Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1 В-хромосомы 14
1.1.1. Происхождение В-хромосом 15
1.1.1.1 Происхождение B-хромосом от аутосом 15
1.1.1.2 Происхождение В-хромосом от половых хромосом 16
1.1.1.3 Происхождение В-хромосом в результате межвидовой гибридизации 17
1.1.2 Отличительные свойства В-хромосом 19
1.1.2.1 Перспективы использования В-хромосом в биотехнологии 21
1.1.3 Структура В-хромосом 21
1.1.3.1 Молекулярный состав В-хромосом 21
1.1.3.2. Локализация уникальных аутосомных генов на добавочных хромосомах 25
1.1.4 В-хромосомы млекопитающих 31
1.2 Сегментные дупликации и амплификация генов 36
1.3 Структура и функции генов TNNI3K, FPGT и LRRIQ3 40
1.3.1 Структура и функции гена TNNI3K 41
1.3.2 Структура и функции гена FPGT 43
1.3.3 Структура гена LRRIQ3 44
1.4 Род косуля Capreolus 44
1.4.1 Филогенетические связи семейства Cervidae 46
1.5 Хромосомная эволюция семейства оленьих (Cervidae) 52
1.6 Заключение 53
2. Материалы и методы 55
2.1 Материалы 55
2.2. Методы 59
2.2.1 Культивирование культур клеток фибробластов и получение суспензии хромосом 59
2.2.2 Приготовление препаратов метафазных хромосом 60
2.2.3 GTG-бэндинг 61
2.2.4 Флуоресцентная in situ гибридизация 61
2.2.4.1 Гибридизация 61
2.2.4.2 Постгибридизационные отмывки, детекция и усиление сигнала 61
2.2.5 Полимеразная цепная реакция 62
2.2.6 DOP-ПЦР 63
2.2.7 Получение DOP библиотеки ДНК ВАС клонов 63
2.2.8 Мечение ДНК ВАС клонов 64
2.2.9 Полимеразная цепная реакция в реальном времени 64
2.2.10 Получение Cot10 ДНК косули 66
2.2.10.1 Реассоциация ДНК 66
2.2.10.2 Гидролиз однонитчатой ДНК S1-нуклеазой 66
2.2.11 Секвенирование ДНК 67
2.2.11.1 Секвенирование ДНК 67
2.2.11.2 Переосаждение ДНК 67
3. Результаты и обсуждение 68
3.1 Стандартизация кариотипа косули, выявление гомологичных районов аутосом косули, коровы и верблюда 70
3.2 Картирование участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули 77
3.2.1 Картирование участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули с помощью ВАС клонов коровы 77
3.2.2 Картирование участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули, с помощью ПЦР на библиотеке сортированных добавочных хромосом 82
3.3 Оценка копийности генов, присутствующих на добавочных хромосомах у сибирской
косули 89
3.4 Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом 92
3.4.1 Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом гена LRRIQ3 93
3.4.2 Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом генов TNNI3K и FPGT 95
3.5 Оценка эволюционной консервативности генов TNNI3K и FPGT 96
3.5.1 Сравнение первого экзона гена FPGT в ряду млекопитающих 99
3.5.2 Сравнение второго экзона гена FPGT в ряду млекопитающих 102
3.5.3 Сравнение третьего экзона гена FPGT в ряду млекопитающих 106
3.5.4 Сравнение четвертого экзона гена FPGT в ряду млекопитающих 107
3.5.5 Сравнение промоторной области гена TNNI3K у оленьих 110
3.5.6 Сравнение первого экзона гена TNNI3K у оленьих 111
3.6 Обнаружение транскрипционной активности копии гена FPGT, расположенного на В-хромосомах 112
4. Заключение
- Происхождение В-хромосом в результате межвидовой гибридизации
- Приготовление препаратов метафазных хромосом
- Картирование участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули с помощью ВАС клонов коровы
- Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом гена LRRIQ3
Введение к работе
Актуальность работы
В-хромосомы или добавочные, сверхчисленные, хромосомы обнаружены у животных, растений, грибов и характеризуются необязательностью для жизнедеятельности организма (Camacho et al., 2000). Основная часть исследований по молекулярной организации В-хромосом показала, что добавочные элементы богаты повторенной некодирующей ДНК: LINE и SINE, теломерными и центромерными повторами, рибосомной ДНК, гистоновыми генами и не несут экспрессирующихся уникальных генов. Имеющиеся данные наводили на мысль о функциональной инертности В-хромосом. Однако с применением молекулярных методов в последнее время был обнаружен целый ряд уникальных аутосомных генов, расположенных на В-хромосомах, у различных организмов (Han et al, 2001; Lamatsch et al, 2011; Yoshida et al, 2011; Martis et al., 2012). В частности, на В-хромосомах хищных был обнаружен протоонкоген С kit, что позволило сделать предположение о присутствии генов в добавочных элементах и других видов млекопитающих, в частности, сибирской косули Capreolus pygargus (2n=70+0-12B) (Graphodatsky et al., 2005; Yudkin et al, 2007; Duke Becker et al, 2011).
Вопрос о транскрипционной активности генов, расположенных на В-хромосомах млекопитающих, долго оставался спорным и открытым. Была показана экспрессия рибосомных генов, лежащих на добавочных элементах, у растений (Leach et al, 2005) и животных (Rubtsov et al, 2004; Ruiz-Estevez et al, 2012). Однако, обнаружение в данном исследовании транскрипта FPGT-TNNI3K, экспрессирующегося с дуплицированных генов на В-хромосомах в культуре фибробластов сибирской косули - является первым примером транскрипционной активности уникальных генов, расположенных на добавочных элементах кариотипа млекопитающих. Варьирование копийности функционально значимых генов в зависимости от числа В-хромосом может оказаться критическим для жизнедеятельности вида. Таким образом, проведенное в данной работе подробное картирование В-хромосом сибирской косули выявило важные функциональные последовательности, локализованные на добавочных элементах, и показало их экспрессию, что способствует пересмотру представления о В-хромосомах и необходимости учитывать их возможную роль в жизнедеятельности организма и в эволюции геномов.
Целью представленной работы было детальное картирование В-хромосом сибирской косули и выявление транскрипционной активности дуплицированных генов, расположенных на В-хромосомах. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Стандартизация кариотипа косули и выявление гомологичных районов хромосом косули, верблюда и коровы с помощью хромосомного пэйнтинга.
-
Разработка метода идентификации генов на добавочных хромосомах.
-
Картирование последовательностей ДНК, локализованных на В-хромосомах косули, с помощью флуоресцентной in situ гибридизации ВАС клонов коровы и ПЦР.
-
Определение копийности аутосомных участков, присутствующих на добавочных элементах у сибирской косули с разным числом В-хромосом, с помощью ПЦР в реальном времени.
-
Выявление возможных различий первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом с помощью секвенирования.
-
Оценка эволюционной консервативности генов, локализованных на В-хромосомах, путем сравнения экзонов этих генов у косули, лося, марала, мазама и других видов позвоночных.
-
Доказательство транскрипционной активности дуплицированных копий генов, расположенных на В-хромосомах, путем выявления аналогичных нуклеотидных замен в ДНК В-хромосом и в клонах кДНК.
Научная новизна работы и практическая значимость
Впервые проведена стандартизация кариотипа косули относительно кариотипов коровы и верблюда. Обнаружено восемь перестроек, разделяющих кариотипы коровы и косули, из них шесть слияний хромосом в линии косули, одно слияние хромосом в линии коровы и одна инверсия на хромосоме 11 сибирской косули.
Предложен оригинальный метод идентификации последовательностей, расположенных на В-хромосомах. Впервые показано, что В-хромосомы сибирской косули содержат аутосомные копии генов TNNI3K, FPGT и LRRIQ3 вместе с прилегающими к ним последовательностями. Участок, гомологичный хромосоме 3 коровы (74.6 - 76.4 м.п.н.), на добавочных хромосомах составляет около 2 м.п.н. Установлено, что копии генов TNNI3K, FPGT и LRRIQ3, локализованные на В-хромосомах, очень консервативны. Однако в двух случаях удалось выявить несинонимичные В-хромосом-специфичные замены. Поскольку замены, обнаруженные на добавочных хромосомах, совпали с заменами, обнаруженными в клонах кДНК, был сделан вывод о транскрипционной активности этих генов. Показано, что гены TNNI3K, FPGT характеризуются высокой консервативностью в ряду млекопитающих.
Использование разработанных нами молекулярных подходов по картированию В-хромосом сибирской косули в дальнейшем может облегчить задачу исследования молекулярной организации добавочных хромосом у других видов позвоночных.
Положения, выносимые на защиту
Сибирская косуля обладает высококонсервативным кариотипом, близким предковому кариотипу оленьих. Добавочные хромосомы косули содержат крупный дуплицированный фрагмент хромосомы 1, включающий уникальные
гены TNNI3K, FPGT и LRRIQ3. Кодирующие гены, локализованные на В-хромосомах сибирской косули, транскрибируются.
Апробация работы
Результаты исследования были доложены на следующих конференциях:
-
Симпозиум, посвященный 130-летию со дня рождения Левитского Г.А. "Хромосомы и эволюция" (Санкт-Петербург, 26-27 ноября 2008 г);
-
Международная конференция "Хромосома 2009" (Новосибирск, 31 августа-6 сентября 2009 г);
-
II международная научно-практическая конференция "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика" (Новосибирск, 14-17 ноября 2011
г);
4. 19-я международная хромосомная конференция (Болонья, Италия, 2-6
сентября 2013г).
Личный вклад соискателя
Автором выполнена вся экспериментальная работа, включающая локализацию ВАС клонов с помощью FISH и скрининг В-хромосомных библиотек с помощью ПЦР. Автором также проведена оценка копийности участков, представленных на добавочных хромосомах, с помощью ПЦР в реальном времени и секвенирование копий генов, лежащих на В-хромосомах и аутосомах сибирской косули, европейской косули, лося, марала и мазама. Стандартизация кариотипа косули с помощью хромосомного пэйнтинга была проведена совместно с к.б.н. А. И. Кулемзиной (ИМКБ СО РАН, Новосибирск). Обработка, анализ, интерпретация данных и подготовка публикаций были выполнены при участии автора.
Объем и структура диссертации
Происхождение В-хромосом в результате межвидовой гибридизации
В-хромосомы определяют как сверхчисленные, добавочные или необязательные элементы кариотипа. Впервые В-хромосомы были описаны Вильсоном с соавторами в 1907 году у одного из видов краевиков (Metapodius, Coreidae) (Wilson et al., 1907). Позднее добавочные хромосомы были обнаружены у растений: ржи посевной (Secale cereale) (Gotoh, 1924) и кукурузы сахарной (Zea mays) (Kuwada, 1925; Longley, 1927). В 1928 году Рэндольф впервые предложил термин В-хромосомы, для того, чтобы отличать их от основного набора, называемого А-хромосомами (Randolph, 1928). С тех пор добавочные хромосомы были обнаружены во всех основных группах грибов, растений и животных, за исключением птиц (Camacho et al., 2000). Было предположено, что отсутствие у птиц добавочных элементов кариотипа связано с небольшим размером генома птиц и низким содержанием повторов в нем (Vujosevic, Blagoevic, 2004).
Исследование В-хромосом ограничивается техническими трудностями, поскольку количество добавочных элементов может варьировать на внутри- и межиндивидуальном уровне. Так у плоскоиглого бандикута (Echymipera kalubu) В-хромосомы присутствуют только в тестикулярной ткани и роговом эпителии (Hayman et al., 1969). Кроме того, тканевой мозаицизм по числу добавочных хромосом был обнаружен у восточно-азиатской лесной мыши (Apodemus peninsulae) (Bekasova et al., 1980), лисицы (Vulpes vulpes) (Беляев и др., 1974) и других.
Добавочные элементы варьируют по размерам от мелких точечных элементов кариотипа (большинство описанных В-хромосом относят к этой группе) до довольно крупных хромосом, сопоставимых по размеру с первыми самыми крупными аутосомами. Крупные В-хромосомы довольно редки и описаны лишь у нескольких видов: белохвостой чешуехвостой крысы (Uromys caudimaculatus) (Baverstock et al., 1976), малой перепончатопалой крысы (Holochilus brasiliensis) (Nachman., 1992), восточно-азиатской лесной мыши (Apodemus peninsulae) (Волобуев, Тимина, 1980), енотовидной собаки (Nyctereutes procyonoides) (Wurster–Hill et al., 1986). В зависимости от положения центромеры выделяют метацентрические, субметацентрические, акроцентрические и точечные В-хромосомы. Появление добавочной хромосомы – чрезвычайно необычное для организма явление. В настоящее время существуют несколько теорий происхождения B-хромосом: от аутосом, от половых хромосом и в результате межвидовой гибридизации.
По гипотезе Палестиса с соавторами (Palestis et al., 2004) именно в кариотипах с акроцентрическими хромосомами чаще встречаются добавочные элементы. Авторы основывают свое предположение на гипотезе Де Вилена и Сапиенза, которые описывают феномен мейотического драйва как результат особенностей мейоза в женском организме, и статистической оценке частоты встречаемости добавочных хромосом в современных видах. У одних видов максимальное число элементов в ходе женского мейоза отходит в яйцеклетку, и эволюция кариотипа этих видов будет идти в сторону накопления акроцентрических хромосом (и, соответственно, В-хромосом). У других видов, наоборот, в яйцеклетку отходит минимальное число центромер, и тогда в кариотипе преобладают метацентрические элементы (De Villena, Sapienza, 2001).
Происхождение B-хромосом от аутосом
Традиционно считается, что В-хромосомы являются производными А хромосом. В частности, В-хромосомы могут вести свое происхождение от полисомных А-хромосом. Добавочные элементы могут образовываться из центрических фрагментов, возникающих в результате слияния акроцентрических А-хромосом. Например, В-хромосомы у Drosophila albomicans образовались из центрических фрагментов, возникших в результате слияние предковой половой хромосомы и третьей аутосомы (Zhou et al., 2012). Появление В-хромосом также возможно в результате амплификации прицентромерных районов фрагментированных А-хромосом (Jones et al., 1982). Последняя из трех гипотез нашла подтверждение в работе Кейл и Хагели (Keyl, Hagele, 1971). Авторы показали, что политенная В-хромосома мотыля (Chironomus plumosus) ведет свое происхождение от прицентромерного фрагмента хромосомы IV, основываясь на одинаковой картине исчерченности этих двух структур. Также была проведена работа, демонстрирующая, что в добавочных хромосомах скерды волосовидной (Crepis capillaries) содержатся повторенные последовательности ДНК, которые также расположены и на А хромосомах. Однако конкретная А-хромосома, от которой В-хромосомы могли вести свое происхождение, так и не была индентифицирована (Jamilena et al., 1994, 1995). Гипотеза о происхождении добавочных хромосом от аутосом была подтверждена в случае лисицы и енотовидной собаки (Graphodatsky et al., 2005; Yudkin et al., 2007). Было показано, что в В-хромосомах содержатся копии 10 аутосомных районов (Duke Becker et al., 2011). В случае саранчи перелетной Locusta migratoria было показано, что добавочные элементы ведут свое происхождение от хромосомы 8 (Teruel et al., 2010). Также на примере цихлид озера Виктория было продемонстрировано, что В-хромосомы вида Lithocromis rubripinnis ведут свое происхождение от хромосомы 1, несущей локусы, отвечающие за определение пола (Yoshida et al., 2011). Кроме того, аутосомное происхождение добавочных хромосом было показано и в виде кузнечиков (Abracris flavolineata) на основании обнаружения одинаковых последовательностей U2 snRNA на А- и В-хромосомах (Bueno et al., 2013).
Приготовление препаратов метафазных хромосом
Согласно таблице 1, добавочные элементы в одних отрядах млекопитающих представлены очень широко, в других – встречаются очень редко или совсем отсутствуют. Так только в одном семействе Canidae отряда хищных у шести видов были обнаружены добавочные хромосомы. И единичное число видов, относящихся к отрядам насекомоядных, рукокрылых и приматов, содержат добавочные элементы в своем кариотипе. В отряде рукокрылых существует два вида, несущих В-хромосомы. В отряде насекомоядных встречается только один вид с В-хромосомами - малая белозубка.
Из таблицы 1 также ясно видно, что рекордсменом по числу видов, несущих В-хромосомы, является отряд грызунов.
Вероятно, это связано с тем, что отряд грызунов отличается высокими темпами кариотипической эволюции и, соответственно, кариотип грызунов отличается наиболее высокой перестроенностью по сравнению с другими группами млекопитающих. Помимо грызунов данный феномен характерен и для семейства собачьих Canidae (Trifonov et al., 2002).
В отряде парнокопытных можно выделить четыре вида, несущих добавочные элементы: сибирская косуля (Capreolus pygargus) (Sokolov et al., 1978; Graphodatsky et al., 1990), большой мазама (Mazama americana) (Taylor et al., 1969), серый мазама (Mazama gouazoubira) (Neitzel et al., 1987) и кабарга (Moschus sibiricus) (Sokolov, Prikhodko, 1998). Примечательно, что все эти виды обладают кариотипом с большим числом акроцентрических хромосом.
Первые исследования генома человека были ориентированы на уникальные гены и, в меньшей степени, на некодирующие участки генома; на второй план отодвигались районы, прилежащие к центромерам и теломерам. Недавние исследования структуры прицентромерных и субтеломерных последовательностей выявили, что эти районы часто содержат огромное число сегментных дупликаций (Bailey et al., 2001).
Сегментные дупликации – это дуплицированные блоки геномной ДНК, варьирующие по размерам от 1 до 200 т.п.н., имеющие взаимное сходство более 90% (Eichler, 2001). Они содержат высококопийные повторы, такие, как Alu и LINE – элементы, и генные последовательности с экзон-интронной структурой (Bailey et al., 2001). Возникновение новых функций организма осуществляется вследствие изменения генов и кодируемых ими продуктов. В течение долгого времени считается, что подобные изменения обеспечиваются сегментными дупликациями генома (Ohno et al., 1968).
Существенная роль сегментных дупликаций в эволюции геномов показана на различных примерах. Было выявлено, что многие семейства генов позвоночных были сформированы в результате небольших дупликаций ДНК у ранних хордовых (McLysaght et al., 2002). Кроме того, на основе филогенетических анализов было показано, что многочисленные сегментные дупликации возникали на ранних стадиях эволюции эукариот и, таким образом, обеспечивали возможность их успешной дивергенции (Zhou et al., 2010). После того, как было проведено полное секвенирование генома коровы, оказалось, что сегментные дупликации составляют примерно 3,1% генома. Причем, было показано, что сегментные дупликации в большинстве случаев обеспечивают хромосомные перестройки посредством негомологичной рекомбинации, и что участки, аккумулирующие сегментные дупликации, неслучайно распределяются в геномах парнокопытных (Elsik et al., 2009). Кроме того, было выявлено, что сегментные дупликации могут приводить к созданию новых функциональных интронов, что и происходило в предковой линии позвоночных челюстных около полумиллиарда лет назад (Hellsten et al., 2011).
C другой стороны, сегментные дупликации играют существенную роль в возникновении многих геномных заболеваний, таких как синдром Ангельмана и синдром Прадера-Вилли (Shaikh et al., 2000). Было показано, что развитие аутизма, шизофрении и эпилепсии также связано с сегментными дупликациями (Mefford, Eichler, 2009).
В геномах эукариот известны два основных механизма дупликации районов, кодирующих гены. Это ретротранспозиция и негомологичная рекомбинация.
Механизм трансдукции, связанный с ретротранспозицией мобильных элементов, был изучен наиболее детально. В результате были выявлены гены, претерпевшие дупликацию при участии семейства ретротранспозонов SVA. Ретротранспозоны SVA состоят из повторенных элементов, подобных SINE, VNTR, Alu. Отсюда и название “SVA” по первым буквам повторенных элементов, входящих в состав этих ретротранспозонов. Семейство ретротранспозонов SVA возникло около 25 млн. лет назад и увеличилось до трех тысяч копий в геноме человека. С момента возникновения данного семейства 53 т.п.н. генома человека было дуплицировано в результате 143 трансдукционных событий, опосредованных различными типами SVA. Была идентифицирована группа SVA элементов, посредством которых был трижды дуплицирован ген AMAC в геноме человека. Таким образом, было показано, что ретротранспозон-опосредованная трансдукция последовательностей не только является механизмом для перетасовки экзонов, но и механизмом дупликации генов и создания новых семейств генов (Xing et al., 2006).
Картирование участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули с помощью ВАС клонов коровы
Культуры фибробластов косули были взяты из банка клеточных культур лаборатории цитогенетики животных ИМКБ СО РАН. Культивирование клеток проводили при 37С на средах F12, DMEM и МЕМ с добавлением 10% сыворотки и антибиотиков: пеницилина (100 мкг/мл) и канамицина (100 мкг/мл). Среду меняли 2-3 раза в неделю. Как только образовывались равномерные и плотные колонии, клетки снимали с помощью 0,25%-ного раствора трипсина с ЭДТА (0,3 г/л) и переносили в новую емкость, таким образом, осуществляя пересевание культуры фибробластов. Фиксацию культуры клеток фибробластов проводили следующим образом: через 24 часа после последнего пересева в культуральную среду добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 0,025 мг/мл на 2 часа. Затем вводили колхицин в концентрации 0,05 мг/мл на 45 мин. Потом среду сливали и добавляли теплый (37С) 0,25%-ный раствор трипсина с ЭДТА в количестве, достаточном для снятия клеток. Для остановки действия трипсина во флакон добавляли 3-4 мл ростовой среды. Клетки переносили в центрифужную пробирку и проводили центрифугирование в течение 5 минут со скоростью 1000 оборотов/мин. Затем к осадку клеток добавляли свежий гипотонический 3,7 10-4 М раствор KCl, содержащий 2-3% эмбриональной бычьей сыворотки, и осадок клеток суспендировали. Пробирки помещали в термостат и выдерживали при 37С в течение 45-50 мин. Стадия предфиксации после гипотонической обработки проводилась следующим образом: несколько капель метанол-уксусного фиксатора (3:1) добавляли к гипотоническому раствору с клетками. Раствор перемешивали и оставляли на 5-10 мин. Затем центрифугировали и снова добавляли свежеприготовленный охлажденный (при -20С) метанол-уксусный фиксатор (3:1). Раствор с клетками тщательно суспендировали и фиксировали при -20С в течение 20 мин. Затем проводили конечное центрифугирование и замену фиксатора. После чего раствор оставляли на 12 часов при -20С. Потом еще раз меняли фиксатор и оценивали качество полученного материала.
Для приготовления препаратов метафазных хромосом исследуемых видов использовали чистые предметные стекла размером 76х26х1мм. Для обезжиривания стекла выдерживали в хромовой смеси около 30 мин., затем тщательно ополаскивали водопроводной и дистиллированной водой и использовали для приготовления препаратов. Далее на холодные влажные стекла наносили необходимое количество суспензии хромосом, промывали метанол-уксусным фиксатором (3:1) и помещали в пары водяной бани (65С) до высыхания фиксатора.
Качество препаратов контролировали с помощью фазово контрастного микроскопа. Препараты прогревали в течение одного часа при температуре 65С.
Дифференциальное окрашивание проводили с помощью раствора трипсина и красителя Гимза. Препарат обрабатывался 0,12 % раствором трипсина от 1 мин. 30 сек. до 2 мин., в зависимости от температуры окружающей среды. Чтобы остановить действие трипсина препарат ополаскивали в 2xSSC и затем окрашивали красителем Гимза в течение 2-3 мин. После окрашивания препарат ополаскивали в дистиллированной воде и высушивали. Качество окраски метафазных хромосом контролировали под микроскопом и фотографировали подходящие метафазные пластинки с помощью CCD камеры и специального программного обеспечения.
Гибридизационная смесь содержала: около 0,1 мкг/мкл зонда, 40% формамида, 10% декстрансульфата, 2xSSC. Денатурация проб проводилась при 75C в течение 10 мин. Предгибридизация проб с Сot10 ДНК косули осуществлялась в смеси для гибридизации при 37C в течение 30 мин. Непосредственно перед гибридизацией фиксированные препараты денатурировали в растворе, содержащем 70%-ый формамид и 2xSSC. Денатурацию препаратов проводили при 69-72C в интервале от 1 мин. 45 сек. до 2 мин. 15 сек. (время и температуру денатурации подбирали для каждой суспензии хромосом). Вслед за этим препараты проводили через серию охлажденных (-20C) растворов этанола возрастающей концентрации (70%, 80% и 96%). Гибридизационную смесь наносили на препарат под покровное стекло размером 24х24мм в количестве 18 мкл. Затем стекло заклеивали резиновым клеем. Препараты с гибридизационной смесью инкубировали в термостате при 37C во влажной камере в течение 18-24 часов.
Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом гена LRRIQ3
Для оценки копийности фрагментов, представленных на добавочных хромосомах, использовался метод ПЦР в реальном времени. В качестве маркеров использовали консервативные участки генов FPGT и LRRIQ3, а также промоторную область гена TNNI3K. В качестве контрольного гена использовали консервативный участок гена PTGFR, который располагается на хромосоме 3 коровы и представлен единственной копией в геноме коровы (по данным UCSC genome browser on Cow Oct. 2011 (Baylor Btau_4.6.1/bosTau7)). Кроме того, с учетом полученных нами данных, этот ген лежит далеко за пределами области, представленной на добавочных хромосомах сибирской косули (примерно на расстоянии 4,6 м.п.н.) и поэтому подходит для нашего исследования. Ранее были получены данные о том, что при межвидовых исследованиях различия в нуклеотидной последовательности ДНК праймеров приводят к искажению в подсчете копийности изучаемых генов (Bel et. al., 2011). Поскольку сибирская косуля и корова - относительно филогенетически отдаленные виды, мы предварительно проводили секвенирование участков, по которым далее подбирали праймеры для ПЦР в реальном времени. Нуклеотидные последовательности отобранных праймеров были идентичны у коровы и сибирской косули. Список, использованных нами праймеров для ПЦР в реальном времени, приведен в таблице 6.
Копийность участков, представленных на добавочных хромосомах, определяли для сибирской косули без В-хромосом, сибирской косули с 4 В-хромосомами и сибирской косули с 8 В-хромосомами. Мы установили, что участки генов TNNI3K и LRRIQ3 представлены в двух копиях на диплоидный геном у сибирской косули без В-хромосом, так же как в случае с геном PTGFR. Тогда как участок гена FPGT представлен в четырех копиях на диплоидный геном у сибирской косули без добавочных хромосом, что говорит о возможной дупликации этого гена. Участки генов FPGT и LRRIQ3 имеют шесть копий на диплоидный геном у сибирской косули с 4 В-хромосомами. Эти данные прямо согласуются с числом добавочных хромосом. Т.е. две копии этих генов лежат на аутосомах и, возможно, по одной копии на четырех В-хромосомах. Участок гена TNNI3K у сибирской косули с 4 В-хромосомами представлен в четырех копиях на диплоидный геном. Это означает, что две копии данного гена присутствуют на аутосомах и две копии, вероятно, на двух из четырех В-хромосом. В данном случае видно, что, возможно, не все добавочные элементы содержат копию TNNI3K. Участок гена TNNI3K имеет десять копий на диплоидный геном сибирской косули с 8 В-хромосомами. Вероятно, что по одной копии этого гена содержится на всех восьми добавочных хромосомах и две копии – на аутосомах. Участки генов FPGT и LRRIQ3 представлены в восьми копиях на диплоидный геном сибирской косули с 8 В-хромосомами (Рис. 8). Т.е. по две копии этих генов приходится на аутосомы и шесть копий расположены на 8 добавочных хромосомах. Эти данные коррелируют с результатами локализации ВАС клонов коровы на хромосомы косули и говорят в пользу того, что не все добавочные элементы содержат копии этих генов.
Таким образом, копийность участков генов TNNI3K, FPGT и LRRIQ3 коррелирует с числом В-хромосом, но не всегда в прямо пропорциональной зависимости. Этот факт объясняется тем, что не все добавочные элементы содержат копии участков этих генов.
На основе распределения кДНК, локализации ВАС клонов коровы на хромосомы сибирской косули и ПЦР-картирования было обнаружено и подтверждено присутствие аутосомных генов TNNI3K, FPGT, LRRIQ3 на добавочных хромосомах. В результате ПЦР в реальном времени мы показали, что копийность данных генов выше у сибирской косули с В-хромосомами по сравнению с сибирской косулей без В-хромосом.
Результаты ПЦР в реальном времени указывают на гетерогенный состав В-хромосом, что согласуется с результатами локализации ВАС клонов коровы, которые при гибридизации показывали разную интенсивность сигналов на добавочных элементах.
В связи с обнаружением функциональных последовательностей на добавочных хромосомах стало необходимым провести сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом. Полученные данные позволили бы обнаружить В-хромосом-специфичные замены, играющие роль маркеров при экспрессии генов, расположенных на добавочных элементах.
