Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Нормальная микрофлора кишечника и ее роль в организме человека 11
1.1. Формирование представлений о роли микрофлоры в организме 11
1.2. Способ существования микроорганизмов в кишечнике 12
1.3. Нормальная кишечная микрофлора и ее функции 13
1.4. Роль нормофлоры в становлении здоровья ребёнка 16
1.5. Состав нормальной микрофлоры толстого кишечника 17
Глава 2. Эпидемиологические и микробиологические аспекты формирования и нарушения микрофлоры кишечника человека 22
2.1. Микробиологические основы формирования кишечной микрофлоры 22
2.2. Основные этапы и эпидемиологические аспекты колонизации кишечника новорожденного 24
2.3. Нарушения микроэкологии кишечника и их эпидемиологическое значение 29
2.4. Факторы, влияющие на состав кишечной флоры детей 1-го года жизни 33
2.5. Эпидемиологические аспекты колонизации кишечника новорожденных золотистыми стафилококками и условно-патогенными энтеробактериями 36
2.6. Применение методов молекулярной эпидемиологии в изучении эпидемиологических аспектов колонизации кишечника человека 44
Глава 3. Чувствительность к антибиотикам и бактериофагам штаммов S.Aures и Klebsiella SPP., выделенных из кишечника детей 76
Заключение 116
Выводы 126
Список литературы 128
- Способ существования микроорганизмов в кишечнике
- Состав нормальной микрофлоры толстого кишечника
- Основные этапы и эпидемиологические аспекты колонизации кишечника новорожденного
- Чувствительность к антибиотикам и бактериофагам штаммов S.Aures и Klebsiella SPP., выделенных из кишечника детей
Введение к работе
Актуальность темы. Микрофлора кишечника является важным фактором, способствующим нормальному развитию и функционированию организма ребенка. Нарушения качественного и количественного состава микрофлоры кишечника могут привести к развитию дисбиоза [Бондаренко В.М., Грачева Н.М., 2003].
Анализ публикаций последних лет показывает, что на современном этапе проблема микроэкологических нарушений у детей, связанных с колонизацией кишечника условно-патогенными микроорганизмами, по-прежнему сохраняет общемедицинское значение [Воробьев А.А., 1998; Мухина Ю.Г.2003].
Широкое распространение дисбиозов является одним и факторов, определяющих в настоящее время наблюдаемое увеличение частоты и тяжести острых и хронических заболеваний различных органов и систем (желудочно-кишечного тракта, дыхательной, иммунной, нервной и др.). Особенно актуальна проблема дисбиоза у детей первого года жизни, так как дисбиоз отрицательно влияет на развитие и функционирование организма, ребенка, способствует затяжному, рецидивирующему течению заболеваний, развитию инфекционных, аллергических осложнений [Воробьев А.А.,1998; Мухина Ю.Г.2003].
Проблема микроэкологических нарушений у детей первого года жизни-актуальна в связи с тем; что патологический микробиоценоз может стать* источником факторов, вызывающих или поддерживающих развитие энтероколитов [Бондаренко В.М., 2007; Lewingdon P.J. et al.,1995], факторов общетоксического действия [Запруднов A.M., Мазанкова Л.Н., 1999; Самсыгина Г.А., 2003; Бондаренко В.М., 2007; Bjorksten В., Naaber P., 1999; Kirjavainen P.V., 2002], основой для развития инфекций, выходящих за пределы желудочно-кишечного тракта [Дудникова Э.В., 2002; Behari P., Englund J., 2004; Cooke R.P., Devlin J., 1987; Adlerberth L, Lindberg E., 2006; и др.], различных
аутоиммунных и аллергических заболеваний [Запруднов A.M., Мазанкова Л.Н., 1999; Самсыгина Г.А., 2003; Урсова Н.И., 2003; Бондаренко В.М., 2007; Bjorksten В., Sepp Е., 2001; Kirjavainen P.V., 2002]. Патологический микробиоценоз как резервуар условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) может играть большую роль в возникновении внутрибольничных инфекций [Fryklund В., Tullus К., 1992; Goldmanln D.A., 1981]. У ряда детей на фоне снижения иммунитета может активизироваться собственная условно-патогенная микрофлора организма, что может привести к формированию локального инфекционного процесса, который может перейти в генерализированную форму с возникновение дополнительных очагов эндо- и экзогенной инфекции и суперинфекции различной локализации [Бондаренко В.М., 2007]. При этом дисбиотическая микрофлора становится источником вторичной инфекции, увеличивающим риск возникновения тяжелых ВБИ различной этиологии [«Справочник госпитального эпидемиолога», 1999]. Поэтому профилактика колонизации кишечника детей УПМ, а также коррекция нарушенного микробиоценоза является одним из подходов к профилактике внутрибольничных инфекций.
Установлено, что в толстом кишечнике число микробных клеток превышает число клеток организма человека в 10 раз и составляет >10п бактериальных клеток/г содержимого [Roderick I М., Abdelghani S., 1999]. Они участвуют в процессах метаболизма; постнатального развития, иммунного ответа, возникновение воспалительных заболеваний и др< В связи с этим важное значение приобретает микробиом кишечника (т.е. коллективный геном' всех индигенных микробов), который зависит от количественного и качественного состава микрофлоры кишечника. (Термин «микробиом» был предложен нобелевским лауреатом Иошуа Ледербергом, который выдвинул идею, что полная генетическая картина Homo sapiens, как формы жизни, должна включать и гены нашего микробиома.) [Hooper L.V., Gordon J.I., 2001; Hooper L.V., Wong M.H., 2001]. Микробиом кишечника может содержать в 100
и более раз больше генов, чем геном человека, обеспечивая организм различными генетическими и метаболическими факторами, отсутствующими у хозяина [Fredrik В., Ruth E.L., 2005]. Поэтому относительная стабильность микрофлоры кишечника является существенным фактором, поддерживающим постоянство внутренней среды организма человека, в том числе и в раннем детском возрасте.
Несмотря на большое количество работ, посвященных дисбиозам, в этой области остается ряд нерешенных проблем, касающихся эпидемиологических и микробиологических аспектов колонизации кишечника детей УПМ, в том числе роли факторов, способствующих колонизации кишечника УПМ, источников и путей передачи УПМ, колонизирующих кишечник детей на. первом году жизни. Изучение этих проблем может иметь как теоретическое, так и практическое значение для прогнозирования многих заболеваний и осложнений, особенно, у детей первого года жизни, что создает возможность объективно выбрать тактику профилактики и лечения, оценить эффективность профилактических мероприятий, экономически обосновать целесообразность того или иного метода профилактики.
В последние годы в разных областях микробиологии и эпидемиологии широко используются молекулярно-генетические методы, которые в отличие от фенотипических методов исследования, основанных на выявлении фенотипических признаков, экспрессируемых генами микроорганизмов, представляют собой исследования структуры ДНК. Возможности методов, изучающих фенотипические признаки микроорганизмов (бактериологические, биохимические, серологические и др.). ограничены вследствие способности микроорганизмов изменять экспрессию соответствующих генов в, ответ на влияние различных факторов окружающей среды. По сравнению с традиционными фенотипическими методами молекулярно-генетические методы отличаются универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации и высокой воспроизводимостью. Эти методы благодаря своей
высокой чувствительности и специфичности в сочетании с традиционными методами открывают новые возможности для исследования свойств, источников и путей передачи разных возбудителей [Шагинян И.А., Тарасевич И.В, 2007].
Использование молекулярно-генетических методов в сочетании с классическими методами эпидемиологии при изучении колонизации кишечника детей УПМ позволит повысить точность и информативность исследований [Шагинян И.А., Тарасевич И.В, 2007], которые могут иметь большое значение в связи с такими важными вопросами как подготовка беременных к родам, противоэпидемический режим в роддомах и в детских стационарах, содержание матерей и новорожденных детей в одной или разных палатах, переход с грудного вскармливания на искусственное и т.д., что позволит правильно определить направление и тактику профилактических мероприятий по предупреждению колонизации кишечника детей первого года жизни УПМ.
В связи с этим, представляется целесообразным, используя методы молекулярной эпидемиологии и биостатистики, выявлять источники колонизации кишечника детей условно-патогенными микроорганизмами, установить роль госпитальных штаммов УПМ в колонизации кишечника детей и роль грудного молока как фактора передачи УПМ, а также определить роль различных факторов риска в колонизации кишечника детей первого года жизни УПМ.
Цель работы.
Выявление источников и механизмов передачи УПМ, колонизирующих кишечник детей первого года жизни, и определение роли различных факторов риска в колонизации кишечника детей УПМ для обоснования тактики профилактических мероприятий.
Задачи исследования.
Определить частоту наличия различных условно-патогенных микроорганизмов в составе микрофлоры кишечника людей разного возраста, в том числе у детей первого года жизни.
Провести внутривидовое типирование штаммов условно-патогенных микроорганизмов, наиболее часто выделяемых из кишечника детей (S.aureus и Klebsiella spp.), с помощью фенотипических и генотипических методов.
Провести обследование пар мать-ребенок: изучить состав микрофлоры грудного молока и кишечника детей, а также носа и рук их матерей и определить клональное происхождение штаммов УПМ, выделенных от матерей и из кишечника детей, с применением методов молекулярной эпидемиологии.
Выявить клональное происхождение штаммов УПМ, выделенных из кишечника детей, родившихся в одном роддоме, с помощью молекулярно-биологических методов, и определить роль внутрибольничных штаммов УПМ в колонизации кишечника детей.
Оценить роль факторов риска в колонизации кишечника ребенка УПМ с помощь исследования пар мать-ребенок с применением математической модели (логистическая регрессия).
Обосновать тактику профилактических мероприятий, направленных на. предупреждение колонизации кишечника ребенка УПМ.
Научная новизна.
- Впервые с помощью комплексного подхода с применением эпидемиологических, молекулярно-генетических, микробиологических, статистических методов исследования изучены эпидемиологические аспекты
колонизации кишечника детей 1-го года жизни условно-патогенными микроорганизмами. Выявлены возможные источники УПМ, колонизирующих кишечник детей первого года жизни. Установлено, что золотистые стафилококки, колонизирующие кишечник детей, могут иметь как материнское, так и внутрибольничное происхождение, тогда как грибы рода Candida - преимущественно материнское.
Впервые с помощью молекулярно-генетических методов продемонстрирована роль инфицированного грудного молока как фактора передачи УПМ от матери ребенку. Установлено, что условно-патогенная флора, попадающая в кишечник ребенка с материнским молоком, не всегда колонизируется в кишечнике. Показано, что колонизация зависит от состояния облигатной микрофлоры или наличия в кишечнике ребенка других УПМ. Обоснованное решение о прекращении грудного вскармливания педиатр должен принимать после изучения результатов обследования на дисбактериоз кишечника ребенка, оценки общего клинического состояния ребенка, а также после изучения результатов бактериологического исследования грудного молока и оценки характера и степени его инфицированности.
- Впервые с помощью математической модели была изучена роль различных факторов риска в колонизации кишечника детей условно-патогенными микроорганизмами (S.aureus, Klebsiella spp, Candida spp.). Установлено, что в процессе колонизации кишечника детей золотистым стафилококком основным определяющим фактором^ является наличие золотистых стафилококков в носу матери, а грибами рода Candida — наличие их в грудном молоке матери.
Практическая значимость.
На основе полученных результатов разработаны методические рекомендации «Тактика профилактических мероприятий, направленных на
предупреждение колонизации кишечника детей первого года жизни условно-патогенными микроорганизмами» (2007г), утвержденные на совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, протокол № 2 от 15 ноября 2007г.
Предложенные рекомендации могут найти применение в лечебно-профилактических учреждениях, занимающихся проблемами материнства и детства, в процессе осуществления профилактических и противоэпидемических мероприятий.
Апробация диссертации.
Материалы диссертации доложены на конференции посвященной 10-летию НПЦ диагностики, лечения и профилактики дисбактериозов НИИ иммунологии ЧелГМА и 60-летию ГОУ ВПО "Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ" (Челябинск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007);
Апробация диссертации состоялась 19 июня 2007 на совместной научной конференции отделов эпидемиологии и микробиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (протокол № 15).
Публикации. По результатам исследований опубликованы 12 работ.
Способ существования микроорганизмов в кишечнике
Еще Мечников писал о кишечных микроорганизмах как о биоплёнке, состоящей из сотен видов микробов и покрывающей кожу и слизистые оболочки человека наподобие перчатки. Понятие биоплёнки осталось актуальным и в наши дни. Только оно было дополнено и расширено. Известно, что пристеночные микроорганизмы в кишечнике организованы в так называемые биопленки - микробные сообщества, сбалансированные по видовому составу и функциональному распределению членов сообщества [4,32]. Точного описания архитектуры микробного сообщества кишечника на сегодня нет. Предположительно, микроорганизмы, в количестве 10 клеток/см располагаются в пристеночном слое муцина в виде равномерно распределенных клеток на достаточно близком расстоянии (порядка размера микробной клетки) друг от друга. (Фото 1.) В толстом слое муцинового геля можно видеть другие формы микробной биопленки - в виде слоя, прикрепленного к клеткам эпителия, или отдельно расположенных конгломератов клеток (фото 2). Фото І.Скоппвиия бактерий, колонизирующих муцин толстого кишечника. (Заимствовано с сайта University of Dundee, Scotland)
Микрокопонии бактерий в биоптате примой кишки расположены вокруг эпителиальных клеток или в виде отдельных агрегатов (заимствовано с сайта University of Dundee, Scotland) Специальные исследования показали, что в биопленке, в сравнении с чистыми культурами бактерий, по иному происходят их многочисленные физиологические процессы, продукция метаболитов и биологически активных веществ [32]. Микрофлора кишечника может быть представлена как метаболически адаптативный, быстро восстанавливающийся микробный орган, который вырабатывался в процессе коэволюции, в результате взаимодействия микроорганизмов друг с другом и с макроорганизмом, и имеет преимущественно симбиотический характер [89,107]. В настоящее время, исследования, проведенные с помощью germ-free технологий (гнотобиология), позволяют получить новые и важные данные о влияниях бактерий на нормальное развитие, на становление и функционирование иммунной системы ассоциированной со слизистой кишечника, и эпителиальных клеток [134], об участии бактерий в различных биохимических процессах [114,115,116].
Важным фактором в поддержании общего гомеостаза и здоровья является определенная симбиотическая микрофлора - нормальная микрофлора [7,35]. В процессе подготовки отраслевого стандарта понятие «нормофлора» рассматривалось, как качественное и количественное соотношение разнообразных популяций микробов отдельных органов и систем, поддерживающих биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие макроорганизма, необходимое для сохранения здоровья человека». Она формирует колонизационную резистентность организма, обладает иммуностимулирующим действием, выполняет детоксикационную и пищеварительную функции, а также участвует в синтезе биологически активных органических соединений, участвующих в регуляции электролитного и кислотно-щелочного баланса в организме, уровня рН, синтезе витаминов. [5,11,13,22].
Колонизационная резистентность - механизмы, обеспечивающие постоянство и стабильность нормофлоры в определенных биотопах, защищающие этот биотоп от заселения посторонними микробами. При снижении колонизационной резистентности происходит увеличение числа и спектра патогенных бактерий, возникает возможность развития инфекционного процесса [30,74,154], чаще гнойно-воспалительного характера, которые могут быть в ряде случаев контагиозными, что имеет большое значение при возникновении внутрибольничных и внебольничных инфекций.
Хорошо известна иммуномодулирующая функция микрофлоры кишечника. Становление иммунного ответа формируется в первые часы неонатального периода под влиянием микрофлоры [52,119,83]. Исследования, проведенные на germ-free (стерильных), ex-germ-free и нормальных мышах показали, что бактериальная колонизация влияет на структуру диффузной лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником, влияет на созревание и развитие местного и системного иммунитета и регуляцию иммунной функции [69,118,134]. Бактериальные штаммы, колонизирующие кишечник, активируют иммунную систему кишечника только однократно (transiently), даже если они персистируют в кишечнике. В ответ синтезируется секреторный IgA, который предупреждает транслокацию этих микроорганизмов через слизистый, барьер кишечника [144]. Постоянная смена штаммов в микрофлоре кишечника способствует поддержанию иммунитета в активном состоянии [106]. Так, пакистанские новорожденные, которые постоянно колонизируются новыми штаммами Е. coli, имеют достаточно высокий уровень секреторного IgA против О-антигенов кишечных палочек уже ко 2 месяцу жизни, в отличие от шведских детей, у которых такой уровень достигает лишь к 1-2 годам [111]. Есть также много доказательств того, что комменсалы, приобретенные во время раннего постнатального периода, необходимы для развития толерантности не только по отношению к самим себе, но и другим просветным антигенам. Чрезмерно гигиенический образ жизни в западных странах приводит к нарушению колонизации кишечника новорожденных и как следствие к увеличению частоты аллергических заболеваний [152,153]. Различие между комменсалами и патогенными микробами осуществляется с помощью специальных рецепторов (Toll-Like), находящихся в слизистой кишечника, которые способны узнавать патоген-ассоциированые молекулярные паттерны, которые есть у большинства патогенных микроорганизмов [120, 156].
Микроорганизмами осуществляются физиологические, биохимические процессы в ЖКТ по перевариванию и всасыванию пищи: метаболизм белков, углеводов, жиров, продукция витаминов, гормонов, ряда биологических аминов. Моторная функция кишечника регулируется также микробной флорой, которая осуществляется через образование и ингибирование субстанций типа брадикинина; продукцию простагландинов; метаболизм желчных кислот с образованием метаболитов, ускоряющих моторику. Образующиеся в процессе жизнедеятельности микробов амины (гистамин,, брадикинин). регулируют сфинктерную деятельность ЖКТ [23]. Все это важно для профилактики различных заболеваний ЖКТ.
Детоксикационная деятельность кишечной микробной флоры осуществляет защиту от ксенобиотиков: пестицидов, аминов, солей тяжелых металлов, многих лекарственных средств, нитратов. Известен ряд бактерий, имеющих высокую активность нитратредуктазы (пропионобактерии, пептококки, вейлонеллы, и другие), которые предотвращают развитие метгемоглобинемии при высоком содержании нитратов. Особенно это важно у детей раннего детского возраста, имеющих высокую долю фетального гемоглобина [5,11,30].
Состав нормальной микрофлоры толстого кишечника
В микрофлоре толстого кишечника различают пристеночную и просветную флору. Она включает около 1500 различных видов микроорганизмов [4]. С помощью ГХ-МС (газовая хроматография в сочетании с масс-спектро-метрией) выявлено, что почти 50% биомассы пристеночной микрофлоры составляют актиномицеты. Около 25% микробной флоры представлено аэробными кокками (стафилококки, стрептококки, энтерококки и коринеформные бактерии). Число бифидо- и лактобацилл колеблется в пределах от 20 до 30%. Другие анаэробы (пептострептококки, бактероиды, клостридии, пропионобактерии) составляет около 10% в тонкой и до 20% в толстой кишке. На долю энтеробактерий приходится 1% от суммарной микрофлоры слизистой оболочки [33]. Микробный состав фекалий (просветная микрофлора) чрезвычайно изменчивый, не отражает многообразную картину кишечного микробиоценоза. Но на практике для диагностики дисбактериоза приходится довольствоваться сведениями всего лишь о 15-20 видах микробов, содержащихся в кале. До 90-95% микробов толстой кишки составляют анаэробы (бифидобактерии и бактероиды) и только 5-10% всех бактерий составляют строгая аэробная и факультативная флора (молочно-кислые и кишечные палочки, энтерококки, стафилококки, грибы, протей [34].
В сформировавшемся микробиоценозе 90% составляют аутохтонные представители микробиоты (облигатная микрофлора - микроорганизмы, постоянно входящие в состав нормальной микрофлоры кишечника), менее 9,5% аллохтонные (факультативная микрофлора - условно-патогенная или сапрофитная) и до 0,5% - случайные микроорганизмы (транзиторная микрофлора) [5].
Качественный и количественный состав основной микрофлоры толстого кишечника у здоровых людей представлен в таблице 1. Основные представители облигатной и факультативной микрофлоры и их значение представлены в таблице 2 [36].
К транзиторной микрофлоре относятся случайные микроорганизмы, которые могут попасть в ЖКТ (непатогенные, условно-патогенные и патогенные микроорганизмы). При нормальном состоянии микроэкологии ЖКТ эти микроорганизмы, как правило, не способны к длительному пребыванию в нем и не вызывают развитие патологического процесса. Но они могут быть переносчиками различных генетических материалов [5], например, генов лекарственной устойчивости, что имеет большое значение в возникновении штаммов микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам, которые могут стать этиологическим агентом не только различных инфекций, трудно поддающихся лечению, но и тяжелых внутрибольничных инфекций.
Неферментирующие бактерии: (Pseudomonas spp., Acinetobacter spp.) могут встречаться в кишечнике здорового человека в количестве 103 -104 КОЕ/г. Дрожжи и дрожжеподоб-ные грибы - грибы рода Candida: C.albicans и /или C.steleatoidea способны вызывать как локальное усиление бродильных процессов в кишечнике, так и различные кандидозы (молочница, стоматит, вульвовагинит и т.д., вплоть до кандидозного сепсиса). В аллергизации организма ребенка основное значение придается плесневым грибам - аспергиллам.
Таким образом, микробное сообщество кишечника организует единую генетическую систему несущую поведенческий код для членов биопленки, определяющих их пищевые, энергетические и другие связи между собой и внешним миром. Такая организация обеспечивает ее физиологическую и функциональную стабильность и, следовательно, обеспечивает гомеостаз органов, функциональность которых зависит от населяющих их микробов, что очень важно особенно для детей первого года жизни [32]. Многие характеристики организма, кажущиеся наследственными, в действительности определяются состоянием микробиоценоза, сформировавшегося на самых ранних этапах жизни ребенка. Состав кишечной микрофлоры достаточно индивидуален и начинает формироваться с момента рождения ребенка [138]. Начальная колонизация, являясь основой для дальнейшего становления микрофлоры, напрямую сопряжена с формированием защитно-приспособительных механизмов организма и определяет иммунный гомеостаз ребенка первых месяцев жизни и в последствие может влиять на здоровье детей, предрасполагая их к специфическим заболеваниям (инфекционным, аутоиммунным, психическим).
В жизни ребенка можно выделить два наиболее критических момента, оказывающих исключительное влияние на бактериальную колонизацию кишечника. Первый - при рождении ребенка, когда в течение первых нескольких суток происходит первичная колонизация стерильного кишечника, второй - когда ребенка отлучают от груди [11].
Известно, что- в период внутриутробного развития здорового плода его кишечный тракт стерилен. Первичная колонизация происходит с момента рождения. Процесс колонизации происходит в результате сложных взаимодействий на молекулярном уровне микроорганизмов с клетками кишечника (crossalk) и микроорганизмов друг с другом (quorum-sensing), которые осуществляются с помощью сигнальных молекул, действующих на систему регуляции генов рецептивных клеток [105,138,146].
Ключевым этапом колонизации является адгезия. Слизистая кишечника содержит несчетное количество потенциальных участков адгезии, при контакте с которыми бактерии адгезируются с помощью специальных структур — адгезинов. Участки адгезии генетически контролируются хозяином, следовательно, геном хозяина во многом контролирует процессы колонизации теми или иными микроорганизмами [63,134].
Микроорганизмы, способные метаболизировать сложные углеводы, имеют экологическое преимущество, так как они имеют прямой доступ к источникам энергии. Расщепляя сложные углеводы на моносахариды, они способствуют росту микроорганизмов, способных утилизировать моносахариды. Микроорганизмы, колонизирующие кишечник первыми, обладая гликолитическими способностями, создают новые участки адгезии, способствуя другим микроорганизмам связываться со слизистой кишечника [63,134]. Есть также другие механизмы, с помощью которых микроорганизмы адгезируются, например, некоторые штаммы энтеропатогенных кишечных палочек способны связываться с клетками кишечника с помощью протеина интимин после транслокации ими рецептора для интимина (Тіг) в клеточную мембрану энтероцита [105].
Основные этапы и эпидемиологические аспекты колонизации кишечника новорожденного
Некоторые авторы (Cooperstok, Zedd) в формировании кишечной флоры различают 4 фазы: I - первые 1-2 недель, II - период только грудного кормления, III - период начала прикорма до окончания грудного кормления, IV - период перехода детской микрофлоры во взрослую [68].
Считается, что мать является основным источником микрофлоры, заселяющей кишечник. Во время родов происходит первичная контаминация организма ребенка, в норме стерильного до рождения, вагинальной микрофлорой [30]. Состав вагинальной микрофлоры роженицы в последующем определяет состав микрофлоры конъюктивы, желудочного аспирата, кожных покровов, которые идентичны микрофлоре родового канала матери [64, 139].
Некоторые исследования показывают, что непосредственно после родов у большинства новорожденных из носоглотки высевали те же микроорганизмы, что были высеяны из влагалища матери перед родами [60,64,110,139].
Вместе с тем, при сравнении плазмидных профилей изолятов лактобактерий, бифидобактерий и энтеробактерий, выделенных из влагалища, кишечника и ротовой полости женщин, при поступлении в роддом, с плазмидными профилями микроорганизмов, выделенных из кишечника детей на 10-ый день, было выявлено, что микрофлора влагалища матери не была представлена среди бактерий, преобладающих в фекалиях детей. Бактерии, выделенные из влагалища матерей отличались от бактерий, выделенных из кишечника их детей [149].
Исследования ученых показали, что непосредственно после родов из ротовой полости новорожденных и фекалий матерей высевали E.coli одинакового серотипа [64]. Передача E.coli происходит при нормальных родах: 45% новорожденных, родившихся естественных путем и только 12%, родившихся путем кесарева сечения к 3 дню имели E.coli в кишечнике. Это предполагает, что около одной трети новорожденных получают Е. coli от своих матерей при родах [129,147]. При других исследованиях передача штаммов энтеробактерий и бифидобактерий была установлена в 4 из 5 [149]. Таким образом, эти данные показывают, что первичным источником колонизации кишечника детей представителями нормальной микрофлоры является мать. В современных условиях характер первичной микробной колонизации претерпел негативные изменения - снижение частоты колонизации микроорганизмами облигатной флоры и повышение частоты колонизации условно-патогенными микроорганизмами. Это связано с увеличение контингента женщин с перинатальными факторами риска, обусловленное этим осложненное течение беременности (гестозы, угрозы прерывания беременности) и нарушения микроэкологического статуса (бактериальные вагинозы, дисбиоз кишечника), а также неполноценность питания, возрастание стрессовых воздействий, экологическое неблагополучие и бесконтрольное применение антибиотиков [45]. Согласно некоторым данным даже среди доношенных детей, получающих материнское молоко, к восьмому дню жизни оптимальный уровень бифидобактерий отмечается лишь у 63,3%, более 30% «практически здоровых» детей раннего возраста имеют сниженное содержание бифидобактерий в кишечнике [6].
В последние годы внимание исследователей все чаще привлекают вопросы, связанные со значением микрофлоры матери в осуществлении естественной динамики развития иммунитета у новорожденного ребенка [43].
Если во время первой фазы ребенок не колонизируется необходимыми микроорганизмами, обеспечивающими колонизационную резистентность (бифидо- и лактобактерии), то возникает риск колонизации кишечника условно-патогенными микроорганизмами окружающей среды. Дети, рожденные путем кесарева сечения, в начале заселяются1 микробами окружающей среды - оборудования, воздуха, инструментов, медперсонала и-других детей: стафилококками, клебсиеллами, протеями, грибами рода Candida и другими микробами (таблица 4) [60,84,90,100,101,123,139]. После рождения они заселяются микробами матери, передача которых происходит механически при кормлении, при уходе и др. При этом микрофлора кишечника детей, рожденных путем кесарева сечения, характеризуется нехваткой облигатных анаэробов и преобладанием в кишечном тракте факультативных анаэробов, таких как Clostridium spp. в течение 2 недель, а дальнейшее заселение зависит от типа питания [123,135]. Различие в составе микрофлоры кишечника детей, родившихся естественным путем и путем кесарева сечения, может наблюдаться и после периода новорожденности (таблица 5) [138].
После рождения формированию нормальной микрофлоры новорожденного ребенка способствует раннее (в течение получаса после рождения) прикладывание к груди и последующее грудное вскармливание [44]. В течение первой недели независимо от типа питания доминирующими микроорганизмами являются энтеробактерии (E.coli) и стрептококки, количество которых достигает максимума к 3 дню и может составить Ю8-1010/г фекалий [72,135]. Предполагают, что эти микробы к 4-7 дню создают анаэробные условия для роста облигатных анаэробов: Bacterodies, Bifidobacterium, Clostridium и др. [148]. В дальнейшем, у детей, получающих грудное молоко, количество энтеробактерии снижается и к 6 дню составляет 10 г/ фекалий, а количество бифидобакерий начинает повышаться после 2-3 дня и к 6-ому дню составляет 10 /г фекалий. То есть, уже к 6-ому дню бифидобактерии доминируют над остальными микроорганизмами, что ассоциировано с такими положительными эффектами для детского организма, как устойчивость к инфекционным заболеваниям и правильное развитие механизмов иммунного ответа. У детей, находящихся на искусственном питании, несмотря на увеличение количества бифидобакерий, количество энтеробактерий остается и к 6-ому дню высоким и преобладает над количеством бифидобактерий (10:1). Кроме того, по данным Stark P.L.H A.Lee частота высева бифидобактерий из кишечника детей получающих грудное молоко и искусственное питание составляет соответственно 84% и 62%. [148]. По другим данным частота высева бифидобактерий на 4 день после рождения составляет 48% у детей, получающих грудное молоко, и 15% у детей, находящихся на искусственном питании [136]. К 1 месяцу бифидобактерий становятся доминирующими у обеих групп, но у детей, получающих искусственное питание, количество энтеробактерий остается высоким [158]. Кроме того, у последних высевается также больше такие бактерии как бактероиды, пептококки, вейлонеллы, клостридии, стрептококки, бациллы (таблица 6) [58,139].
Данные разных ученых о содержании тех или иных видов бифидобактерий в кишечнике этих двух групп разные. Согласно данным Веппо Y., у обеих групп наиболее часто высеваются в больших количествах B.breve [58]. В других работах показано, что у детей на грудном вскармливании преобладают B.infantis с В.Iongum и B.bifidum [117]. В других исследованиях B.breve наиболее часто высевали из кишечника детей получающих грудное молоко, а В.Iongum и B.adolescentis из кишечника детей находящихся на искусственном питании. То есть у детей, получающих искусственные смеси, микрофлора больше похожа на микрофлору взрослых [112,139].
У детей получающих смешанное питание (грудное + искусственное) состав микрофлоры похож на средний состав двух групп.
Состав кишечной флоры зависит от физико-химических параметров пищи и фекалий, например показателей рН и буферной способности. Фекалии детей, получающих грудное питание, имеют низкие рН и буферную способность по сравнению с фекалиями детей получающих искусственные смеси (буферная способность последних в 2 раза выше). Кислая среда, благоприятна для роста бифидобактерий и неблагоприятна для роста потенциально патогенных микробов, что уменьшает возможность развития заболеваний, причиной которых являются эти микроорганизмы [158].
Чувствительность к антибиотикам и бактериофагам штаммов S.Aures и Klebsiella SPP., выделенных из кишечника детей
Для изучения роли внутрибольничных штаммов в колонизации кишечника детей, нами была изучена чувствительность к антибиотикам штаммов золотистых стафилококков и бактерий рода Klebsiella, выделенных из кишечника детей 1-го года жизни .
Изучение антибиотикограмм изолятов золотистого стафилококка, показало, что среди 620 штаммов 23,7% были устойчивы к одному антибиотику, 21,6% обладали множественной лекарственной устойчивостью. При этом среди полирезистентных штаммов, то есть устойчивых к 5 и более антибиотикам, 73,4% были резистентны к оксациллину или метициллину (ORSA или MRSA). Штаммы, чувствительные ко всем антибиотикам составили самый низкий процент - 9,9%.
Изучение антибиотикограмм бактерий рода Klebsiella, выделенных из кишечника детей 1 -го года жизни, показало, что среди 152 штаммов преобладали штаммы с множественной лекарственной устойчивостью - 74,4%. При этом в динамике наблюдали уменьшение количества клебсиелл с множественной лекарственной устойчивостью.
Большинство штаммов клебсиелл были устойчивы к ампициллину (95,%), аугментину (75,5%), фурагину (70,7%), канамицину (68,1%) и чувствительны к абакталу (1,1%-резистентны) и ципрофлоксацин (1,5%-резистентны), а также к цефтриаксону (9,3%-резистентны) (рис.12). Динамика изменения устойчивости представлена в таблице 11. Наблюдается повышение устойчивости по отношению к фторхинолонам.
Полирезистентные штаммы бактерий рода Klebsiella также различались между собой по антибиотикограммам. Так из 72 полирезистентных штаммов клебсиелл 3 штамма (4%) были чувствительны к аминогликозидам, 59 (82%) - к ципрофлоксацину, 64 (89%) - к фторхинолонам.
Так как, одним из методов лечения дисбиозов у детей первого года жизни является фаготерапия, нами была изучена также чувствительность штаммов золотистого стафилококка и бактерий рода Klebsiella к специфическим бактериофагам. Установлено, что к интестифагу были устойчивы в среднем 55% стафилококков, к пиофагу поливалентному-37,8%, к стафилококковому фагу - 36% (рис. 13).
В динамике отмечено повышение устойчивости штаммов S.aureus к интестифагу, пиофагу и стафилококковому фагам по сравнению с предыдущими годами. Так, в 1999 году устойчивых культур к интести-, пиофагу и стафилококковому фагам выявлено 27,7%, 26,7%, 25,5%, в 2002 году - 32,2%, 34%, 18,6%, а 2003 году-97%, 96%, 96% соответственно.
Проведенные исследования показали, что штаммы клебсиелл характеризуются устойчивостью ко многим антибактериальным препаратам и только 1,5% штаммов были чувствительны ко всем антибиотикам. Удельный вес S. Aureus, чувствительных ко всем антибиотикам, составил 9,9 %.
Установлено, что большинство клебсиелл устойчивы к ампициллину, доксициклину, аугментину, фурагину, канамицину и чувствительны к фторхинолонам (абакталу и ципрофлоксацину), а также к цефтриаксону. В динамике отмечен рост количества штаммов устойчивых к фторхинолонам.
Большинство штаммов S. aureus были резистентны к ампициллину и чувствительны к офлоксацину, абакталу и рифампицину. Штаммы устойчивые к оксациллину (ORSA или MRSA) были в основном полирезистентными. Причем.они быличувствительны к.рифампицину и к фторхинолонам.
В литературе описано достаточно большое количество наблюдений, свидетельствующих о способности различных антибиотиков даже при парэнтеральном введении, и использовании их в терапевтических дозах вызывать существенные нарушения в микроэкологии кишечника ребенка. Поэтому антибактериальную терапию дисбактериозов следует проводить, когда условно-патогенные микробы мало чувствительны к бактериофагам, сочетая с лечением пробиотиками. Изучение чувствительности S.aureus и бактерий рода Klebsiella к специфическим бактериофагам показало, что к пиобактериофагу были чувствительны 62,3% штаммов S.aureus, к интести - 45% штаммов S.aureus и 9,2% штаммов клебсиелл, к стафилококковому фагу были чувствительны 64% штаммов S.aureus, к клебсиеллезному фагу - 9,9% штаммов клебсиелл. Из этих данных видно, что чувствительность клебсиелл к фагам значительно ниже, чем у штаммов золотистого стафилококка к соответствующим фагам.
Данные по изучению спектра устойчивости к антибиотикам и чувствительности к специфическим бактериофагам подтверждают необходимость определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам и к фагам перед началом антибиотико- и фаготерапии.
Согласно нашим исследованиям у 21,6% детей штаммы золотистого стафилококка и у 74,4% детей штаммы клебсиелл имеют госпитальное происхождение, поэтому в этих медицинских учреждениях необходимо регулярно проводить профилактические мероприятия для предупреждения колонизации кишечника детей условно-патогенными внутрибольничными штаммами.
Для проведения эпидемиологического исследования, с целью выявления источника колонизации, механизма передачи, раскрытия механизмов циркуляции штаммов возбудителей, необходимо не только идентификация возбудителей, но и их дифференциация и типирование. В этой связи нами были фаготипированы (международным набором стафилококковых фагов - 23 фага) 75 штаммов S.aureus, выделенных из кишечника детей, обследованных в КДЦ «Ниармедик+» и 25 штамма S.aureus, выделенных из кишечника детей, обследованных в 15 ГКБ.
То есть, у детей 1-го года жизни из кишечника выделялись \ преимущественно штаммы S.aureus III фагогруппы, которые преобладают среди штаммов, выявленных в стационарах Москвы. Следовательно, можно предположить внутрибольничное происхождение этих штаммов. Дальнейший анализ фагопейзажа кишечных стафилококков показал, что среди фаготипируемых штаммов установлено 17 фаготипов, что предполагает существенное число потенциальных источников инфицирования. штаммов бактерий рода Klebsiella были типированы биохимическим методом с использованием тест-системы "ENTERO - 26". При этом 13 (44,8%) из них являлись K.pneumoniae и 16 (55,2%) K.oxytoca.
Для более точного субвидового типирования и анализа генетического родства (выявления клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, нами были генотипированы методом RAPD-ПЦР 30 штаммов S.aureus и 29 штаммов Klebsiella spp. (рис.16 и 17).
Изучение электрофоретических профилей, полученных в результате RAPD-PCR 29 штаммов клебсиелл, выявило 27 геновариантов с количеством от 3 до 10 амплифицированных фрагментов, длиной от 150 до 1700 Ьр. 11 штаммов образовали по 6 полос, 3 штамма - по -7, 4 - по - 4, 2 - по - 3. Фрагмент длиной около 580 Ьр была у 23 штаммов, длиной 620 Ьр - у 18 штаммов и 340 Ьр - у 12 штаммов (рис.16).
