Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
2. Материалы и методы исследования
3. Собственные данные
3.1. Гистологическая характеристика фолликулярных опухолей щитовидной железы
3.2. Морфометрическая характеристика основных структурных компонентов новообразований щитовидной железы
3.3. Характеристика пролиферативной активности фолликулярных опухолей щитовидной железы
3.4. Особенности экспрессии галектина-3 в фолликулярных опухолях щитовидной железы
3.5. Оценка экспрессии НВМЕ-1 в фолликулярных опухолях щитовидной железы
3.6. Экспрессия цитокератина 19 в фолликулярных опухолях щитовидной железы
3.7. Экспрессия bcl-2 и р53 в фолликулярных опухолях щитовидной железы
3.8. Характеристика активности тиреоидной пероксидазы в фолликулярных опухолях щитовидной железы
3.9. Экспрессия ламинина в фолликулярных опухолях щитовидной железы
3.10. Корреляционный анализ
4. Обсуждение собственных данных
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы
- Гистологическая характеристика фолликулярных опухолей щитовидной железы
- Морфометрическая характеристика основных структурных компонентов новообразований щитовидной железы
- Особенности экспрессии галектина-3 в фолликулярных опухолях щитовидной железы
- Экспрессия bcl-2 и р53 в фолликулярных опухолях щитовидной железы
Введение к работе
Актуальность темы. В современной тиреоидологии особого внимания заслуживают вопросы, возникающие при диагностике фолликулярных микрокарцином и гиперцеллюлярных аденом. В качестве гиперцеллюлярных аденом рассматривают фолликулярные аденомы фетального и эмбрионального строения, а также атипические аденомы, которые, по мнению ряда авторов, следует относить в группу «пограничных» опухолей щитовидной железы с «неопределённым потенциалом злокачественности» [Чазова Н.Л. и др., 1997; Казанцева И.А. и др., 2001; Хмельницкий O.K., 2002; Душников Е.Ф. и др., 2003; Hofinan V. et al., 2008].
Ведущая роль в диагностике данных опухолей принадлежит гистологическому исследованию, позволяющему выявить признаки злокачественности [Краевский Н.А. и др., 1993; Хмельницкий O.K., 2002].
Фолликулярный рак, обладая высокой степенью органотипичности, характеризуется наличием высокодифференцированных структур с умеренной атипией без выраженного полиморфизма опухолевых клеток, что в целом характерно и для фолликулярных аденом фетального и эмбрионального строения [Заридзе Д.Г., 1980; Хмельницкий O.K., 2002; Baloch Z.W., LiVolsi V.A., 2002; DeLellis R.A. et al, 2004; Fonseca E. et al, 2006; Faquin W.C., 2008].
С другой стороны, в фолликулярной карциноме и атипической аденоме в равной степени могут встречаться проявления как тканевого, так и клеточного атипизма, являющегося признаком злокачественности [Хмельницкий O.K., 1987]. В щитовидной железе, к сожалению, эти признаки могут представлять диагностическую ценность только в совокупности с другими объективными критериями злокачественности, тшсими, кшс высокая митотическая активность опухолевых клеток и наличие в опухоли некрозов, что для дифференцированных форм рака мало характерно [Бомаш Н.Ю., 1981; Хмельницкий O.K., 2002].
Общепризнанным абсолютным критерием степени злокачественности фолликулярных микрокарцином щитовидной железы служит инвазия в капсулу опухоли и/или сосуды, то есть тотальное прорастание опухолью собственной капсулы и/или сосудистой стенки, в процессе инвазии которой патогномоничным признаком являются выступающие в просвет сосуда опухолевые структуры, покрытые слоем эндотелиальных клеток [Заридзе Д.Г., 1980; Хмельницкий O.K., 2002; Лушников Е.Ф. и др., 2003; Baloch Z.W., LiVolsi V.A., 2002; DeLellis R.A. et al., 2004]. Однако классический гистологический способ выявления абсолютных признаков злокачественного роста при изучении фолликулярных новообразований щитовидной железы не всегда приносит должного результата [Hofrnan V. et al., 2008].
Для диагностики фолликулярных опухолей щитовидной железы рядом авторов был рекомендован широкий спектр иммуногистохимических маркеров: тиреоидная пероксидаза, галектин-3, цитокератин 19, тиреокальцитонин, тиреоглобулин, TTF-1, RET, НВМЕ-1, CD15, CD44, PAX8-PPAR gamma 1, р27, кератин-сульфат pabbs D.J., 2002; DeLellis R.A. et al, 2004; Vielh P., 2007].
Однако в процессе иммуногистохимического исследования фолликулярного рака чаще всего применяется достаточно узкий спектр маркеров без проведения сравнительного анализа в зависимости от стадии опухолевой прогрессии.
В литературе проблема дифференциальной диагностики фолликулярного рака и гиперцеллюлярных аденом не получила должного освещения. Из-за отсутствия чётких морфологических критериев фолликулярная карцинома ошибочно может быть принята за фолликулярную аденому и наоборот. Для решения существующей проблемы дифференциальной диагностики фолликулярных опухолей щитовидной железы необходимо провести комплексное морфологическое исследование гиперцеллюлярных аденом и карцином щитовидной железы с фолликулярноклеточной дифференцировкой, учитывая особенности гистологического строения и размер опухоли с выявлением диагностических критериев. В соответствии с этим, цель настоящего исследования была сформулирована следующим образом.
Цель исследования. Изучение и сравнительная оценка гистологических, морфометрических и иммуногистохимических особенностей фолликулярных опухолей щитовидной железы разной степени злокачественности, выявление и обоснование дифференциальнодиагностических критериев.
Основные задачи исследования.
1. Провести сравнительный морфометрический анализ паренхиматозного и стромально-сосудистого компонентов изучаемых фолликулярных опухолей щитовидной железы в зависимости от гистологического строения и размера.
2. На основании иммуногистохимического исследования изучить и оценить пролиферативную активность, ангиогенез, целостность базальных мембран, активность тиреоидной пероксидазы; выявить особенности экспрессии цитокератина 19; оценить значение экспрессии bcl-2 и р53, а также роль галектина-3 и НВМЕ-1 в дифференциальной диагностике фолликулярных опухолей щитовидной железы.
3. Провести сравнительный анализ с выявлением корреляционных связей между изучаемыми морфометрическими и иммуногистохимическими показателями.
4. Оценить возможность использования полученных результатов в качестве дифференциальных критериев в диагностике фолликулярных опухолей щитовидной железы.
Положения, выносимые на защиту
1. Для дифференциальной диагностики между атипической фолликулярной аденомой и микрокарциномой щитовидной железы рационально использовать галектин-3, НВМЕ-1, PCNA, Ki-67, тиреоидную пероксидазу, Ьс1-2ир53.
2. Фолликулярные опухоли щитовидной железы харшсгеризуются различной пролиферативной активностью, экспрессией тиреоидной пероксидазы, НВМЕ-1, галектина-3, цитокератина 19, bcl-2 и р53, средние показатели которых не зависят от размера новообразования, но связаны с особенностями их гистологического строения.
3. Галектин-3 не следует считать универсальным маркером в диагностике фолликулярного рака, так как в отдельных наблюдениях фолликулярной макрокарциномы (при наличии инвазии в сосуды и собственную капсулу) установлено значительное снижение его экспрессии, составляющей около
30% позитивно окрашенных опухолевых клеток.
4. Атипические фолликулярные аденомы щитовидной железы обладают высоким потенциалом озлокачествления, что подтверждено экспрессией галектина-3 и НВМЕ-1 при достаточно низкой пролиферативной активности данных новообразований.
5. Гиперцеллюлярные аденомы щитовидной железы характеризуются высоким уровнем экспрессии тиреоидной пероксидазы, низким уровнем экспрессии PCNA, Ki-67, bcl-2 и отрицательной реакцией к р53, что может быть использовано в целях ранней диагностики рака щитовидной железы.
6. Карциномы щитовидной железы, по сравнению с фолликулярными аденомами, характеризуются повышенной продукцией ламинина, значение экспрессии которого в диагностике фолликулярных опухолей щитовидной железы требует дополнительных исследований.
Научная новизна исследования заключается в комплексном применении современных морфологических методов исследования, позволивших провести дифференциальную диагностику между микрокарциномой щитовидной железы, имеющей фолликулярное строение и атипической фолликулярной аденомой размером, соответствующим микрокарциноме, в процессе исследования которых установлена диагностическая значимость галектина-3, НВМЕ-1, PCNA, Ki-67, тиреоидиой пероксидазы, bcl-2 и р53.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
В работе определены иммуногистохимические маркеры, позволяющие проводить дифференциальную диагностику фолликулярных опухолей щитовидной железы. Полученные данные могут быть использованы в практической деятельности патологоанатомических отделений.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты, полученные в ходе исследования, используются в комплексе мероприятий по дифференциальной диагностике фолликулярных опухолей щитовидной железы в учебном процессе кафедры патологической анатомии и в работе патологоанатомического отделения СП6ТМУ им. акад. И.П. Павлова.
Апробация диссертации и публикации. Результаты диссертационного исследования вошли в доклады, сделанные на конференции «Современные проблемы клинической цитоморфологии», научные чтения, посвященные памяти O.K. Хмельницкого и 25-летию курса цитологии кафедры патологической анатомии в 2007 году и заседании общества патологоанатомов Санкт-Петербурга в 2008 году. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.
Гистологическая характеристика фолликулярных опухолей щитовидной железы
Щитовидная железа, являясь самой крупной эндокринной железой, вырабатывает йодсодержащие тиреоидные гормоны, которые регулируют активность метаболических реакций и процессы развития в организме человека. Её гистологическое строение типично для желёз внутренней секреции и гетерогенно по происхождению. Структурно-фушсциональная единица -тиреоидный фолликул - находится в тесной связи с кровеносной системой, представлен в виде мешочка, выстланного одним слоем эпителия и заполненного коллоидом [Хмельницкий O.K., 2002].
Фолликулярный (тиреоидный) эпителий представлен тироцитами / А— клетками [Краевский Н.А. и др., 1975], которые выстилают просвет фолликулов (интрафолликулярный эпителий) или располагаются вне фолликулов (интер-или экстрафолликулярный эпителий). А-клетки происходят из энтодермы и вырабатывают тиреоглобулин, содержащий активные тиреоидные гормоны: трийодтиронин и тироксин.
Клетки Асканази (Askanazy) (онкоциты, оксифильные клетки) или В-клетки [Краевский Н.А. и др., 1975] - крупные с эозинофильной цитоплазмой, могут полностью или частично выстилать фолликулы или образовывать мелкие фолликулы и характеризуются высокой активностью сукцинатдегидрогеназы [Хмельницкий O.K., 1999]. Описано два типа клеток Асканази: клетки первого типа, имеющие эозинофильную зернистую цитоплазму и клетки второго типа, характеризующиеся слабо выраженной эозинофильной цитоплазмой. [Петров СВ., Райхлин Н.Т., 2004]. По современным представлениям В-клетки имеют общий источник происхождения с фолликулярными А-клетками.
С-клетки (светлые парафолликулярные клетки) крупного размера со светлой цитоплазмой располагаются обычно группами между фолликулами в виде островков или в стенке фоллшсула, но отграничены от его полости фоллшсулярными клетками и характеризуются отсутствием способности поглощать йод [Хмельницкий O.K., 1999]. Вопрос генеза С-клеток весьма спорен: помимо происхождения из нервного гребня рассматривается вопрос о происхождении данных клеток из энтодермы [Rosai J. et al., 1992]. Парафолликулярные клетки относятся к APUD-системе: С-клетки захватывают из крови предшественники аминов, декарбоксилируют их до соответствующего амина и накапливают вместе с кальцитонином в гранулах [Хмельницкий O.K., 2002].
Опухоли щитовидной железы происходят из четырёх типов клеток, имеющих свои гистохимические и функциональные особенности.
Фолликулярные А-клетки дают начало папиллярным и фолликулярным карциномам разной степени дифференцировки.
Фолликулярные В-клетки (клетки Асканази-Гюртля) чаще всего дают начало фолликулярным карциномам с тенденцией к солидизации, и реже из них формируется папиллярный рак.
Опухоль из С-клеток представлена медуллярной карциномой, опухолевые клетки которой формируют фолликулярные, папиллярные, солидные, мелкоклеточные и другие структуры. Аденому щитовидной железы из С-клеток эксперты комиссии ВОЗ в ходе пересмотра гистологической классификации опухолей щитовидной железы в 1986 году не рекомендовали выделять (исключением является лишь гиперплазия С-клеток) [Хмельницкий О.К., 2002].
Существенную проблему представляют смешанные раки (фолликулярно-парафолликулярные карциномы) [Papotti М. et al., 2000], которые встречаются крайне редко и характеризуются крайне агрессивным течением [Петров СВ., Райхлин Н.Т., 2004].
По поводу происхождения смешанных карцином было выдвинуто несколько гистогенетических гипотез: стволовая клетка щитовидной железы под влиянием различных факторов даёт начало клеткам с фолликулярной и С— клеточной дифференцировкой; клетки медуллярной карциномы вследствие молекулярных нарушений приобретают фолликулярно-клеточную дифференцировку; неопластическая трансформация происходит одновременно как с фолликулярно-клеточным, так и с С-клеточным компонентами [Лушников Е.Ф. и др., 2003]. Четвёртую группу составляют клетки нетиреоидного происхождения, инициирующие развитие лимфомы.
Этиопатогенез опухолей щитовидной железы
По данным литературы возникновение новообразований щитовидной железы определяется морфофункциональными особенностями организма и факторами окружающей среды. Причины, способствующие возникновению и развитию рака щитовидной железы, принято разделять на две группы: экзогенные и эндогенные.
Среди канцерогенных факторов экзогенного характера первое место занимают ионизирующие излучения [Дедов В.И. и др., 1993; Дедов И.И. и др., 1996; Демидчик Е.П. и др., 1996; Абросимов А.Ю. и др., 2001; Хмельницкий O.K., 2002; Лушников Е.Ф. и др., 2006; Williams E.D., 2002]. Эпителий щитовидной железы обладает высокой радиочувствительностью. Развитие опухоли щитовидной железы может быть результатом как внешнего облучения, так и следствием приёма радионуклидов (йода-131). В настоящее время понятие «радиогенный рак щитовидной железы» широко известно. Продолжительность латентного периода развития радиоиндуцированных карцином щитовидной железы зависит как от возраста больного на момент облучения (наиболее чувствительные категории - дети и подростки до 18 лет), так и от дозы облучения. Радиоиндуцированные карциномы представлены преимущественно высокодифференцированными формами А-клеточного рака (папиллярные и фолликулярные карциномы в соотношении 3:1) [Седов В.М., СедлецкийЮ.И., Рыбакова М. Г., 2001].
Морфометрическая характеристика основных структурных компонентов новообразований щитовидной железы
Гистологическая классификация опухолей щитовидной железы ВОЗ Папиллярная карцинома 8260/3 Фолликулярная карцинома 8330/3 Низкодифференцированная карцинома Недифференцированная (анапластическая) карцинома 8020/3 Плоскоклеточная карцинома 8070/3 Мукоэпидермальная карцинома 8430/3 Склерозирующая мукоэпидермальная карцинома с эозинофилией 8430/3 Муцинозная карцинома 8480/3 Медуллярная карцинома 8345/3 Смешанная медуллярно-фолликулярноклеточная карцинома 8346/3 Веретеноклеточная опухоль с тимусоподобной дифференцировкой 8588/3 Фолликулярная аденома 8330/0 Микр о фолликулярная аденома 8333/0 Макр о фолликулярная аденома 8334/0
Гиалинизирующая трабекулярная опухоль 8336/ 3. Классификация Международного Противоракового Союза по системе TNM (шестое издание; 2002г.). Классификация применима только к карциномам, которые должны иметь гистологическое подтверждение и оценку по категориям TNM: Т — распространение первичной опухоли (размер первичной опухоли увеличен до 2 см, вместо ранее существовавшей в 1 см), при ТІ в наибольшем измерении соответствует 2 см; N - отсутствие или наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах и степень их поражения; М отсутствие или наличие отдаленных метастазов. В патологоанатомической классификации категории рТ, pN, рМ соответствуют категориям клинической классификации TNM. При pNO - отсутствие метастазов при гистологической оценке не менее шести лимфатических узлов [Лушников Е.Ф. и др., 2003].
4. Международная гистологическая классификация опухолей щитовидной железы (второе издание) 1986 года.
Помимо международных классификаций существуют и другие классификации рака щитовидной железы морфологического характера. Rosai J. (1992) выделяет три группы опухолей: фолликулярно-клеточной дифференцировки, С-клеточной дифференцировки и смешанной фолликулярной и С-клеточной дифференцировки. DeLellis R.A. и Williams E.D. (2004) эпителиальные злокачественные опухоли щитовидной железы разделили на группы: папиллярный, фолликулярный, медуллярный и недифференцированный (анапластический) рак, в каждом из которых были выделены различные варианты [Лушников Е.Ф. и др., 2006].
Особое место среди опухолей щитовидной железы занимают микрокарциномы (маленькие раки). Микрокарцинома щитовидной железы -это злокачественная опухоль, размер которой по данным описанным в литературе варьирует от 0,1 см до 1 см (в соответствии с критериями классификации ВОЗ, 1986) и 1,5 см [Гольдбурт Н.Н. и др., 1996; Nasir A. et al., 2000]. По свидетельству G.H. Klinck и Т. Winship (1955) впервые микрокарцинома щитовидной железы была описана A. Graham в 1927 году как солидная, неинкапсулированная опухоль. В 1949 году J. Hazard и соавт. при описании небольших злокачественных опухолей щитовидной железы предложили для них термин «неинкапсулированные склерозирующие опухоли» [Лушников Е.Ф. и др., 2003]. В 1960 году J. Hazard в статье «Small papillary carcinoma of the thyroid» дал подробное описание опухолей папиллярного строения размером в 1,5 см и меньше [Hazard J., 1960]. При описании поражений щитовидной железы при токсическом зобе W.H. Minder (1952) использовал термин «микрокарцинома» [Лушников Е.Ф. и др., 2003]. Позже G.H. Klink и Т. Winship (1955) для маленького рака предложили термин «скрытая склерозированная карцинома». При описании случаев папиллярного рака малых размеров Woolner L.B. et al. (1960) применил к данным опухолям термин «оккультная» карцинома. По мнению Н.Т. Райхлина и соавт. (1976) в качестве «маленького рака» щитовидной железы (скрытые, оккультные или склерозирующие микрокарциномы) следует рассматривать злокачественные опухоли размерами от 0,1 до 1,5 см в диаметре [Хмельницкий O.K., 2002; Лушников Е.Ф. и др., 2003]. В монографии Н.Ю. Бомаш (1981) относит к «маленьким ракам» щитовидной железы узлы дифференцированного рака размером меньше 1 - 1,5 см.
Официальным «годом рождения» термина «микрокарцинома» является год принятия второго пересмотра классификации опухолей щитовидной железы (1986). По данным литературы [Заридзе Д.Г., Пропп P.M., 1973; Бомаш Н.Ю, 1981; Пачес А.И, Пропп P.M., 1995; Лушников Е.Ф. и др., 2003] основной гистологической формой микрокарциномы является папиллярный рак, имеющий как классическое сосочковое строение, так и его фолликулярный вариант [Хмельнищсий O.K., 2002]. В доступной зарубежной и отечественной литературе предоставлено мало информации о фолликулярной микрокарциноме. Фолликулярный рак редко диагностируется на стадии микрокарциномы и связано это, как правило, со стёртым клиническим течением и особенностями метастазирования, а именно высокой склонностью к диссеминации в отдаленные органы [Колосов А.Е., Захарьян А.Г., 1995; Хмельницкий О.К., 2002; Franssila К.О., 1973; Grebe S.K., Hay ID., 1995].
В процессе разработки гистологической классификации новообразований щитовидной железы для выделения «маленького рака» в самостоятельную группу комиссией экспертов ВОЗ были рассмотрены термины «склерозиругащая микрокарцинома» и «неинкапсулированная склерозирующая опухоль». В рекомендациях группы экспертов ВОЗ (второй пересмотр классификации опухолей щитовидной железы (1986)) указывается, что к папиллярной микрокарциноме относят опухоли размером до 1 см или менее в диаметре [Хмельницкий O.K., 2002].
Особенности экспрессии галектина-3 в фолликулярных опухолях щитовидной железы
Иммуногистохимическое исследование было проведено в 72 наблюдениях: фолликулярные аденомы преимущественно эмбрионального и фетального строения (п=20), атипические фолликулярные аденомы (п=10), микрокарциномы (п=10), фолликулярный рак (п=12), фолликулярный вариант папиллярного рака (п=10), папиллярный рак с классическим сосочковым строением (п=10).
Для иммуногистохимического исследования использовали: Mouse monoclonal antibody NCL-GAL3, Mouse monoclonal antibody RTU-END (CD34), Mouse monoclonal antibody RTU-Ki67-MM1, Mouse monoclonal antibody NCL-LAMININ (Novocastra Laboratories Ltd.); Monoclonal Mouse Anti-Human, bcl-2 Oncoprotein, Monoclonal Mouse Anti-Human p53 Protein (Dako); Monoclonal Mouse Anti-Human Thyroid Peroxidase (TPO), Monoclonal Mouse Anti-Rat Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), Monoclonal Mouse Anti-Human Mesothelial Cell (HBME-1) (DakoCytomation); Anti-Human Cytokeratin 19 (BioGenex) (таблица 3). Срезы с парафиновых блоков толщиной 5мкм монтировали на предметные стекла, предварительно обработанные адгезивом HistoGrip фирмы Zymed. Срезы отводили от парафина путем проведения через ксилол (3 ёмкости по 5 минут) и спирт 96 (3 ёмкости по 5 минут), далее срезы промывали в течение 5 минут в дистиллированной воде. Для активации молекулярных группировок исследуемых антигенов применялась термическая обработка срезов в водяной бане. Для этого срезы помещали в раствор цитрата натрия (2,93г цитрата натрия растворяли в дистиллированной воде до 1000 мл раствора при рН=6,5) и кипятили в течение 30 минут. Далее срезы промывали в дистиллированной воде в течение 5 минут. Следующим этапом проводили блокирование эндогенной пероксидазы путём нанесения на срезы 1-2 капель готового раствора эндогенной пероксидазы (Peroxidase Blocking Reagent - DakoCytomation) с экспозицией десять минут и последующим промыванием срезов в дистиллированной воде в течение 10 минут. Затем срезы помещали в раствор официнального трис-буфера (Tris-Buffered Saline - DakoCytomation) на десять минут.
Одним из основных моментов было нанесение на срезы моноклональных антител к галектину-3, CD34, Ki-67, ламинину (Novocastra Laboratories Ltd.); bcl-2, p53 (Dako); тиреоидной пероксидазе, PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), мезотелиальному антигену HBME-1 (DakoCytomation) и цитокератину 19 (BioGenex). Экспозиция антител к антигенам PCNA, CD34, Ki-67, р53, НВМЕ-1 составила 10 минут; к цитокератину 19, тиреоидной пероксидазе (в разведении 1:50), bcl-2 - 30 минут; к галектину-3 (1:100) и ламинину (1:50) - 60 минут. После взаимодействия с антителами срезы промывали в растворе официнального трис-буфера в течение 10 минут. В качестве системы детекции применялась полимерная система EnVision (фирма Dako) с экспозицией 30 минут. Далее срезы промывали в течение 10 минут в растворе официнального трис-буфера.
На следующем этапе на срезы наносили хромогенный субстрат (DakoCytomation), в качестве которого использовали приготовленный непосредственно перед применением раствор диаминобензидина (1 капля ДАВ-хромогенного субстрата на 1 мл буферного субстрата), в результате чего происходила визуализация реакции, а именно в местах экспрессии антигена осаждался коричневый краситель. Экспозиция составляла 15-20 минут, после чего срезы промывали в дистиллированной воде в течение 5 минут.
На заключительном этапе препараты докрашивали гематоксилином (Dako) в течение одной минуты и промывали в дистиллированной воде 5 минут. Далее препараты проводили через спирт 96 (3 ёмкости по 5 минут), ксилол (3 ёмкости по 5 минут) и заключали в полистирол под покровные стёкла. Результаты иммуногистохимических реакций оценивали количественно с использованием светового микроскопа при увеличении х400 с подсчётом иммунопозитивных объектов в 10 полях зрения в каждом препарате. Производили подсчет количества позитивных клеток и общего количества клеток с последующим вычислением их процентного соотношения и получением средних величин по исследуемым группам.
Для визуализации сосудов исследуемой опухолевой ткани проводили иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к эндотелиальному фактору CD34. Оценка относительной площади микрососудов проводилась с помощью 100-точечной окулярной измерительной сетки Автандилова для цитогистостереометрического исследования. В ходе работы были подсчитаны точки, приходящиеся на сосуды с положительной реакцией в эндотелии к CD34, методом случайного наложения в десяти полях зрения в каждом препарате. Значения показателя выражали в процентах. Экспрессия CD34 позволила изучить, а в отдельных наблюдениях подтвердить опухолевую инвазию в стенку сосуда.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием компьютерной программы SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) version 14. При статистической обработке результатов использовались методы непараметрической статистики. Для определения достоверности различий между исследуемыми группами использовался метод Н-Краскела-Уоллеса с дальнейшим попарным сравнением групп методом U-Манна-Уитни. Для выявления возможной связи между изученными показателями внутри групп проводился корреляционный анализ с определением коэффициента корреляции г-Спирмена. Результаты считались статистически значимыми при уровне значимости р 0,05 и р 0,01. Учитывались прямые (положительные) и обратные (отрицательные) корреляционные связи с коэффициентом корреляции 0,7-0,99 (большие (сильные)), 0,3-0,69 (средние (умеренные)) и до 0,3 (малые (слабые)) при значении р 0,05 и р 0,01.
Экспрессия bcl-2 и р53 в фолликулярных опухолях щитовидной железы
В настоящей работе проведена комплексная дифференциальная диагностика фолликулярных опухолей щитовидной железы разной степени злокачественности с использованием гистологического, морфометрического, иммуногистохимического методов исследования.
На основании гистологического строения с учётом размера исследуемые доброкачественные и злокачественные опухоли фолликулярно-клеточной дифференцировки были разделены на шесть групп. Морфологическая картина изучаемых опухолей каждой исследуемой группы совпадала с данными, описанными в литературе [Бомаш Н.Ю., 1981; Хмельницкий O.K., 2002; DeLellis R.A. et al., 2004].
Доброкачественные опухоли были представлены двумя группами гиперцеллюлярных аденом, среди которых в отдельную группу были выделены атипические аденомы размером, соответствующим микрокарциноме. В группу злокачественных новообразований входили дифференцированные формы миіфокарцином и макрокарцином, в качестве которых рассматривались фолликулярный рак, фолликулярный вариант папиллярного рака и высокодифференцированный папиллярный рак с классическим сосочковым строением. Группа микрокарцином включала в себя наблюдения фолликулярного рака и фолликулярного варианта папиллярного рака, имеющего исключительно фолликулярное строение.
Анализ результатов, полученных в ходе морфометрического исследования, показал, что в атипических аденомах и фолликулярных аденомах фетального и эмбрионального строения наиболее выражен эпителиальный компонент с наименьшими значениями стромального компонента в атипических аденомах [Полоз Т.Л. и др., 2006]. Значения стромального компонента в группе атипической аденомы были в 2,6 раза меньше, чем в группах миіфокарцином и фолликулярной макрокарциномы. Процессы склерозирования стромы были значительными в папиллярных карциномах, особенно в наблюдениях папиллярного рака с классическим сосочковым строением, что подтверждает обладание им выраженными десмопластическими свойствами [Бомаш Н.Ю., 1981; Тихонова Ю.А., 2000; Хмельницкий O.K., 2002].
Следует отметить, что эпителиально-стромальные взаимоотношения в группах микрокарцином и широкоинвазивного фолликулярного рака были практически одинаковыми. Данные литературы и результаты нашего морфометрического исследования свидетельствуют о том, что маленький дифференцированный рак по гистоархитектонике не отличается от макрокарцином соответствующего строения [Хмельницкий O.K., 2002].
Анализируя результаты, полученные в ходе морфометрического исследования, необходимо отметить, что существенных отличий в показателях относительной площади микрососудов в исследуемых группах выявлено не было, что согласуется с данными литературы [Полоз Т.Л. и др., 2006; Fontanini G. et al., 1996; WongN.A. et al., 1999].
Помимо визуализации сосудистого русла, иммуногистохимический метод с использованием моноклональных антител к CD34 позволил провести оценку целостности сосудистой стенки в образцах тканей исследуемых фолликулярных опухолей. В образцах ткани фолликулярных карцином были обнаружены выступающие в просвет кровеносного сосуда, в виде грибовидного образования, опухолевые комплексы, полностью или частично покрытые слоем эндотелиальных клеток, что, по данным литературы, является патогномоничным признаком сосудистой инвазии [Лушников Е.Ф. и др., 2003]. Таким образом, иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к эндотелиальному фактору. CD34 может быть рекомендовано для диагностики опухолевой инвазии сосудов микроциркуляторного русла в фолликулярных опухолях щитовидной железы.
В ходе корреляционного анализа отмечено, что в группах гиперцеллюлярных аденом и миіфокарцином с относительной площадью паренхимы коррелирует не только относительная площадь склерозированнои стромы (сильные отрицательные связи), но и относительная площадь сосудов микроциркуляторного русла (сильные отрицательные связи). Соответственно, чем больше паренхиматозного компонента, тем менее выражены процессы склерозирования стромы и в меньшей степени развита сосудистая сеть.
В группе широкоинвазивной фолликулярной карциномы также была выявлена сильная отрицательная корреляционная связь между относительной площадью паренхимы и относительной площадью склерозированной стромы; соответственно, количество склерозированной стромы уменьшается вследствие увеличения эпителиального компонента. Выявленные корреляционные связи в микрокарциноме (умеренная положительная) и фолликулярных аденомах фетального и эмбрионального строения (сильная положительная) между показателями относительной площади склерозированной стромы и относительной площади сосудов микроциркуляторного русла свидетельствует о том, что с увеличением стромального компонента количество сосудов также увеличивается. Установленные корреляционные связи указывают на тесную взаимосвязь между паренхиматозным и стромально-сосудистым компонентами исследуемых фолликулярных опухолей щитовидной железы.
Изучение пролиферативной активности исследуемых опухолей проводилось с помощью иммуногистохимического метода с использованием моноклональных антител к Кі-67 и PCNA.
