Рисунок 10). Действительно, частота мутаций SPINK1 у больных идиопатическим ХП колеблется в пределах до 6,4% во Франции [59] до 25% в Финляндии [153] и США [192]. Такая вариабельность результатов, безусловно, может быть также объяснена генетическими отличиями изучаемых популяций. Однако, более высокая частота регистрации N34S, чем при алкогольном ХП, все же позволяет предполагать, что мутированный ген SPINK1 ведет себя скорее как ген-модификатор болезни. Это отчасти подтверждается результатами исследования, проведенного в Германии и Швейцарии, демонстрирующего прочную ассоциацию генной мутации SPINK1 и развития «раннего» идиопатического ХП [257].
Таким образом, высокая частота регистрации мутации N34S у больных ХП, особенно токсическим и идиопатическим, предполагает значимую роль генетических изменений гена ПИТ в патогенезе ХП у россиян. С другой стороны, в ряде ранее проведенных исследований было показано, что мутация N34S лишь незначительно повышает риск развития ХП у лиц, злоупотребляющих алкоголем относительно лиц, злоупотребляющих алкоголем, но без данной мутации [153,189]. При этом, существуют данные, свидетельствующие, что эта мутация встречается у 5,8% [273], 7,8% [258], 10% [153] и даже 18% [95] больных алкогольным ХП, проживающих в различных странах Европы и США. Наибольшая частота выявления мутации N34S у больных алкогольным ХП отмечается в Индии, где она достигает 26,8% [53]. В то же время, в Южной Корее, частота выявления этой мутации у больных алкогольным ХП составляет всего 2,4% [151].
Ни у одного из скринированных пациентов основной и контрольной групп мутации N29I и R122H в гене PRSS1 не выявлено, что позволяет предположить редкую встречаемость данных мутации в смешанной российской популяции и вероятное отсутствие взаимосвязи между мутациями гена катионического трипси-ногена и риском развития ХП у россиян.
В связи с тем, что общая частота мутации N34S среди больных ХП была относительно невысока для нашей выборки, а также с отмеченной нами выраженной гетерогенности частот мутации в разных этиологических подгруппах, детальный анализ в общей выборке не приводили, поскольку по подавляющему большинству клинических, лабораторных и инструментальных признаков, нами не было отмечено достоверных взаимосвязей. Наиболее значимые особенности течения ХП, исходов заболевания и осложнений в зависимости от наличия мутации N34S представлены Рисунками 11 и 12. Какой-либо зависимости наличия единственной мутации N34S в группе больных билиарнозависимым ХП нами не отмечено, что позволило не приводить эти данные.
