Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 13
1.1. Краснуха. 13
1.2. Эпидемиология краснухи. 14
1.3. Краснуха у беременных и СВК. 16
1.4. Серологическая диагностика краснухи. 17
1.5. Общая характеристика вируса краснухи. 18
1.6. Структурные белки вируса краснухи. 19
1.7. Организация генома вируса краснухи . 20
1.8. Репликация генома вируса краснухи. 21
1.9. Особенности гуморального иммунного ответа при краснухе. 21
1.10. Развитие серологических методов в диагностике краснухи 22
1.11. Лабораторная диагностика краснухи в довакцинальный период. 26
1.12. Лабораторная диагностика краснухи в период элиминации. 27
1.13. Иммуноферментный анализ в диагностике инфекции краснухи. 30
1.14. Подтверждающие методы диагностики краснушной инфекции. 32
1.15. Автоматизированные диагностические комплексы. 35
1.16. Диагностика краснухи во время беременности. 36
1.17. Вакцинопрофилактика краснухи. 36
1.18. Эпидемиология СВК. 38
1.19. Патогенез СВК. 39
Заключение 41
Глава 2 Материалы и методы 42
2.1. Материалы и реагенты. 42
2.1.1. Клинический материал 43
2.1.2. Стандартные образцы. 43
2.1.3. Основные реагенты. 43
2.1.4. Прочие реагенты 45
2.1.5. Диагностические тест-системы . 45
2.2. Буферные растворы. 45
2.3. Оборудование. 47
2.4. Методы исследования. 48
2.4.1. Биохимические методы. 48
2.4.2. Серологические методы. 49
2.4.3. Статистические методы и программное обеспечение. 50
Глава 3. Собственные исследования 51
3.1. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного выявления IgG антител к вирусу краснухи. 52
3.1.1. Получение иммуносорбента антигена вируса краснухи. 52
3.1.2. Оптимизация основных условий проведения иммуноферментного анализа. 58
3.1.3. Сравнительная оценка антивидовых конъюгатов. 59
3.1.4. Определение диапазона линейной зависимости оптической плотности от концентрации IgG антител . 61
3.1.5. Определение оптимального разведения образцов. 62
3.1.6. Воспроизводимость результатов при количественной оценке уровня IgG-антител к вирусу краснухи. 63
3.1.7. Оценка диагностической чувствительности ИФТС для определения IgG к вирусу краснухи. 64
3.1.8. Оценка аналитической чувствительности при определении IgG
к вирусу краснухи. 65
3.1.9. Оценка распределения уровня IgG к вирусу краснухи в исследуемой популяции. 67
3.1.10. Оценка диагностической специфичности тест-системы при выявлении IgG к вирусу краснухи. 68
3.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления IgM
антител к вирусу краснухи на основе метода «захвата». 69
3.2.1. Получение пероксидазного конъюгата на основе краснушного антигена и оценка его специфической активности. 70
3.2.2. Получение иммуносорбента для выявления IgM антител человека методом «захвата». 72
3.2.3. Определение порогового уровня тест-системы для IgM к вирусу краснухи. 73
3.2.4. Оценка специфичности тест-системы для выявления IgM к вирусу краснухи. 74
3.2.5. Определение чувствительности тест-системы для выявления IgM к вирусу краснухи. 75
3.2.6. Исследование стабильности аналитических свойств тест-систем в процессе хранения. 78
3.3. Исследования популяционного иммунитета к вирусу краснухи различных групп населения (беременные, дети, доноры).
Особенности применения ИФТС в диагностике краснухи. 79
3.3.1. Сравнительная количественная оценка уровня IgG к вирусу краснухи в сыворотке крови с использованием иммуноферментных тест-систем отечественных и зарубежных производителей . 80
3.3.2. Сравнительная оценка диагностической значимости выявления IgM к вирусу краснухи с помощью иммуноферментных тест-систем в условиях спорадической заболеваемости. 81
3.3.3. Исследование напряженности коллективного иммунитета к вирусу краснухи на территории Московской области. 82
3.3.4. Исследование серопревалентности к вирусу краснухи среди пациентов детской клинической больницы. 84
3.3.5. Сравнительная оценка уровня антител к вирусу краснухи в сыворотках крови с помощью методов ИФА и РТГА. 86
3.4. Обсуждение результатов 90
Выводы 99
Список литературы
- Организация генома вируса краснухи
- Диагностические тест-системы
- Определение диапазона линейной зависимости оптической плотности от концентрации IgG антител
- Сравнительная количественная оценка уровня IgG к вирусу краснухи в сыворотке крови с использованием иммуноферментных тест-систем отечественных и зарубежных производителей
Организация генома вируса краснухи
Краснуха - острое респираторное вирусное заболевание, была впервые описана еще в середине 18 века двумя немецкими врачами (De Bergen, Orlow) и далее была известна под термином Rteln. Дифференциальная диагностика краснухи (от кори и скарлатины) впервые была проведена Вагнер (Wagner) в 1829 году. В 1866 г. появился термин Rubella, предложенный шотландским врачом Veale, плодотворно работавшим над клинической характеристикой и значением краснухи. Долгое время краснуху ошибочно диагностировали, как разновидность кори и использовался неоднозначный термин German measles.
В 1881 году на международном медицинском конгрессе в Лондоне краснуха была выделена в самостоятельную нозологическую форму, и термин Rubella утвердился в качестве общепринятого.
Вирусная этиология краснухи была впервые показана японскими учеными Hiro Y. и Tasaka S. (1938), путем заражения группы детей фильтратом смывов носоглотки от заболевших.
Заболевание «краснуха» многие годы относили к так называемым малым детским инфекциям, однако в 1941 году австралийский офтальмолог Норманн Грегг опубликовал работу о том, что краснуха у женщин на ранних сроках беременности приводит к развитию дефектов плода (Gregg N.M., 1941). Н. Грегг изучал вспышки краснухи в военных лагерях, передававшиеся на гражданское население и описал у матерей, перенесших во время беременности краснуху, характерные аномалии развития плода: билатеральная катаракта, микрофтальм, глухота и высокий процент аномалий развития сердца. Наблюдения Н. Грегга были первым свидетельством тератогенного эффекта вирусной инфекции. Выводы, полученные Н. Греггом, были в дальнейшем подтверждены эпидемиологами Swan, Greenberg и др (Swan C. et al., 1946). Спустя 2 года они описали ассоциированные с инфекцией поражения сердца, катаракту, глухоту, частое снижение веса и признаки менингита с поражением ЦНС. Все эти симптомы остаются актуальными для диагностики краснухи по настоящее время. Дальнейшие проспективные исследования, проведенные в 1960, 1969 гг. при наблюдении матерей с краснухоподобными симптомами в течение беременности показали, что риск поражений плода варьирует от 10 до 54% (Hanshaw J.B. et al., 1985), что не вполне соответствовало первоначальным наблюдениям Н. Грегга. Однако эти исследования опирались только на клинические данные, без лабораторного подтверждения диагноза, то есть многие матери на самом деле перенесли другую инфекцию.
Последующие многолетние исследования, подтвержденные вирусологическими методами, показали, что краснуха в первом триместре беременности практически неизбежно приводит к инфицированию плода и как следствие, его поражению в 80-85% случаев, что подтвердило первоначальные наблюдения Н. Греггом австралийской эпидемии краснухи 1940 г.
Впервые вирус краснухи был выделен двумя группами исследователей: Т. Веллер, Ф. Неве (Бостон) и П. Паркман, Е.Бушер, М. Артенстейн (Вашингтон) в 1962 году (Parkman P.D. et al., 1962; Weller T.H. and Neva F.A., 1962). Это открытие способствовало в дальнейшем развитию серологических тестов, позволявших опровергнуть или подтвердить первоначальный клинический диагноз.
С развитием методов молекулярной биологии в 1986 г. были секвенированы участки генома вируса краснухи, что позволило использовать метод полимеразной цепной реакции для выявления РНК вируса краснухи в диагностических целях (Clarke D.M. et al., 1987). Полный сиквенс генома вируса краснухи был проведен в 1990 г (Dominguez G. et al., 1990).
Вирус краснухи переносится исключительно человеком. Способ передачи – воздушно-капельный, заражение происходит, как правило, при повторных контактах. Замечено, что беременные обладают повышенной чувствительностью к вирусу. Инкубационный период после заражения составляет 2-3 недели. Заболевший выделяет вирус, как правило, за 5 дней до начала клинических проявлений и 5 дней спустя (Львов Д.К., 2008). При выраженных клинических проявлениях у 80% заболевших вирус выделяется в течение 9 дней после появления сыпи (Потарская Е.В., 2008). Динамика заболеваемости краснухой имеет сезонный характер. Пик заболевания в основном приходится на зимне весенний период. Для краснухи характерно чередование периодов относительного эпидемического благополучия с инфекционными вспышками, возникающими при накоплении в популяции неиммунной прослойки.
Крупнейшая современная вспышка краснухи в США 1963-64 гг. по некоторым оценкам привела к поражению 20-30 тыс. новорожденных. Наблюдения за патогенезом синдрома врожденной краснухи (СВК) привели к пониманию, что вирус краснухи вызывает не только генерализованную, но и персистирующую инфекцию, развивающуюся в постнатальном периоде. В это время возник термин «синдром расширенной краснухи». Наблюдения за периодическими вспышками инфекции краснухи и осознание социальной значимости этой инфекции обосновали необходимость разработки соответствующей вакцины, и в 1965-1966 гг. первая аттенуированная вакцина против краснухи была создана. В 1969-1970 гг. были лицензированы вакцины против краснухи в СЩА и Великобритании, и началась реализация первых программ вакцинации. Значительным усовершенствованием в борьбе с краснухой стало лицензирование первой тривакцины корь-краснуха-паротит (MMR) в США в 1971 г. Последовательное осуществление государственных программ вакцинации в дальнейшем привело к элиминации краснухи во многих индустриальных странах Европы и Америки. В настоящий момент на повестке дня ВОЗ стоит задача элиминациии эндемичной краснухи в Восточноевропейском регионе и в некоторых развивающихся странах. В РФ вакцинация против краснухи включена в Национальный календарь прививок и выполняется в рамках Национальной Программы элиминации эндемичной краснухи и снижения уровня СВК до 0,01 на 1000 живых новорожденных.
Диагностические тест-системы
При проведении серологического мониторинга населения оценивают уровень IgG к вирусу краснухи в декретируемых группах методом ИФА (Профилактика кори, краснухи и эпидемического паротита: СП 3.1.2952-11). В России разрешены к применению несколько тест-систем для выявления IgG-антител к вирусу краснухи отечественного и зарубежного производства. Тест-системы для выявления IgG к вирусу краснухи реализованы на основе так называемого «непрямого метода» ИФА, когда на твердой фазе иммобилизован антиген вирус краснухи, а связавшиеся специфические антитела детектируют при помощи антивидового IgG-конъюгата. В качестве ферментной метки используются, как правило, пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза.
Для сорбции на твердой фазе в ИФА могут быть использованы антигены различной природы: натуральные вирусные лизаты, рекомбинантные вирусспецифические белки, вирусоподобные частицы (Grangeot-Keros L., 1995; Grangeot-Keros L. and G. Enders, 1997; Zrein M., 1993; Qiu Z., 1994). Для синтеза белка Е1 также используется модель в культуре дрожжей (Wen H., 2005). Показана потенциальная возможность использования рекомбинантных fusion-белков, продуцируемых в культуре E.coli (Starkey W.G., 1995).
Один из перспективных подходов, актуальный при диагностике краснухи методом ИФА - использование синтетических пептидных антигенов SP15 (Wolinsky J. et al., 1993; Pustowoit B. and Liebert U., 1998: Cordoba P. et al., 2000) и пептидов BCH-178 (Pedneault L., 1994; Gieauf A., 2004). Сравнительные исследования показали высокую специфичность (100%) и чувствительность (98%) этих методик относительно тест-систем на основе культурального вирусного антигена (Cordoba P., 2000). Модификация ИФА на основе пептидов
BCH-178 относительно менее чувствительна – в данном варианте метода имеющихся доменов пептида недостаточно для полноценного связывания нейтрализующих антител, связывается только определенная часть Н-АТ (Mitchell L.A., 1992).
Современные коммерческие тест-системы для выявления IgG к вирусу краснухи характеризуются диагностической чувствительностью и специфичностью на уровне 97-99%. Уровень совпадения результатов при качественной оценке антител с помощью тест-систем различных производителей составляет 95-98% (Dimech W., 2005).
Однако, при проведении количественной оценки специфических IgG (концентрация оценивается в МЕ/мл), результаты, полученные с помощью различных тест-систем, могут существенно отличаться (Dimech W., 1992; 2008). Вероятно, данное обстоятельство связано с вышеупомянутыми различиями в природе используемых на твердой фазе антигенов, форматом проведения ИФА, различиями в составе используемых буферных растворов. На настоящий момент проблема унификации количественных тест-систем пока еще ждет своего решения.
Одним из перспективных направлений в развитии иммуноферментного анализа является определение антител не только в сыворотке крови, но и других биологических жидкостях – например, в слюне пациентов. Использование неинвазивных методов сбора клинического материала особенно актуально при проведении сероэпидемиологических исследований у детей (Mortimer P.P., 1988; Vyse A.J., 1999 Gay N.G., 2003; Abernathy E.S. et al., 2009). Так, адаптация метода «capture» для выявления антител в слюне к вирусу краснухи позволила выявить вирусспецифические IgM-антитела с высокой чувствительностью и специфичностью (96,9% и 100%) относительно референс-диагностики в сыворотке крови (Vijayalakshmi P. et al., 2006). Методика определения низкоавидных антител к вирусу краснухи также была модифицирована для определения в слюне (Akingbade D., 2003). В таких странах как Великобритания, определение IgG-антител к вирусу краснухи в слюне признано альтернативным методом исследования традиционному с использованием сыворотки крови. Показано, что при сероэпидемиологическом обследовании детей может быть эффективно выявление IgG к вирусу краснухи в моче (Takahashi S., 1998).
При диагностике краснушной инфекции и СВК основным критерием наличия острого инфекционного процесса является выявление специфических IgM-антител. Чувствительность современных иммуноферментных тест-систем при выявлении IgM к вирусу краснухи по данным литературы составляет 97-99% (Hudson P. and Morgan-Capner P., 1996). Близкий уровень чувствительности демонстрируют как тест-системы, сконструированные на основе непрямого метода, так и на основе метода “capture”.
Показано, что в условиях массовой вакцинопрофилактики населения и значительного снижения случаев краснухи увеличивается относительное количество ложноположительных результатов при выявлении IgM-антител и снижается диагностическая значимость получаемых IgM-положительных результатов (Cutts F.T. and Brown D., 1995). Параметром, в основном определяющим диагностическую эффективность ИФТС становится ее специфичность. Развитие тест-систем, использующих метод «захвата» (capture) для выявления IgM антител к вирусу краснухи представляет собой наиболее перспективный путь решения проблемы. Преимущества метода связаны с отсутствием влияния на результаты анализа конкурирующих за сайты связывания IgG антител, и отсутствием влияния на результаты реакции большинства неспецифических факторов.
В тест-системах, основанных на непрямом методе зачастую ложноположительная реакция обусловлена присутствием в крови ревматоидного фактора, представляющего собой аутоантитела к Fc-фрагменту иммуноглобулина, как правило IgM-класса. Для снижения в ИФА неспецифической реакции используют предварительную инкубацию образца сыворотки с анти-человеческими IgG-антителами. Присутствующие в сыворотке IgG антитела связываются, и цепочка реакции, обусловленная наличием ревматоидного фактора, таким образом, прерывается. Побочным эффектом, подобной методики может быть некоторое снижение чувствительности тест-системы поскольку уровень сигнала IgМ-антител также падает.
В большинстве работ использующих метод «capture» для выявления IgM-антител против краснухи реализуется следующая схема: на подложке находятся антитела к -цепям человеческого иммуноглобулина, связавшиеся IgM- антитела захватывают нативный или рекомбинантный антиген ВК и образовавшийся комплекс выявляется при помощи меченых моноклональных антител к ВК (Tedder R.S., 1982; Gerna G., 1987; Grangeot-Keros L. and Enders G., 1997). В процессе валидации чувствительность и специфичность IgM-тест-систем обязательно должны быть исследованы с использованием адекватно сформированных панелей сывороток. В панели должны присутствовать: положительные и отрицательные образцы, образцы от пациентов с другими инфекциями, а также от пациентов с аутоиммунными заболеваниями (Matter L., 1994; Hudson P. and Morgan-Capner P., 1996). Сравнительные исследования 7 коммерческих тест-систем для выявления IgM-антител к вирусу краснухи (Tipples G., 2004) показали, что чувствительность непрямого метода, и метода “capture” могут колебаться в пределах 74,1%-78,9%, а специфичность – в пределах 85,6%-97,2%.
Определение диапазона линейной зависимости оптической плотности от концентрации IgG антител
Согласно проведенным ранее исследованиям (Leuridan Е., 2011), материнские IgG-антитела к вирусу краснухи, переданные трансплацентарно, с вероятностью 95% отсутствуют в крови детей, начиная с 6 мес возраста. Принимая во внимание данное обстоятельство, для оценки специфичности тест-системы в соответствии с отработанными условиями проведения ИФА были исследованы 50 сывороток детей в возрасте 6 - 12 мес, не вакцинированных против краснухи и не имевших в анамнезе перенесенную краснуху (таблица 4).
Пороговый уровень концентрации IgG к вирусу краснухи соответствовал 10 МЕ/мл. Результаты исследований представлены в таблице 16. Из представленных данных видно, что 96 % детей не имели IgG-антител к вирусу краснухи или содержали их в концентрации менее 10 МЕ/мл. Полученные результаты согласуются с данными литературы и подтверждают специфичность разработанной тест-системы .
Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления IgM антител к вирусу краснухи на основе метода «захвата».
Последние лабораторные руководства ВОЗ по методам детекции IgM антител к вирусу краснухи рекомендуют использовать как наиболее специфические и высокочувствительные ИФТС, сконструированные на основе так называемого метода “capturе” или метода захвата (Руководство по лабораторной диагностике кори и краснухи. Вторая редакция, 2005). Отмечают, что ИФТС, сконструированные на основе непрямого метода, потенциально обладают более низкой специфичностью. Присутствие в сыворотке крови ревматоидного фактора, антинуклеарных антител приводит к получению ложноположительных результатов. Напротив, конкуренция между специфическими IgG и IgM антителами при связывании с антигеном приводит к ложноотрицательным результатам при выявлении IgM антител.
Ревматоидный фактор в основном представлен IgM-аутоантителами к Fc-фрагменту IgG человека. Одним из способов устранения неспецифического влияния ревматоидного фактора является предварительное связывание IgG антител в образце с IgG-антисывороткой. Таким образом блокируются потенциальные сайты связывания для ревматоидного фактора (Crowther J.R., 2002). Однако, одним из побочных эффектов данной методики зачастую является снижение положительного сигнала тест-системы вследствие неспецифического связывания IgM антител в исследуемом образце с антисывороткой. Это может приводить к занижению уровня чувствительности тест-системы.
При разработке новой тест-системы для выявления IgM антител к вирусу краснухи была использована следующая принципиальная схема метода “capture”:
На твердой фазе сорбируют мышиные моноклональные антитела к -цепям иммуноглобулина человека. С ними связываются присутствующие в образце IgM-антитела. Далее, с вирусспецифическими IgM антителами связывается конъюгат, представляющий собой антиген вируса краснухи, меченный пероксидазой хрена. Полученный иммунный комплекс выявляют с помощью индикаторного раствора (на основе тетраметилбензидина), останавливают развитие окраски внесением стоп-реагента и регистрируют оптическую плотность при длине волны 450 нм. Интенсивность окраски в лунках планшета пропорциональна количеству связавшегося IgM.
Реализованный в новой тест-системе вариант метода «захвата» отличается технологичностью, методической простотой, и в тоже время высокой чувствительностью и специфичностью. Основными задачами при разработке данной тест-системы были: получение активного и стабильного препарата антигенного конъюгата и получение высокоактивного и стабильного иммуносорбента.
Получение пероксидазного конъюгата на основе краснушного антигена и оценка его специфической активности В качестве антигена был использован вирус краснухи штамма HPV-77, полученный в культуре клеток Vero. Концентрация белка по методу Брэдфорда находилась в пределах 0,5-0,6 мг/мл. Концентрацию пероксидазы корня хрена определяли спектрофотометрическим методом (Ishikawa E. et al., 1983). В работу брали пероксидазу с RZ не менее 3,0. Антигенный конъюгат был получен перийодатным методом (Sepp nen H., 1990).
Для оценки специфической активности полученного конъюгата была использована следующая методика: На планшеты Nunc maxisorp сорбировали моноклональные мышиные антитела к гликопротеину Е1 вируса краснухи, любезно предоставленные лабораторией гибридомных технологий НИИВС им. И.И. Мечникова (Заведующая – д.м.н. Нагиева Ф.Г.). Использовались антитела в концентрации 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл. В качестве буферного раствора использовался 0,01 М PBS pH 7,2. Сорбцию антител проводили в течение ночи при комнатной температуре. По окончании сорбции лунки промывали однократно ФСБ-Т, планшеты высушивали в аппарате лиофильной сушки в течение не менее 3-х часов и хранили до использования при температуре 2-80С. Для контроля специфичности реакции использовали лунки, сорбированные БСА и лунки, сорбированные мышиными моноклональными антителами к поверхностному антигену вируса гепатита В. Сорбцию контрольных лунок проводили по аналогичной схеме.
Далее в лунки планшета вносили по 100 мкл разведений антигенного конъюгата с двукратным шагом от 1/100 до 1/1600. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при температуре 37С; Несвязавшийся конъюгат удаляли 3-х кратной отмывкой ФСБ-Т. Связавшийся конъюгат выявляли внесением в лунки индикаторного раствора на основе тетраметилбензидина. Планшеты инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин. После остановки реакции добавлением стоп-реагента измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Сравнительная оценка активности конъюгатов проводилась с использованием программы PARALINE. Из полученных 3-х серий конъюгата в дальнейшей работе использовалась наиболее активная серия №2. (см. рис 7).
Сравнительная количественная оценка уровня IgG к вирусу краснухи в сыворотке крови с использованием иммуноферментных тест-систем отечественных и зарубежных производителей
Задачей вакцинопрофилактики против краснухи в Европейском регионе ВОЗ (к которому относится и Россия) в настоящее время является элиминация эндемичной краснухи. В некоторых странах Европы эта цель уже достигнута. Для контроля эпидемического благополучия населения требуется постоянный мониторинг состояния коллективного иммунитета к вирусу краснухи (Юминова Н.В., 2002). Своевременное выявление лиц, серонегативных к вирусу краснухи среди женщин репродуктивного возраста – одно из условий решения задачи снижения случаев СВК. Обнаружение с помощью метода ИФА IgG-антител к вирусу краснухи в концентрации не менее 25 МЕ/мл считается достаточным для предотвращения вирусемии в результате реинфекции и невозможности развития внутриутробной краснухи с отягчающими последствиями для плода (СП 3.1.2952-11 "Профилактика кори, краснухи и эпидемического паротита" от 28.11.2011 г).
Исследования состояния коллективного иммунитета среди групп риска постоянно проводятся усилиями лабораторий Европейского отделения ВОЗ, в том числе и Российским Национальным центром по надзору за корью и краснухой (Тихонова Н.Т., 2001).
С появлением международного стандарта антител к вирусу краснухи RUBI-1-94 возможности для стандартизации исследований и оценке вновь разрабатываемых коммерческих тест-систем, несомненно, расширились. Тем не менее, широкомасштабные испытания, проведенные на базе сети лабораторий Европейского отделения ВОЗ, показали, что, результаты, получаемые при использовании наборов различных производителей не всегда сопоставимы (Tisher A. et al., 2007; Dimech W., 2008). Различия в технологии производства тест-систем, различия протоколов постановки ИФА и в методиках оценки полученных результатов приводят к указанным расхождениям. Недавние исследования, проведенные среди лабораторий Австралии, показали, что при пороговом уровне 10 МЕ/мл установленные чувствительность и специфичность различных ИФТС варьируют от 70.2 до 91.2% и от 65.9 до 100% соответственно (Dimech W., 2013). Важной задачей подобных исследований должно быть понимание того, как результаты, полученные с помощью различных тест-систем, могут влиять на принимаемые клинические решения.
В 2001-2008 гг в лабораторной сети ВОЗ проводилась оценка достоверности диагностики при выявлении IgM-антител к вирусам кори и краснухи. При исследовании контрольной панели сывороток ВОЗ правильные результаты были получены в 93%-100% случаев (Stambos V. et al., 2011). Большинство лабораторий ВОЗ в этом исследовании для выявления IgG и IgM к вирусу краснухи использовали валидированные ИФТС производства Dade Behring (Германия). При проведении внешней оценки правильности работы в Национальной сети лабораторий по надзору за корью и краснухой c помощью ИФТС ИФА-Краснуха-IgG были получены результаты, аналогичные полученным при использования ИФТС «AntiRubella-IgG» фирмы Dade Behring (неопубл. данные). Таким образом, одним из способов оптимизации серологического мониторинга может быть использование для исследований ИФТС, которые обеспечивают между собой высокий коэффициент корреляции результатов. Повышению достоверности проводимых исследований иммунного статуса к вирусу краснухи могла бы способствовать систематическая пострегистрационная оценка ИФТС с использованием представительных панелей сывороток и стандартных образцов. Последние исследования такого рода в РФ проводились в ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Мотузова Е.В., 2009). В настоящий момент такая работа в стране не проводится.
Важным компонентом решения задачи стандартизации исследований может стать применение унифицированных технологических подходов и решений при создании и в процессе валидирования новых тест-систем. Перспективным представляется при производстве ИФТС более широкое использование антигенов пептидной природы, а также вирусоподобных частиц, полученных при помощи методов генетической инженерии.
Оптимизация серомониторинга краснухи в группах риска В условиях спорадической заболеваемости участились случаи ошибочного первичного клинического диагноза краснуха, не подтверждаемого впоследствии методами лабораторной диагностики. Для эпидемиологии краснухи на современном этапе, связанным с массовой вакцинопрофилактикой, характерно смещение заболеваемости в старшие возрастные группы, с сохранением вовлечения в эпидемический процесс женщин репродуктивного возраста (Frey T.K., 2002; Цвиркун О.И., 2005).
В Российской Федерации оценка иммунного статуса беременных на TORCH-инфекции включена в список рекомендуемых диагностических мероприятий (Приказ М З РФ № 50 от 10.02.2003). В дополнение к существующему алгоритму диагностики краснухи у беременных (МУ 3.1.2.2356-08), представляется целесообразным определение уровня IgG к вирусу краснухи у женщин, планирующих беременность и не имеющих в анамнезе данных о перенесенной краснухе или проведенной двукратной вакцинации.
В соответствии с методическими указаниями, у беременных проводят определение уровня IgG к вирусу краснухи в первом триместре беременности, скрининг IgM-антител на этом этапе не показан. Однако, при выявлении IgG-антител в невысоких титрах, вероятность начальной стадии инфекции краснухи не может быть исключена. В то же время, эпидемиологическая диагностика при превалировании атипических форм краснухи малоэффективна. Диагностическая значимость выявления IgM-антител при спорадической заболеваемости краснухой также требует дополнительного подтверждения. Однозначное заключение о наличии или отсутствии инфекции краснухи можно сделать только после исследования второго образца сыворотки, полученного через 10-14 дней (СП 3.1.2952-11 "Профилактика кори, краснухи и эпидемического паротита").
С другой стороны, если IgG-антитела в защитном титре были выявлены до наступления беременности – необходимость в повторных исследованиях, или использовании дополнительных подтверждающих методов для диагностики краснухи у беременных значительно снижается.
Если IgG-антитела в защитном титре до наступления беременности не были выявлены – следует предложить вакцинацию. При отказе от вакцинации – следует избегать во время беременности контакта с лицами с признаками эритематозной инфекции. Ожидается, что предложенная тактика позволит повысить эффективность лабораторной диагностики беременных c целью предотвращения случаев СВК.
