Введение к работе
Актуальность проблемы
В мировой практике рентабельность выращивания сахарной свеклы {Beta vulgaris L.) во многом зависит от эффективности борьбы с болезнями и вредителями этой культуры. Сахарная свекла поражается рядом вирусных заболеваний, из которых наиболее экономически значимыми являются ризомания (вызываемая вирусом некротического пожелтения жилок свеклы -Beet necrotic yellow vein benyvirus, BNYVV) и желтуха (Beet yellows closterovirus, BYV). Ризомания регистрировалась практически во всех районах возделывания культуры в Старом и Новом Свете (McGrann et ah, 2009). При поражении ризоманией сахаристость корнеплодов снижается от 8% до 50-60% (Asher, 1993), а снижение урожайности может достигать 30-90% (Johanson, 1985).
Успех борьбы с ризоманией зависит от создания устойчивых сортов, гибридов и линий, в том числе полученных путем внедрения источников устойчивости к BNYVV генно-инженерными методами.
Экспрессия в растениях фрагментов З'-нетранслируемой области (З'-НТО) вирусных РНК геномов имеет определенные преимущества, поскольку вирусные РНК стабильны в течение короткого времени и не являются иммуногенами. З'-НТО BNYVV представляет интерес в качестве нового индуктора устойчивости к ризомании на основе посттранскрипционного умолкания генов или сайленсинга (post-transcriptional gene silencing, PTGS). Для индуцирования сайленсинга часто используют трансгенную экспрессию шпилечной или двунитчатой РНК (Hamilton et ah, 1998; Chuang and Meyerowitz, 2000; Johansen and Carrington, 2001). Шпилечные конструкции, содержащие фрагменты вирусного генома, применялись ранее для создания трансгенных растений сахарной свеклы, томата, огурца и дыни, лайма (Lennefors et ah, 2006; Fuentes et ah, 2006; Pandolfini et ah, 2003; Leibman et ah, 2011; Lopez et ah, 2010). Было показано, что устойчивость в этих случаях индуцируется благодаря
PTGS, что подтверждается присутствием в трансгенных растениях siPHK. В настоящей работе мы сравнивали устойчивость модельных трансгенных растений Nicotiana benthamiana, экспрессирующих двунитчатую форму З'-НТО генома BNYVV, и растений, экспрессирующих мРНК гена белка оболочки (БО) этого вируса.
Цель и задачи работы
Целью работы было изучение З'-НТО генома BNYVV в качестве индуктора PTGS и устойчивости к ризомании в трансгенных растениях.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
конструирование бинарных векторов, обеспечивающих экспрессию в растениях инвертированных повторов З'-НТО BNYVV, формирующих шпилечную структуру (BNYVVsil), или мРНК гена БО (BNYVVcp);
-
оценка подавления транзиентной экспрессии «мишени» (ген GFP, несущий З'-НТО BNYVV) за счет индукции PTGS транскриптом BNYVVsil в растениях N. benthamiana;
-
получение трансгенных растений N benthamiana, экспрессирующих одновременно BNYVVsil (или BNYVVcp) и ген bar, обеспечивающий устойчивость к гербициду BASTA;
-
определение уровня устойчивости к BNYVV трансгенных растений гомозиготного поколения Т2.
Научная новизна
Создана конструкция, несущая ген bar устойчивости к гербициду BASTA, и инвертированные повторы фрагментов З'-НТО BNYVV (BNYVVsil), индуцирующие сайленсинг в растениях. Эффективность этой конструкции для индукции PTGS показана с помощью метода транзиентной коэкспрессии конструкций «мишени» (ген GFP, несущий З'-НТО BNYVV) и «индуктора» BNYVVsil.
Впервые получены трансгенные растения N. benthamiana, в которых подтверждена экспрессия трансгенной вставки в поколениях Т0 и Т2. В трансгенных растениях Т2 доказана индукция PTGS при транзиентной экспрессии «мишени» (ген GFP - З'-НТО BNYVV).
Проведена оценка устойчивости трансгенных растений поколения Т2 к механической инокуляции BNYVV. Растения Т2 BNYVVsil проявляли толерантность к инфекции BNYVV, симптомы вирусной инфекции развивались на них с задержкой. Таким образом, подтверждена возможность использования BNYVVsil как потенциального источника устойчивости к ризомании в растениях сахарной свеклы.
Практическая значимость
На модели растений N. benthamiana показана возможность получения трансгенов, сочетающих признаки устойчивости к гербициду и вирусной инфекции. Толерантность к ризомании была основана на стабильной экспрессии в растениях двунитчатых форм З'-НТО BNYVV. Экспрессия в модельных трансгенных растениях двух кДНК, введенных с помощью одного бинарного вектора, показывает возможность получения трансгенных растений сахарной свеклы, несущих два ценных признака - устойчивость к гербициду и к инфекции BNYVV.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на Международной конференции «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва-Звенигород, 2011), XXIV Зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2012 г), «9th International congress of plant pathology» (Турин, Италия, 2008), 4th International Conference and Exhibition «RNAi2009: ncRNA: Bridging Biology and Therapy» (Оксфорд, Великобритания, 2009), 3rd International Symposium on Plant Protection and Plant Health in Europe (Берлин,
Германия, 2009), Inernational Conference «Plant transformation technologies II» (Вена, Австрия, 2011).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе две статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и включают 56 рисунков и 5 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы из 250 источников и приложения.
