Введение к работе
Аісгуальпость проблемы. Эпидемический паротит (ЭП) входит в число наиболее распространенных респираторных вирусных заболеваний человека. Возбудитель, вирус паротита, принадлежит к роду Rubulavirus семейства Paramixoviridae. Геном вируса представлен линейной не сегментированной РНК отрицательной полярности. Внутри вируса паротита выделяют 13 генотипов. Данная классификация основана на сравнении последовательности нуклеотидиых остатков гипервариабельной области генома гена малого гидрофобного белка.
Профилактика ЭП осуществляется в рамках плановой вакцинации населения. Средством профилактики ЭП являются живые вакцины на основе аттенуировшшых штаммов. Разные производители вакцин используют или использовали штаммы, относящиеся к различным генотипам: генотип А - Jeryl Lynn, Rubini; генотип В - Urabe; L-Zagreb - отнесен хорватскими исследователями к генотипу D (Ivancic J., et. al., 2004). Российский штамм Лешшград-3 (Л-3) является уникальным и в настоящее время не может быть отнесен ни к одному из известных генотипов (Неверов А.А. и др., 2005; Atra-sheuskaya A.V., et al., 2006).
При применении паротитных вакцин регистрируются поствакцинальные осложнения, одним из которых является поствакцинальный асептический менингит. Так, для штамма L-Zagreb, прямого деривата Российского штамма Л-3, была показана высохая частота возникновения AM, что в свою очередь породило волну негативных спекуляций в отношении российского штамма Л-3 для которого данных по возникновению AM неописано. Для разрешения этой ситуации необходимо создать простой и доступный метода дифференциальной диагностики поствакцинальных осложнений для подтверждения или опровержения поствакцинальной этиологии AM. Помимо этого, необходимо отличать случаи AM, вызванные вирусом ЭП от других заболеваний, вызванных энтеровирусами, сопровождающихся развитием схожих менингиальных симптомов. Учитывая эти факты, а также согласно рекомендации ВОЗ (Global Advisory Committee on Vaccine Safety, Женева 3-4 декабря 2004 г.) об усилении контроля к производственным штаммам паротитных вакцин и критериев оценки их безопасности и иммуногенности необходимо осуществлять контроль генетической стабильности вакцинных штаммов на всех этапах производства.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось разработка молекулярно-генетического метода контроля стабильности вакцины на этапах производства и диагностики поствакцинальных осложнений при применении вакцин против эпидемического паротита на основе штаммов Л-3 и L-Zagreb.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Анализ вакцинного штамма Л-3 на нуклеотидном уровне для выявления возможных
мутаций, возникающих при производстве вакцины.
-
Выбор области генома вируса для дифференцирования вакцинных штаммов Л-3 и L-Zagreb, расчет олигонуклеотидных праймеров, выбор оптимальных условий для амплификации целевого фрагмента, отработка условий рестрикшюнного анализа, позволяющего дискриминировать штаммы Л-3 и L-Zagreb от остальных штаммов вируса паротита.
-
Создание рекомбинантной плазмиды, как положительного контроля, для проведения дифференциальной диагностики поствакцинальных осложнений при применении вакцин на основе штаммов Л-3 и L-Zagreb.
-
На животных провести апробирование подхода по выявлению РНК вируса паротита в образцах крови и глоточных смывах.
-
Оценить эффективность метода дифференциальной диагностики паротита с помощью ОТ-ПЦР в образцах слюны и крови, полученных от больных с диагнозом «эпидемический паротит» и привитых вакциной против эпидемического паротита.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Рассчитаны и получены олигонуклеотидные праймеры для амплификации целевого фрагмента вируса паротита. Сконструирована рекомбинантная плазмида, являющаяся положительным контролем в определении РНК вируса паротита штамма Л-3 и L-Zagreb. Впервые показана возможность дифференциации вакцинных штаммов Л-3 и L-Zagreb от всех штаммов других генотипов вируса паротита с помощью ОТ-ПЦР и рестрикционного анализа. По результатам проделанной работы оформлены и изданы методические рекомендации «Дифференциальная диагностика асептического менингита после применения вакцин против эпидемического паротита на основе штаммов Л-3 и L-Zagreb методом ОТ-ПЦР с последующим рестрикционным анализом» от 28 апреля 2009 г.
Изучены молекулярно-биологические особенности иммуногенности штамма Л-3. Изучено формирование иммунного ответа на введение живой аттенуированной вакцины против ЭП на основе штамма Л-3 у мышей линии BALB/c.
Положения, выносимые на защиту.
1. Геном вакцинного штамма Л-3 вируса паротита, применявшегося для производства
паротитной вакцины в России в 2004 - 2008 годы, является стабильным.
2. Разработанный и апробированный метод ОТ-ПЦР, позволяет детектировать и
эффективно дискриминировать вакцинные штаммы Л-3 и L-Zagreb от всех остальных
штаммов вируса паротита.
Публикации и апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" Россия, Новосибирск, 2006; "Molecular diagnostics of infectious diseases", Belarus, Minsk, 2007, Ш Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Ваюпшология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008.
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения (191 ссылка). Работа изложена на 139 страницах, содержит 20 рисунков, 11 таблиц.
Вклад автора. Результаты изложенных работ, за исключением сбора клинических образцов, получены непосредственно автором.
