Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1. Биологические свойства С. burnetii 11
2. Характеристика генома С. burnetii 16
3. Методы идентификации и дифференциации коксиелл: биологические, серологические, иммунологические, молекулярно-биологические 24
I. Методы идентификации 24
Методы культивирования С. burnetii 24
Биологические методы идентификации 25
Серологические методы 26
Молекулярно-генетические методы 27
ПЦР в формате реального времени 29
II. Методы дифференциации С. burnetii и оценка генетической однородности мировой популяции коксиелл 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
1. Материалы 37
1.1. Штаммы С. burnetii 37
1.2. Биологический материал 42
1.3. ДНК микроорганизмов для контроля специфичности реакций ПЦР и ПЦР-РВ 43
2. Методы 43
2.1. Культивирование С. burnetii для накопления биомассы 43
2.1.1. Культивирование на куриных эмбрионах 43
2.1.2. Культивирование в культуре клеток 44
2.2. Очистка от тканевых примесей 44
2.3. Подсчет количества клеток С. burnetii в материале 45
2.4. Выделение ДНК 46
2.5. Дизайн праймеров 47
2.6. Полимеразная цепная реакция 49
2.7. Электрофорез в агарозном геле 50
2.8. ПЦР в формате реального времени 50
2.9. Выделение ДНК из агарозного геля 51
2.10. Рестрикция 52
2.11. Секвенирование 52
2.12. Статистическая и компьютерная обработка данных 53
II. Результаты 54
ГЛАВА 3. Оптимизация пцр для выявления с. burnetii ъ полевом и клиническом материале 54
ГЛАВА 4. Сравнительная эффективность технологий пцр-рв sybrgreen iи пцр-рв taqman для выявления и оценки количественного содержания с. burnetii ъ образцах биологического материала 65
1. ПЦР-РВ, технология SYBRGreen 1 66
2. ПЦР-РВ, технология TaqMan 72
ГЛАВА 5. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов с. burnetii 78
1. Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции 78
2. Мультиспейсер-типирование 81
3. Распределение штаммов по типу плазмид и типу сиквенса генов djIA и соті 93
Заключение 96
Выводы 102
Список литературы 104
- Характеристика генома С. burnetii
- Штаммы С. burnetii
- ПЦР-РВ, технология SYBRGreen 1
- Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции
Введение к работе
Актуальность темы
Ку-лихорадка - природно-очаговое инфекционное заболевание, представляющее важную медико-социальную проблему в связи с широким распространением возбудителя в различных климато-географических зонах мира; многообразием путей передачи инфекции (воздушно-пылевой, пищевой, трансмиссивный); профессиональным характером заражения лиц, занятых в животноводстве; значительными экономическими потерями, обусловленными инфицированием сельскохозяйственных животных.
Высоко устойчивый во внешней среде возбудитель Ку-лихорадки, Coxiella burnetii, является причиной спорадических заболеваний, эпидемических вспышек и может быть использован в качестве потенциального агента биотерроризма (Pappas G., Blanco J.R., 2007; Azad A.F., 2007; Tissot-Dupont H, Raoult D., 2008).
Сложившиеся в последнее десятилетие в России социально-экономические условия создают реальные предпосылки подъема заболеваемости населения Ку-лихорадкой. Так, частота обнаружения антител к С. burnetii у здоровых лиц увеличилась за последние годы в несколько раз и составила 16,0% и 11,0% в 2002 и 2003 г.г. против 1,1% и 1,8% в 1993 и 1994 г.г., соответственно (Беляев Е.Н. и др., 2001). Наблюдаемое при этом отсутствие корреляции между относительно высокой частотой случаев обнаружения антител и низким уровнем официально регистрируемых случаев Ку-лихорадки обусловлено гиподиагностикой инфекции и типично не только для России, но и для ряда европейских стран. Это связано с многообразием клинических проявлений Ку-лихорадки, поздним появлением антител к коксиеллам, сложностью культивирования возбудителя, накопление которого в куриных эмбрионах или в культуре эукариотических клеток трудоемко и сопряжено с большими временными затратами. Иммунологические методы выявления С. burnetii с помощью метода флуоресцирующих антител (МФА) и иммуноферментного анализа (ИФА) недостаточно чувствительны и специфичны.
Существенная вариабельность беспозвоночных и позвоночных хозяев, вовлекаемых в эпизоотический процесс Ку-лихорадки (Raoult D., 1999), и способность возбудителя образовывать стойкие природные и хозяйственные очаги делают его выявление особенно актуальным. В настоящее время в России такие очаги практически лишены регулярного наблюдения, и одна из причин этой ситуации - отсутствие эффективных методов обнаружения С. burnetii в полевом материале.
Молекулярно-генетические методы выявления и типирования С. burnetii лишены упомянутых недостатков, и, кроме того, позволяют определить генетические маркеры, пригодные для дифференцирования штаммов возбудителя, что открывает перспективы совершенствования диагностики и эпидемиологического надзора за Ку-лихорадкой.
В последнее десятилетие разработан ряд модификаций метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления ДНК С. burnetii в культуре клеток и клинических образцах, в материале от животных и продукции животного происхождения (Willems Н., Thiele D., 1994; Tissot-Dupont Н. et al, 1999; Beaman M., Hung J., 1989; Rowbotham Т., 1999). В России проведено исследование по выявлению возбудителя Ку-лихорадки в полевом материале путем амплификации фрагмента гена белка теплового шока, dnaJ (Tokarevich N., Mossienko E., 2001). Однако метод ПЦР до настоящего времени не нашел широкого применения при мониторинге природных очагов Ку-лихорадки.
Таким образом, недостаток сведений о структуре природных популяций С. burnetii на территории России, несовершенство существующих методов их обнаружения в природных и хозяйственных очагах диктуют необходимость внедрения молекулярно-генетических методов быстрого выявления и типирования коксиелл в полевом материале.
2. Цель работы
Совершенствование амплификационных методов выявления и типирования возбудителя Ку-лихорадки в биологическом материале и генотипическая характеристика штаммов С. burnetii различного географического происхождения. 3. Задачи исследования
1. Оптимизировать метод ПЦР для выявления С. burnetii в образцах биологического материала.
2. Оценить эффективность различных модификаций метода ПЦР в формате реального времени (ПЦР-РВ) для выявления С. burnetii в образцах биологического материала.
3. Провести генотипирование штаммов мировой коллекции С. burnetii, в том числе штаммов, выделенных на территории России, с помощью метода анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции амплифицированного гена groEL и мультиспейсер-типирования хромосомной ДНК (анализ нуклеотидных последовательностей множественных межгенных участков — спейсеров).
4. Изучить генетические связи между штаммами С. burnetii, выделенными на различных территориях, на основе филогенетического анализа множественных спейсеров хромосомной ДНК. 4. Научная новизна
С использованием метода мультиспейсер-типирования и анализа длин фрагментов рестрикции гена groEL изучена генетическая структура популяции С. burnetii, представленной штаммами, выделенными из различных источников в ряде регионов России. На основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей множественных спейсеров установлено, что на территории Российской Федерации циркулируют штаммы С. burnetii - представители групп ST23 (85%) и ST7 (15%). Впервые для качественного и количественного определения фрагмента гена icd С. burnetii в полевом материале из природных очагов Ку-лихорадки применен метод ПЦР-РВ.
Депонировано в коллекцию Международного генетического банка Национального центра биотехнологической информации
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 90 нуклеотидных последовательностей спейсеров (протяженностью 383 - 674 п.о.) девяти штаммов С. burnetii (АСС AY 864199 - AY 864288) и одна нуклеотидная последовательность фрагмента гена groEL штамма Ixodes-3-Луга, протяженностью 594 п.н. (АСС EF627450). Научно обоснована перспективность применения метода мультиспейсер-типирования для дифференциации штаммов С. burnetii различного географического происхождения.
5. Практическая значимость
Разработан и апробирован метод ПЦР-РВ в модификации TaqMan с использованием праймеров icd и сконструированного зонда детекции, меченного флуоресцеином, для выявления и количественного определения фрагмента гена icd штаммов С. burnetii в биологическом материале из природных очагов Ку-лихорадки. Показано, что по показателям чувствительности и специфичности технология ПЦР-РВ TaqMan с использованием сконструированного зонда детекции, меченного флуоресцеином, превосходит технологию ПЦР-РВ SYBRGreen I с использованием интеркалирующего красителя. Разработаны методические основы оптимизации метода ПЦР-РВ TaqMan для выявления возбудителя у больных на ранних стадиях заболевания Ку-лихорадкой.
Установлена инфицированность С. burnetii диких мелких млекопитающих, свидетельствующая о наличии на территории Санкт-Петербурга в 2006-2007 г.г. активных природных очагов Ку-лихорадки.
6. Положения, выносимые на защиту
1. ГТЦР с сконструированными праймерами, ограничивающими фрагмент гена groEL, высоко эффективна для выявления С. burnetii в биологическом материале.
2. ПЦР-РВ с применением сконструированного зонда, меченного флуоресцеином (технология TaqMan), оптимальна для количественного определения С. burnetii в полевом материале. 3. Штаммы С. burnetii, выделенные на территории России, по результатам анализа полиморфизма межгенных участков хромосомной ДНК, принадлежат к генотипам ST23 и ST7.
4. Метод мультиспейсер-типирования эффективен для генотипической характеристики штаммов С. burnetii различного географического происхождения.
7. Апробация работы
Результаты работы доложены на Международной конференции по риккетсиям и риккетсиальным болезням (Любляна, Словения, 4-7 сентября 2002 г.), на заседании отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (Санкт-Петербург, 15 мая 2007 г.), на Четвертой международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008 г.).
8. Личный вклад диссертанта
Формулирование целей и задач, подбор методов исследования выполнены лично диссертантом. Автором лично проводился дизайн праймеров и зондов для ПЦР-РВ и оптимизация ПЦР-РВ, лабораторные исследования биологического материала методами ПЦР и ПЦР-РВ, амплификация и секвенирование межгенных промежутков штаммов российской коллекции С. burnetii при их анализе методом мультиспейсер-типирования, статистическая обработка данных. Соавторами осуществлялась консультативно-методическая помощь и предоставление технической базы для выполнения работы.
9. Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы (13 отечественных и 131 зарубежных источников). Работа изложена на 119 страницах машинописного текста; содержит 14 таблиц, иллюстрирована 14 рисунками.
Автор выражает глубокую благодарность директору ФГУН «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора члену-корреспонденту РАМН, профессору Жебруну А.Б. за возможность проведения работы, руководителю диссертации, заведующему лабораторией зооантропонозных инфекций д.м.н. Токаревичу Н.К.; академику РАМН Тотоляну А.А. и профессору Суворову А.Н., руководителю Центра по изучению риккетсий Средиземноморского университета (Марсель, Франция), профессору Раульту Д., и научным сотрудникам Центра - Руке В. и Глазуновой О.О., за содействие в проведении эксперимента и консультативную помощь; профессору Нарвской О.В. и Калининой О.В., ЦГСЭН Ленинградского военного округа Министерства Обороны РФ и Змеевой Т.А. за методическую помощь.
Характеристика генома С. burnetii
С. burnetii - облигатный фаголизосомальный паразит эукариотических клеток, не размножайющийся на искусственных питательных средах. Морфологически С. burnetii — грамотрицательная бактерия, размером 0,2-0,4 х 0,4-1 мкм (McCaul T.F., Williams J.C., 1981; Holt J.G., Krieg N.R., 1984), хотя клетки обнаруживают высокую вариабельность по форме и размерам и могут встречаться в виде коккобацилл, палочковидных или биполярных и нитевидных форм, либо, в редких случаях, располагаться в цепочках (Heinzen R.A. et al., 1996).
Несмотря на то, что коксиелла обладает клеточной стенкой, схожей по составу с таковой у грамотрицательных бактерий, обычно она не окрашивается с помощью окраски по Граму (Burger С. et al., 1996). Для окрашивания С. burnetii в клинических образцах или лабораторных культурах используется окраска по Гименец (Gimenez D. F., 1964). Поскольку коксиелла была обнаружена в клещах, и не культивируется на обычных питательных средах, её относили к порядку Rickettsials, семейству Rickettsiaceae, и трибе Rickettsiae, вместе с родом Rickettsia и Rochalimaea (Weiss Е., Moulder J.W., 1984). Возможности молекулярно-генетических методов позволили провести филогенетические исследования, основанные, главным образом, на анализе последовательности гена 16S rRNA, которые показали, что род Coxiel/a принадлежит к у-подгруппе протеобактерий (Weisburg W. G., Woese C.R., 1985; Wilson К.Н., Blitchington R., 1989; Stein A., Saunders N.A., 1993) вместе с близкородственными родами Legionella, Francisella и Rickettsiella.
У С. burnetii наблюдаются антигенные вариации, которые связаны в основном с мутационными изменениями структуры липополисахаридов (ЛПС) (Hackstadt Т., Peacock М., 1985), что может служить дополнительным материалом для изучения генетической гетерогенности и дифференциации штаммов. Так, сравнение различных изолятов в зависимости от вариантов липополисахаридов, с использованием иммуноблоттинга и электрофореза в полиакриламидном геле, показало их распределение, соответствующее распределению по геномным группам (Hackstadt Т., 1986). Фаза I является природной, обнаружена в организме инфицированных животных, членистоногих и человека; она является высоковирулентной и связана с ЛПС «гладкого» («smooth») типа. Фаза II не обладает высокой вирулентностью, наблюдается только, в лабораторных условиях после серии пассажей коксиелл на культуре клеток или в куриных эмбрионах. Для фазы II характерны разветвленные ЛПС «шероховатого» («rough») типа и отсутствие некоторых белков — детерминант клеточной поверхности. Состав Сахаров, входящих в ЛПС, также различается (То Н. et al., 1998).
Прошедшие промежуточное число пассажей культуры относят к промежуточному типу. Для этих клеток характерно наличие полисахаридов с начальной стадией редукции углеводной цепи (QuevedoDiaz М., Lukacova М., 1998) Существует определенный порог, до наступления! которого возможен обратный переход фазы II в фазу I в случае пассирования маловирулентного варианта штамма в организме животных (Kazar J. et al., 1974; Williams J., Thomas A., 1986).
Предпринимались различные попытки объяснить фазовую вариабельность, коксиеллы Бернета. Некоторые авторы полагали, что причиной этого феномена является потеря внехромосомной ДНК, в частности, плазмиды QpHl. В экспериментах (Samuel J., Frazier М., 1985) было показано, что данная плазмида сохраняется в клетке при фазовом переходе и ее нуклеотидная последовательность не изменяется. Возможно, имеет место контроль экспрессии хромосомных генов, ответственных за фазовые вариации, со стороны плазмиды (Williams J., Thomas А., 1986).
В аттенуированных образцах фазы II штамма Nine Mile обнаружены значительные хромосомные делеции, с которыми, по-видимому, и связаны антигенные фазовые вариации (Hoover Т., CulpD., 2002). Интересно, что у переходных форм также отмечена небольшая хромосомная делеция. Предположительно, делегированные гены кодировали эпимеразы, дегидратазы, гликозилтрансферазы нуклеотидных Сахаров (Seshadri R. et al., 2003).
Жизненный цикл С. burnetii обладает рядом характерных свойств, которые делают этот возбудитель особо устойчивым как к защитным факторам организма хозяина, так и к факторам внешней среды.
Важной особенностью С. burnetii, для изучения которой применение молекулярно-генетических методов, благодаря их быстроте, высокой чувствительности и возможности количественного определения имеет большое значение, - это способность коксиелл фазы I долго выживать в моноцитах и макрофагах клеток (Mege J., Maurin М., 1997), и вызывать персистирующую инфекцию, как у людей, так и у животных, в течение месяцев и даже лет (Васа О. G., Paretsky D., 1983; Mannion В.Р., Storm Р.А., 2005). С. burnetii фазы II проникает в макрофаги моноцитарного происхождения - единственные известные клетки-мишени у человека и млекопитающих - с вовлечением интегриновых рецепторов CR3. У инфекционной фазы I блокировано проникновение через CR3, микроорганизм связывается с комплексом LRI (интегрин лейкоцитарного ответа) и IAP (интегрин-ассоциированный белок) (Fournier Р.Е., Raoult D., 1999).
После адсорбции на поверхности чувствительных клеток происходит проникновение патогена внутрь клетки путем эндоцитоза: мембрана клетки хозяина в месте контакта образует инвагинацию, размеры и степень углубления в цитоплазму которой увеличиваются по мере втягивания возбудителя (хотя имеются факты, свидетельствующие о том, что пассивный фагоцитоз - не единственный способ проникновения микроорганизма в клетку) (Maurin М., Raoult D., 1999; Meconi S., Jacomo V., 1998). Коксиеллы отшнуровываются внутрь цитоплазмы пораженной клетки, в результате формируется ограниченная простой мембраной фагосомальная вакуоль, сливающаяся с лизосомальными везикулами аппарата Гольджи (Williams J.C., Waag D.M., 1991).
Уникальность взаимотношения «паразит - хозяин» в случае коксиеллы Бернета проявляется также в прохождении патогеном стадий дифференциации клеточных форм (Meconi S. et al., 1998).
Эти данные приобратают особое значение в соответствии с существующими в настоящее время знаниями о патогенезе Ку-лихорадки, основное значение в механизме которого придается не особенностям штамма, а особенностям организма хозяина. Таким образом, поиски генетических маркеров, которые смогут разделить популяцию С. burnetii на штаммы, вызывающие острое или хроническое течение болезни, не вполне обоснованны.
Выделяют две различимые по размерам, морфологии, ультраструктуре клеточные формы С. burnetii (Heinzen R.A., Howe D. et al., 1996).
Штаммы С. burnetii
Таким образом, данные большинства исследований генетической гетерогенности С. burnetii свидетельствуют о том, что генетическая гетерогенность коксиеллы имеет тесную связь с географическим происхождением штаммов этого возбудителя, притом, что с клиническим течением вызываемого этим штаммом заболевания такой связи не наблюдалось, что мы учли в своей работе.
Более объективные результаты по характеристике генетической структуры популяции дают многих бактериальных видов дают такие методы, как мультилокус-энзим-электрофорез и мультилокус-сиквенс-типирование, основанные на анализе «генов домашнего хозяйства» (Selander, R. К., et al., 1986; Musser, J. M., 1996).
Для типирования штаммов многих видов использовался метод MLST в сочетании с алгоритмом BURST. Но эта комбинация достаточно эффективна только в случае, если изучаемый housekeeping ген - ген, обеспечивающий жизненно-важные функции микроорганизма, имеет различные формы внутри изучаемого вида. Например, внутри вида Yersinia pestis не обнаружено никаких различий в изучаемом housekeeping гене (Achtman М. et al., 1999). Между тем, с применением метода МСТ стало возможным дифференцировать внутри вида три различных биовара Antiqua, Medievalis и Orientalis (Drancourt М. et al., 2004), и показать, что дискриминационная способность МСТ превосходит этот показатель у MLST.
Метод же MLVA, позволяя типировать штаммы и изоляты, предположительно позволяя определять источник инфекции и его географическое происхождение, не дает филогенетических характеристик штаммов.
Но эти методы неприменимы при мониторинге госпитальных вспышек или вспышек в локальной популяции. Для этого необходимы методы с повышенной дискриминационной способностью - пульс-гель-электрофорез, RAPD, AP-PCR, AFLP, ERIC-PCR, IRS-PCR, сполиготипирование, риботипирование и изучение микросателлитов. Эти методы высоко дискриминативны, но трудоемки, могут требовать больших количеств очищенной ДНК (например, PFGE), быть в некоторой степени субъективными (например, AP-PCR, риботипирование), и дают результаты, которые не всегда могут быть воспроизводимы или мобильны для других лабораторий. Другой недостаток описанных выше методов - эмпирический выбор сиквенсов-мишеней. В связи с описанными сложностями, применение метода МСТ для анализа С. burnetii представляется весьма актуальным. Вышеперечисленные ограничения применяемых для генетической характеристики штаммов С. burnetii методы обосновывают необходимость испытать возможности метода МСТ для определения связи между последовательностью множественных межгенных участков и филогенетическим родством штаммов. Для характеристики С. burnetii метод до настоящего времени не использовался. Одно из основных достоинств метода МСТ связано с тем, что он использует мишени, заведомо вариабельные, что может быть более успешным для дифференциации штаммов внутри консервативных видов. Метод мультиспейсерного типирования основан на сиквенс-анализе комбинации отдельных межгенных участков - потенциально высоковариабельных, вследствие отсутствия селекционного давления на них в ходе эволюции, регионов. Он является универсальным, благодаря однозначности данных секвенирования и доступности базы данных по ним в сети Интернет (Gene Bank). Это позволяет сравнивать результаты, полученные в различных лабораториях, без обмена изолятами. Есть данные об успешном применении метода МСТ для дифференциации штаммов Rickettsia prowazekii и Rickettsia conorii: так, анализ 4 высоковариабельных спейсеров позволил разделить 39 изолятов Rickettsia conorii на 27 генотипов, соотносящихся с географическим происхождением штаммов (Fournier Р.-Е., et ah, 2004), Bartonella henselae: при анализе 75 штаммов и изолятов было выделено 50 генотипов, которые при построении филогенетического дерева кластеризовались в зависимости от клинической формы заболевания (Li W., Raoult D., Fournier Р.-Е., 2007). В другом исследовании при анализе девяти наиболее вариабельных спейсеров для 126 штаммов Bartonella henselae, выделенных от кошек в различных регионах мира, было идентифицировано 39 генотипов, которые кластеризовались по признаку географического происхождения, тогда как применение метода MLST для этой группы штаммов позволило разделить изоляты только по видовой принадлежности источника (Li W., Raoult D., Fournier Р.-Е., 2007). В другом исследовании применение метода МСТ для анализа 77 штаммов Bartonella quintana из 7 регионов мира позволило произвести их разделение на 8 групп по признаку географического происхождения (Woolley M.W., Gordon D.L., Wetherall B.L., 2007). Даже в случае применения МСТ для тех бактериальных видов, для которых разработаны методы с высоким дискриминационным потенциалом, как, например, методы дифференциации штаммов на основе анализа IS-элементов, VNTR и SNP для Mycobacterium tuberculosis, метод показывает большую дискриминационную способность, и находит свое применение. Так, при анализе девяти межгенных промежутков для 101 штамма М. tuberculosis тип ST коррелировал с филогеографическими линиями штаммов. В данном случае метод показал максимальную дискриминационную способность, позволив определить максимальное число профилей среди исследуемых штаммов. При этом следует отметить, что в том же исследовании авторами показано, что при всех возможностях таких высокодискриминативных методов, как RFLP и VNTR, оптимальные результаты можно получить при сочетанном применении методов (Djelouadji Z., Arnold С, et al., 2008). Как отмечено у некоторых бактериальных видов, могут наблюдаться быстрые геномные перестройки вследствие повторов или инсерций, поэтому даже если изоляты происходят от общего предкового генотипа, который появляется несколько десятилетий назад, в этом случае нельзя быть уверенными, что это не минорные варианты того же самого клона. В этих случаях большинство методов не дает возможности проследить географическое распространение того или иного штамма.
ПЦР-РВ, технология SYBRGreen 1
Метод количественной ПЦР в формате реального времени (ПЦР-РВ) обладает высокой чувствительностью и специфичностью, дает возможность быстрого получения результата исследования, позволяет проводить количественную оценку содержания возбудителя в образцах и анализ результатов в режиме закрытой пробирки. Это обусловливает его преимущество относительно метода стандартной ПЦР.
До настоящего времени в России ПЦР-РВ не применялась для детекции возбудителя Ку-лихорадки, в зарубежной печати есть данные об использовании метода только для анализа клинических образцов и культуры клеток (Fournier Р.Е., Raoult D., 2003; Harris R.J. et al, 2000; Brennan R.E., Samuel J.E., 2003). Для мониторинга Ку-лихорадки в природных очагах данный метод не применялся.
ПЦР в формате реального времени — группа методик количественной ПЦР, для которых характерно применение для детекции ПЦР-продукта красителей, обеспечивающих флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта — репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа ПЦР-РВ.
В ходе работы была проведена адаптация метода ПЦР-РВ, технологий SYBRGreen I и TaqMan для выявления С. burnetii в образцах и количественного анализа содержания геномных эквивалентов (ГЭ) в материале, и их сравнительный анализ по показателям чувствительности и специфичности.
Технология ПЦР-РВ SYBRGreen I имеет ряд положительных сторон, а именно: дешевизна ингредиентов реакционной смеси, относительная простота использования, доступность и большие возможности по замене праймеров, связанные с отсутствием необходимости разработки зонда и затрат на него.
Но технология SYBRGreen I имеет ряд существенных недостатков, которые предъявляют повышенные требования к условиям проведения реакции. К таким недостаткам прежде всего следует отнести: ингибирование ПЦР интеркалирующим красителем SYBRGreen I, предпочтительное связывание с GC-богатыми зонами нуклеотидной последовательности (Giglio S. et al., 2003; Gudnason H. et al., 2007), способность SYBRGreen I связываться с любой двухцепочечной ДНК (Zipper Н., Brunner Н. et al., 2004; Gudnason H., Dufva M. et al., 2007), что делает необходимым применение дополнительного анализа кривой плавления или электрофореза для оценки специфичности образовавшегося продукта амплификации, а также необходимость оптимизации концентрации компонентов реакционной смеси в широких пределах (Jung М. et al., 2001; Karsai A. et al., 2002), относительно низкая, даже по сравнению с модификациями этой же технологии ПЦР-РВ, использующими другие интеркалирующие красители, чувствительность, порог которой составляет 5000 копий ДНК и склонность к димеризации праймеров (Gudnason Н. et al., 2007).
Технология SYBRGreen I, благодаря её относительной дешевизне, стала методикой первого выбора для оптимизации выявления и количественной оценки возбудителя Ку-лихорадки в образцах с помощью ПЦР-РВ. В ходе работы были выявлены те особенности условий реакции (концентрация реагентов и ДНК, программа амплификации, анализ кривой плавления), которые позволяют свести к минимуму недостатки метода и оптимизировать выявление С. burnetii. Для оптимизации ПЦР-РВ SYBRGreen I была проведена сравнительная оценка эффективности двух пар праймеров: к генам IS1111 (Fenollar F. et al., 2004) и icd (Klee S. et al., 2006). Мишенью для праймеров IS1111 является фрагмент, длиной 196 п.н., гена транспозазы в составе инсерционного домена IS1111 высокой копийности (19-31 повторов на хромосому), что увеличивает выход продукта амплификации, повышая чувствительность ПЦР (Fenollar F., Raoult D., 2004; Fournier P.E., Raoult D., 2003). Праймеры icd ограничивают участок длиной 76 п.н. гена изоцитратдегидрогеназы (isocitrate dehydrogenase gene (icd)), обладающего высокой консервативностью, что подтверждено, в частности, секвенированием этого гена для многочисленных штаммов С. burnetii. (Nguyen S., Hirai К., 1999) Предварительный эксперимент, целью которого являлась оптимизация условий реакции, проводился на последовательных разведениях ДНК С. burnetii штамма М 44, с содержанием ГЭ от 101 до 10ш и, в качестве отрицательных контролей, - ДНК микроорганизмов видов Leptospira, Ureaplasma, Chlamidia, содержащих 109 ГЭ/мл, деионизированной стерильной воде, крови здоровых доноров. Для оптимизации режимов амплификации решающим был подбор таких показателей, как: Температура и длительность отжига праймеров (от 60до б ГС, 15-40 сек); Температура детекции флуоресценции (от 60 до 72С); Количество циклов (от 36 до 40). Варьирование этих параметров показало, что оптимальные условия проведения реакции для получения максимальной чувствительности и специфичности представлены следующими показателями. Первый цикл: 80 - 2 мин; 95 - 4 мин; последующие 40 циклов: плавление ДНК: 95 - 15 сек; отжиг праймеров и детекция флуоресценции: 60 - 40 сек. В результате подбора оптимального соотношения компонентов реакционной смеси установлено, что наилучшие показатели специфичности и чувствительности достигались при следующем составе реакционной смеси, который можно считать оптимальным (из расчета на 1 пробу общим объемом 25 мкл): дНТФ - 2,5 мкл; реакционный буфер - 2,5 мкл; MgCb — 2,5; праймеры - 0,7 мкл каждого; Гяд-полимераза - 0,4 мкл, вода - 11,7. ДНК - 4 мкл. При указанных параметрах амплификации и составе реакционной смеси получены числовые значения, представленные в таблице 7. Эти значения характеризуют минимальные циклы, на которых регистрируется начало флуоресценции и абсолютные количественные показатели содержания целевой ДНК. Как видно из данных, наиболее рано (12,7 цикла) флуоресценция начинает детектироваться в реакции с праймерами IS1111 со стандартным положительным образцом, содержащим 1010 клеток С. burnetii. Для праймеров icd значение для того же образца составило 15,6 цикла. Для каждого из праймеров в образцах с последовательными разведениями с содержанием ГЭ от 10 до 10 . Наблюдалась прямая зависимость цикла пороговой флуоресценции от концентрации субстрата. Образцы, не содержащие ДНК С. burnetii, также демонстрировали репортерную флуоресценцию: значения циклов пороговой флуоресценции для этих образцов совпадали с циклами для образцов с содержанием от 101 до 103 клеток С. burnetii. В качестве стандарта для определения абсолютного количества ГЭ использовался образец с содержанием 104 ГЭ.
Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции
При характеристике российской популяции дополнительной иллюстрацией филогенетической удаленности двух генотипов, выявленных на территории России: ST7 и ST23, при изучении 13 штаммов из различных географических регионов, и косвенным свидетельством их различного географического происхождения служит анализ следующих особенностей. Так, для России характерна наибольшая генетическая однородность популяции коксиелл при сравнении с популяциями, циркулирующими на территориях других государств. Так, на территории Германии, при исследовании 11 штаммов, выявлено 7 генотипов; на территории Словакии выявлено 4 генотипа при анализе 4 штаммов (табл. 12). Схожее со свойственной российским штаммам генетической гомологичности проявляют только штаммы, выделенные на территории Японии (5 штаммов — 1 генотип ST16) (табл. 12) и Канады (в Новой Шотландии, -высокоэндемичной по Q лихорадке области) - (7 штаммов - один генотип ST 21). Генетические собенности штаммов из Канады могут быть обусловлены быстрым и недавним распространением генотипа, свойственному одному штамму.
Дополнительной иллюстрацией значительных отличий между двумя генотипами, выделенными на территории России, является сравнительный анализ последовательностей наиболее гетерологичных спейсеров. Так, при анализе межгенного промежутка сох18 для генотипов: ST23, близкородственных ему ST22 и ST24, а также ST7, относящемуся к другой монофилетической группе, выявлена значительная степень отличий между генотипами, входящими в разные монофилетические группы. Как видно из схемы, характеризующей последовательность межгенного промежутка 18, различия между штаммами, выделенными на территории России, но представляющими разные генотипы (ST 7 и ST 23), значительно больше, чем между штаммами из России, принадлежащими к генотипу ST 23 и штаммами, принадлежащими к генотипу ST 22, выделенными на территории Словакии (рис. 14). Так, степень различий между объединенной последовательностью множественных межгенных промежутков генотипов ST 22 и ST 23 составляет 0,02 % (1 нуклеотид), и различия затрагивают лишь один межгенный промежуток 61. Различия между генотипами ST7 и ST 23 затрагивают все 10 анализируемых межгенных промежутков, и степень различий составляет 1,72% (83 нуклеотида). Одним из практических результатов этого исследования может быть ретроспективный анализ вспышек Ку-лихорадки в Ленинграде в 1954-1958 годах. По мнению исследователей этих вспышек, при анализе причин заболеваний выявлялись следующие группы больных в зависимости от источника заражения: 1) Заражение возникало в результате контакта с сырьем животного происхождения (шкуры, шерсть, сырое мясо); 2) Заражение связано с обработкой хлопка, завезенного из энзоотических очагов Ку-риккетсиоза, или с его отходми; 3) Заражение произошло вне Ленинграда (Токаревич К.Н., Васильева Л.Д., 1959). Таким образом, случаев Ку-лихорадки, при которых было бы подтверждено заражение от местного источника инфекции, к моменту выделения штаммов Ленинград-2 и Ленинград-4 описано не было. И, хотя, согласно литературным данным этого периода (Токаревич К.Н., Васильева Л.Д., 1958), отмечалась существенная вариабельность клинического течения Ку-лихорадки, зависящая, предположительно, от географического происхождения источника заражения, не было отмечено отличий в тяжести течения заболевания для больных, от которых были выделены штаммы Ленинград-2 и Ленинград-4, что дополнительно затрудняло выявление происхождения источника С. burnetii. Начиная со 2-й декады апреля 1955 года обратили на себя внимание множественные лихорадочные заболевания среди рабочих одного из крупных хлопкоперерабатывающих комбинатов, получающих хлопок преимущественно из неблагополучных по Ку-лихорадке республик Средней Азии, в основном из Туркмении (Токаревич К.Н., Васильева Л.Д., 1958). В это же время на различных предприятиях города (фабрики, заводы, артели) были установлены одиночные заболевания Ку-лихорадкой. Авторы предположительно говорили о завозе сырья и отходов производства хлопкопрядильных предприятий из среднеазиатских регионов СССР (Васильева Л.Д., 1961). Отличие большинства российских штаммов С. burnetii, генотип ST23, от штаммов Ленинград-2 и Ленинград-4 (ST7), выделенных от больных в 1955 и 1957 году, соответственно, по-видимому, свидетельствует об импорте последних из географически отдаленного источника с зараженным сырьем. Как видно из таблицы 13, все штаммы, кроме штаммов Ленинград-2 и Ленинград-4, выделенные на территории Российской Федерации, даже на взаимоудаленных территориях, относятся к 23 типу сиквенса. Штаммы же Ленинград-2 и Ленинград-4 значительно отличаются генетически, и относятся к 7 типу сиквенса. Кроме этих штаммов к тому же типу сиквенса относится лишь один штамм, выделенный в Париже в 1933 году. К этому типу сиквенса наиболее близки филогенетически типы сиквенсов, представляющие штаммы из Франции, Испании, Украины и Киргизии. Отсутствие штаммов из Туркмении, включенных в исследование, и недостаточное количество штаммов из других среднеазиатских стран не позволяет установить характерные типы сиквенсов, свойственные штаммам, циркулирующим на данных территориях, что затрудняет типирование штаммов предположительно среднеазиатского происхождения.
