Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1,1, Введение 6
1.2. Эпидемиология дефицита 21-гидроксилазы 8
1.3. Диагностика дефицита 21-гидрокснлазы 11
1.4. Лечение дефицита 21-гидроксилазы 19
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Планирование исследования 39
2.2. Характеристика объектов исследования 39
2.3. Клиническое обследование 40
2.4. Лабораторные методы исследования 40
2.5. Молекулярно-генетический анализ 41
2.6. Статистический анализ 42
Глава 3. Результаты собственных исследований 44
3.1. Московский регистр детей с врожденной дисфункцией коры надпочечников 44
3.2. Возраст постановки диагноза в зависимости от формы заболевания и пола пациентов 46
3.3. Гормональная диагностика дефицита 21-гидроксилазы 51
3.4. Сравнительный анализ различных схем глюкокортикоидной терапии 60
3.5. Молекулярно-гекетпческие исследования гена CYP21 67
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 76
Выводы 87
Практические рекомендации 88
Список литературы
- Эпидемиология дефицита 21-гидроксилазы
- Диагностика дефицита 21-гидрокснлазы
- Лабораторные методы исследования
- Возраст постановки диагноза в зависимости от формы заболевания и пола пациентов
Введение к работе
Актуальность типы.
Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) - это группа аутосомно-рецессивных наследственных болезней, обусловленных дефектами ферментов стероидогенеза. Наиболее распространенной формой является дефицит 21-гидроксилазы, который составляет от 90 до 95% всех вариантов ВДКН. Частота 21-гидроксилазной недостаточности чрезвычайно высока, и в классическом варианте встречается в общей популяции у 1 на 14 199 новорожденных Данные о частоте этого заболевания в России отсутствуют.
Поздняя диагностика ВДКН и несвоевременно начатое лечение приводят к многочисленным осложнениям, таким как смерть в неонатальном периоде вследствие водно-электролитных нарушений, снижение репродуктивной функции, низкорослость и психологические проблемы в связи с необходимостью перемены пола.
Применяемые в настоящее время клинико-лабораторные методы диагностики не всегда позволяют окончательно верифицировать диагноз. Современным дополнительным методом является молекулярно-генетический анализ гена CYP21, кодирующего фермент 21-гидроксилазу. Ген локализован на коротком плече б хромосомы (6р), имеет 10 экзонов и тесно связан с HLA комплексом. На сегодняшний день описано более 50 мутаций в гене CYP21, причем около 90% всех случаев дефицита 21-гидроксилазы приходится на 12 наиболее распространенных мутаций, являющихся результатом конверсии гена 21-гидроксилазы CYP21 с псевдогеном CYP21P.
В ряде стран проводится неонатальный скрининг для выявления ВДКН. Для этого определяется 17-гидроксипрогестерон - классический маркер 21-гидроксилазного дефицита, в последующем возможно подтверждение диагноза молекулярно-генетическим анализом. Так же возможна пренатальная диагностика в семьях, имеющих детей с данной патологией. В настоящее время проводится внутриутробное лечение плодов женского пола, что снижает степень вирилизации наружных гениталий и позволяет избежать в дальнейшем оперативной коррекции пола.
Для проведения неонатального скрининга необходимо иметь данные о распространенности различных форм ВДКН в российской популяции и о частоте встречаемости различных мутаций гена CYP21 среди российских пациентов. Проведение пренатальной диагностики в семьях с ВДКН возможно при наличии базы данных мутаций CYP21 у больных, их родителей и сибсов.
На сегодняшний день нет единой оптимальной схемы лечения врожденной дисфункции коры надпочечников. Сложность терапии заключается в том, что необходимо добиться подавления избыточной секреции надпочечниковых андрогенов и, следовательно, избежать ускоренного скелетного созревания, одновременно не вызывая торможения скорости роста высокими дозами глюкокортикоидных препаратов. Применяются различные глюкокортикоидные препараты, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. В мировой практике препаратом выбора у детей является гидрокортизон, в нашей стране до недавнего времени наиболее распространен был преднизолон.
Цель исследования.
Эпидемиологический анализ дефицита 21-гидроксилазы в московской популяции и проведение молекулярно-генетических исследований гена CYP21 у пациентов с врожденной дисфункцией коры надпочечников.
Для осуществления этой цели поставлены следующие задачи
-
создание московского регистра больных ВДКН с базой данных мутаций гена CYP21;
-
верификация диагноза с использованием клинических, гормональных и молекулярно-генетических методов исследования;
-
выявление корреляции клинической формы заболевания с генетическим дефектом гена CYP21, определение генетических дефектов, вызывающих тяжелые формы ВДКН;
-
анализ эффективности применяемой терапии, оценка достигаемого конечного роста в зависимости от сроков начала лечения и схемы терашш.
Научная новизна.
Впервые в России на примере московской популяции проведен эпидемиологический анализ 21-гидроксилазной недостаточности. Показана эффективность и необходимость ДНК-диагностики в дополнение к клинико-гормональным методам у пациентов с подозрением на дефицит 21-гидроксилазы. Впервые в России применен метод детекции химерного гена для оценки частоты различных мутаций гена CYP21 в популяции.
Практическая значимость:
Проведенный эпидемиологический анализ позволил оценить распространенность классических форм дефицита 21-гидроксилазы в московской популяции, что является необходимым для подготовки процедуры неонатального скрининга.
По результатам работы показано, что препаратом выбора в терапии 21-гидроксилазной недостаточности у детей допубертатного возраста является гидрокортизон.
Создание базы данных мутаций гена CYP21 в московской популяции позволяет проводить пренатальную диагностику и лечение в семьях, имеющих больных детей.
Апробация работы:
Результаты проведенного исследования доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая эндокринология: достижения и перспективы» (С.-Петербург, 2003); на 2-ой международной научно-практической конференции «Врачи мира пациентам» (С.-Петербург, 2003); на II Всероссийской научно-практической конференции детских эндокринологов "Эндокринологические аспекты здоровья детей" (Москва, 2003), на 43 конференции Европейского общества педиатров-эндокринологов, (Базель, Швейцария 2004), на межотделенческой научной конференции ЭНЦ РАМН (Москва, 2004).
По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.
Структура и объем диссертации:
Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственного исследования и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, иллюстрирована 22 рисунками. Библиография содержит 12 отечественных и 162 зарубежных источников
Эпидемиология дефицита 21-гидроксилазы
Первое клиническое описание врожденной дисфункции коры надпочечников как женского псевдогермафродитизма относится к концу 19 века (Phillips 1886г), и только к 50гг XX века удалось выяснить причину данной патологии и определить принципы терапии заболевания [19,195,196]. Первые эпидемиологические данные относятся к 1956-58гг и крайне противоречивы, от 1:5 000 новорожденных [136] до 1: 67 000 новорожденных [40].
В России первые работы, обобщающие клинический опыт наблюдения за детьми с врожденной дисфункцией коры надпочечников были опубликованы в начале XX века. В 1923 году О.В. Верещинский опубликовал данные о 12 пациентах, страдающих этим заболеванием [9]. Изучением этой проблемы занимались многие ведущие детские эндокринологи и гинекологи СССР. Ими было опубликовано множество сообщений о клинических вариантах, методах хирургического и медикаментозного лечения адреногенитального синдрома (Бурая Т.И., Голубева И.В., Жуковский М.А., Касаткина Э.П., Кузнецова Э.С, Раскин A.M., Тумилович Л.Г.) [1,2,9,10,11]. В 60е-70е годы на основе длительного опыта наблюдения за относительно большой когортой пациентов (более ІЗОпациентов) с адрено-генитальным синдромом в детском отделении ИЭЭиХГ РАМН были выполнены научные работы, анализирующие клинические проявления и результаты лечения этого заболевания [1,11]. Однако эпидемиологических исследований врожденной дисфункции коры надпочечников ранее в России не проводилось.
В 1977г впервые стал доступен простой и надежный метод скрининга 21-гидроксилазной недостаточности основанный на исследовании 170НП радиоиммунным методом, что открыло новые возможности изучения эпидемиологии данного заболевания. Первый пилотный проект неонатального скрининга был осуществлен на Аляске в популяции эскимосов, отличающейся высокой частотой данной патологии [126,127]. По результатам этого проекта частота 21-гидроксилазной недостаточности среди эскимосов Аляски составила 1:280 новорожденных, что по сегодняшний день остается самой высокой частотой данной патологии в мире [127].
С 1980 по 1988гг неонатальный скрининг на основе определения уровня 170НП проводился в 8 странах (США, Франция, Италия, Новая Зеландия, Япония и Шотландия). Приблизительно около і миллиона новорожденных было включено в исследование, которое выявило 77 случаев ВДКН. Это позволило оценить распространенность классических форм 21-гидроксилазной недостаточности в мировой популяции как 1:14 199 новорожденных (соответственно, для сольтеряющей формы - 1:18 850, для простой вирильной - 1:57 543) [130]. К 1991 году функционировало 29 программ неонатального скрининга в 13 странах. После обследования 6,5 млн. новорожденных были опубликованы окончательные данные о распространенности 21-гидроксилазной недостаточности в различных регионах мира (табл. 1).
Распространенность ВДКН, рассчитанная по данным неонатального скрішинга, оказалась в 2 раза выше распространенности, установленной на основании клинической диагностики [140,145]. Данные японских исследователей еще более красноречиво указывают на значимость введения неонатального скрининга. В Японии частота заболевания, опубликованная в 1981 году на основе клинической диагностики, составила 1:44 000 новорожденных, тогда как после проведения неонатального скрининга, включившего 4 млн. новорожденных, возросла до 1:18 000 [ПО].
Диагностика дефицита 21-гидрокснлазы
Диагностика 21-гидроксилазной недостаточности основана на: Анализе клинических проявлений Анализе электролитных показателей « Гормональных исследованиях Молекулярно-генетическом анализе
Уже во внутриутробном периоде у плодов женского пола под влиянием большого количества надпочечниковых андрогенов происходит вирилизация наружных гениталий, формирование урогенитального синуса, сращение больших половых губ, рост и вирилизация клитора [137,42]. Степень вирилизации наружных гениталий коррелирует со степенью потери ферментативной активности 21-гидроксилазы и, следовательно, с формой заболевания. У мальчиков наружные гениталии сформированы правильно, но может обращать на себя внимание крупный половой член и пигментация мошонки. Следовательно, заподозрить у них врожденную дисфункцию коры надпочечников можно только после появления сольтеряющих симптомов, таких как плохая прибавка в весе, обильные срыгивания, жидкий стул, нарастающая дегидратация и ацидоз [194,130]. Как правило, сольтеряющий криз у новорожденных с дефицитом 21-гидроксилазы развивается не раньше 5-15 суток жизни [191,111]. Таким образом, диагноз девочкам с дефицитом 21-гидроксилазы ставится раньше, чем мальчикам. По разным данным средний срок постановки диагноза сольтеряющей формы (без процедуры неонатального скрининга) у девочек составляет от 9 дней до 13 дней, тогда как у мальчиков - от 21 дня до 26 дней [133,167,86,154].
Простая вирильная форма 21-гидроксилазной недостаточности диагностируется у девочек на основании неправильного строения наружных гениталий, следовательно, можно ожидать, что диагноз этим девочкам устанавливается сразу после рождения. Однако по данным различных исследований средний срок постановки диагноза в этой группе превышает 2 года [86,133,154]. По-видимому, столь поздние сроки диагностики связаны с различной степенью вирилизации наружных гениталий у девочек с вирильной формой заболевания [31,42,67].
В группе девочек с сольтеряющей формой 21-гидроксилазной недостаточности степень вирилизации наружных гениталий больше, чем в группе с простой вирильной формой [93,119]. В большом ретроспективном исследовании французских авторов изучалась корреляция генотипа с клинической формой и особенностями течения 21-гидроксилазной недостаточности у 68 пациентов. Все пациенты были разделены на 5 групп (О, А, В, С, D). Каждой группе соответствовал определенный генотип: группа О - del, группа А - I2splice, группа В - I172N, группа С - V281L, P30L, группа D - вновь выявленные мутации. В работе было показано, что девочки из группы 0 и А (генотип "О" и I2splice) в основном имели 4-ую степени вирилизации по Прадеру (61%), тогда как в группе В (генотип I172N) степень вирилизации варьировала от 3 (50%) до 2 (50%) [133]. Таким образом, для сольтеряющей формы заболевания в целом характерна более высокая степень вирилизации, чем для вирильной. Однако среди пациентов с простой вирильной формой ВДКН встречаются пациенты с 4-ой степенью вирилизации по шкале Прадера, и, наоборот, у пациентов с сольтеряющей формой вирилизация может быть выражена слабо. Степень корреляции «генотип-фенотип» значительно строже определяется в отношении сольтеряющего компонента, чем в отношении степени вирилизации. Так как на степень вирилизации наружных гениталий оказывает эффект не только количество надпочечниковых андрогенов, но также их метаболизм и рецепторная чувствительность к ним [42,31,67].
У мальчиков простая вирильная форма заболевания может быть заподозрена на основании симптомов преждевременного адренархе, опережении линейного роста и темпов костного созревания. В этой группе пациентов диагноз, как правило, устанавливается к 3-5 годам [86,133,154]. К моменту постановки диагноза у мальчиков имеется уже значительное опережение костного возраста, что определяет плохой ростовой прогноз у этих пациентов [72,146,62,106,174].
Основным гормональным критерием 21-гидроксилазной недостаточности является повышенный уровень 17-гидроксипрогестерона. У детей с классической формой заболевания уровень 170НП с первых дней жизни в десятки и сотни раз превышает нормативные показатели [191,82]. Так, для сольтеряющей формы заболевания средний уровень 170НП в новорожденный период превышает 300 нмоль/л, у детей с вирильной формой уровень 170НР несколько ниже, но превышает 100 нмоль/л [82]. По данным Speiser PW средний уровень 170НП у пациентов с сольтеряющей формой составил 1241+724 нмоль/л, а у пациентов с простой вирильной формой — 330+199 нмоль/л [156]. Неонатальный скрининг
С 1977 года, после развития методики определения 17-гидроксипрогестерона в капиллярной крови из пятки новорожденного на фильтровальной бумаге, стало возможным проведение неонатального скрининга [128,129]. Главной целью скрининга является диагностика новорожденных с сольтеряющей формой заболевания до развития клиники острой надпочечниковой недостаточности и, таким образом, предотвращение летальных случаев. Проведение скрининга особенно актуально для новорожденных мужского пола, так как манифестация заболевания проявляется только сольтеряющими кризами [166,18,25,167]. У девочек с рождения отмечается неправильное строение наружных гениталий, что позволяет предположить наличие у них 21-гидроксилазной недостаточности и является показанием для проведения мониторинга электролитов крови. Неонатальный скрининг также позволяет правильно определить женский пол новорожденного с неправильным строением наружных гениталий. С помощью неонатального скрининга появилась возможность выявлять вирильную форму заболевания у мальчиков при рождении, тогда как клиническая диагностика была возможна только в 3-5 лет, когда уже отмечалось значительное опережение костного возраста [166,45,25].
Первая экспериментальная программа неонатального скрининга ВДКН была предпринята в штате Аляска, которая подтвердила возможность и эффективность данной программы [126,127]. В течение последующих 8 лет неонатальный скрининг проводился в 8 странах (США, Франция, Италия, Новая Зеландия, Япония и Шотландия), приблизительно около І миллиона новорожденных было включено в программу, и выявлено 77 случаев ВДКН. Это позволило оценить распространенность классических форм 21-гидроксилазной недостаточности как 1:14199 новорожденных [130]. К 1991 году функционировало 29 программ неонатального скрининга в 13 странах, а в настоящее время еще большее число стран используют неонатальный скрининг для выявления пациентов с ВДКН.
Лабораторные методы исследования
Биохимические исследования (калий, натрий, хлориды, глюкоза), которые проводились в биохимической лаборатории ЭНЦ РАМЫ (рук. -Ильин А.В.) рентгенография кистей для оценки костного возраста (1 раз/год) проводилась в рентгенологическом отделении ЭНЦ РАМН (рук. — д.м.н. Бухман А.И.); гормональные исследования проводились в гормональной лаборатории ЭНЦ РАМН (рук. - проф. Гончаров Н.П.) Определение в сыворотке крови 17-гидроксипрогестерона (170НР), адренокортикотропного гормона (АКТГ), дегидроэпиандростерона-сульфата (ДГЭАс) и активности ренина плазмы (АРП) проводилось методом радиоиммунного анализа с использованием RIA-наборов фирмы «CIS-Bio International» (Франция); исследование тестостерона сыворотки крови проводилось с помощью автоматизированной системы «Vitros» (Johnson-Johnson company).
При оценке степени компенсации заболевания учитывались следующие параметры: наличие сольтеряющих кризов, темпы физического развития, темпы костного созревания, уровень 170НР и АРП. проводился в гормональной лабораторіш ЭНЦ РАМН (рук. — Прокофьев С.А.) и в лаборатории гормонов и рецепторов Института молекулярной биологии им.Эпгельгардта (рук. — проф. Рубцов П.М.)
Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови пациентов по модифицированной методике N.J.Gemmell и S.Akiyama (высаливание хлористым литием) [65].
Детекцию точечных мутаций в гене CYP21 проводили по методике A.Wedell и H.Luthman [179] с модификациями. Авторы учитывали дополнительный остаток лейцина (вариант полиморфизма) на N-конце стероид 21-гидроксилазы, что приводит к «сдвинутой» нумерации кодонов (+1) и нуклеотидов (+3). Селективно амплифицировали фрагменты гена CYP21, используя праймеры, комплементарные участку 8 п.н. в экзоне 3.
Полученные в результате амплификации специфические фрагменты ДНК использовали для генотипирования 12 точечных мутаций методом аллель-специфической ПЦР.
Детекцию химерного гена CYP21P/CYP21 осуществляли методом Lee Н.Н. и соавт. [98] с модификациями. В первом раунде амплифидировали ген CYP21 и химерный ген CYP21P/CYP21 , во втором — проводили дифференциацию между этими генами амплификацией с набором специфических праймеров.
Прямое секвенирование гена CYP21 (в тех случаях, когда методом аллель-специфической амплификации была выявлена мутация только в одном аллеле) проводилось ручным методом или на автоматическом секвенаторе «ABI PRISM 310».
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью параметрических и непараметрических критериев статистического анализа. Результаты представлены в виде: для параметрических критериев -среднее значение + стандартное отклонение; для непараметрических критериев — медиана (минимальное и максимальное значение). Статистическая обработка производилась на ШМ-совместимом компьютере с использованием программы SPSS for Windows.
Распространенность 21-гидроксилазной недостаточности, т.е. совокупность всех больных детей (независимо от времени постановки диагноза) приходящихся на 100 000 детского населения рассчитывалась по формуле:
Распространенность = число выявленных больных детей х 100 000/ число детского населения.
При анализе корреляции генотип-фенотип использовался критерий позитивной предсказательной ценности (ППЦ) для различных групп мутаций, который вычислялся по формуле:
ППЦ = количество пациентов с определенной клинической формой / количество пациентов с генотипом соответствующей группы X 100%
Возраст постановки диагноза в зависимости от формы заболевания и пола пациентов
При анализе составленного регистра нами определен средний возраст постановки диагноза при сольтеряющей и простой вирильной форме заболевания в зависимости от пола пациентов. С этой целью из регистра были отобраны пациенты, у которых известен точный срок постановки диагноза. В группе пациентов с сольтеряющей формой заболевания оказалось 37 девочек и 34 мальчика, в группе с простой вильной формой - 12 девочек и 5 мальчиков.
Более ранняя диагностика сольтеряющей формы заболевания у девочек обусловлена наличием у них такого клинического признака, как неправильное строение наружных гениталий. Несмотря на это, медиана срока постановки диагноза в группе девочек с сольтеряющей формой (п=37) заболевания составила 9 дней (2-94 дней). В группе мальчиков с сольтеряющей формой заболевания (п=34) медиана возраста постановки диагноза составила 30 дней (2-96 дней) (Рис. 6). Минимальный срок постановки диагноза в этой группе составил 2 дня для пациентов с отягощенным наследственным анамнезом (в семье уже имелся больной ребенок) и 11 дней для остальных мальчиков (Рис. 7).
При вирильной форме заболевания сроки постановки диагноза оказались чрезвычайно поздними даже для девочек, которые имеют разную степень вирилизации наружных гениталий. Медиана срока постановки диагноза в этой группе пациентов (п=12) составила 0,9 лет (5 дней — 6,3 года). Следует отметить, что минимальный возраст постановки диагноза простой вирильной формы у девочек составил 5 дней, и у 50% девочек диагноз установлен на первых месяцах жизни (Рис. 8). Простая вирильная форма 21-гидроксилазной недостаточности установлена до 3 лет жизни лишь у 1 мальчика. Медиана срока постановки диагноза простой вирильной формы в группе мальчиков (п=5) оказалась 5,7лет (2,3 — 6,4 года) (Рис. 9).
Учитывая столь поздние сроки постановки простой вирильной формы дефицита 21-гидроксилазы у мальчиков, средний костный возраст в этой группе пациентов на момент постановки диагноза составил 13,75+2,3 лет, при этом предполагаемый конечный рост (рассчитанный по таблице Bayley-Pinneau) составил 152+ 7 см. Рассчитанный нами целевой рост в этой группе пациентов составил 174,5+Зсм , таким образом, дефицит роста у этих больных составит около 22см (Рис. 10).
Очевидно, что средний возраст постановки диагноза сольтеряющей формы 21 -гидроксилазной недостаточности как у мальчиков, так и у девочек превышал 15 дней, т.е. тот средний срок при котором манифестирует солътеряющий синдром у этих детей. Поэтому интерес представляет уровень электролитов на момент диагностики заболевания у наших детей. Средний уровень калия на момент постановки диагноза оказался равен 7,5+1,59ммоль/л (п=38). В группе девочек средний уровень калия составил 6,96+0,29ммоль/л, а в группе мальчиков - 7,26+0,41 ммоль/л. Неожиданным оказался тот факт, что уровень калия при постановке диагноза достоверно не отличался в группе девочек, у которых заболевание диагностировано достоверно раньше, и в группе мальчиков (Рис. 11). У 48% девочек с сольтеряющей формой заболевания диагноз был установлен уже при наличии клинической картины сольтеряющего синдрома.
Мы изучили уровень 17-гидроксипрогестерона сыворотки крови, как основного гормонального критерия дефицита 21-гидроксилазы, на момент постановки диагноза. За диагностически значимую величину нами был принят уровень 170НП превышающий 38,7нмоль/л, т.е. верхний порог чувствительности применяемого в нашей лаборатории метода. Среди обследованных пациентов (п=53) уровень 170НП превышал 38,7нмоль/л у 48 человек (91%). У остальных 5 пациентов уровень 170НП при постановке диагноза колебался в широких пределах вплоть до нормальных значений (Рис. 12).
