Введение к работе
Актуальность темы
Мембранные белки (МБ) человека являются перспективными мишенями для разработки новых фармакологических препаратов. Для создания лекарственных средств, обладающих высокой селективностью по отношению к мембранным рецепторам определенного типа, необходимо знание пространственной структуры рецептора-мишени. Несмотря на огромную важность для фундаментальных и прикладных исследований, в настоящее время МБ остаются малоизученными. Трудности, возникающие при структурно-функциональных исследованиях МБ, обусловлены рядом факторов. Во- первых, системы клеточной экспрессии в большинстве случаев не могут обеспечить продукцию МБ в нативной конформации в количествах, необходимых для структурных исследований. Применение гетерологичных систем, основанных на использовании бактериальных клеток, позволяет решить проблему количественного выхода МБ, однако часто приводит к агрегации молекул целевого белка и накоплению его в виде
CC 99 Т-Ч CC 99
нерастворимых телец включения . В этом случае для восстановления нативной конформации белковой молекулы требуется разработка процедуры ренатурации, эффективность которой часто невелика. Во-вторых, для стабилизации функционально активной конформации МБ требуется использование специальных мембраномоделирующих сред (мембранных миметиков), при этом выбор оптимального окружения для исследования конкретной белковой молекулы может представлять собой сложную и чрезвычайно трудоемкую задачу.
В последнее время для продукции МБ все чаще применяются бесклеточные белоксинтезирующие системы (ББС). Эти системы содержат все необходимые компоненты для протекания процессов транскрипции и трансляции in vitro: ДНК, содержащую ген целевого белка, ДНК-зависимую РНК-полимеразу, факторы транскрипции и трансляции, молекулы тРНК, рибосомы, аминокислоты, нуклеотиды и энергетические субстраты. Возможность синтеза белков как про-, так и эукариотического происхождения делает ББС универсальным инструментом для решения многих задач современной молекулярной биологии и биотехнологии. Выходы целевых белков в таких системах достигают нескольких миллиграммов с 1 миллилитра реакционной смеси (РС), что позволяет получать МБ в препаративных количествах. Помимо этого, в ББС можно осуществлять синтез белков, токсичных для живых клеток. Открытый характер ББС делает возможным добавление в РС различных компонентов и кофакторов, что в некоторых случаях позволяет получать белки в нативной конформации. Так, например, для продукции МБ в растворимой форме в РС добавляют мембранные миметики, такие как мицеллы детергентов, липид-детергентные бицеллы, липосомы, липид-белковые нанодиски (ЛБН) и др. Кроме того, ББС позволяют легко получать белковые препараты, селективно меченные стабильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных исследований, например, методами ЯМР-спектроскопии.
Таким образом, разработка новых подходов для эффективной продукции МБ с использованием ББС является актуальной задачей молекулярной биологии и открывает новые возможности для структурно-функциональных исследований и практического применения этих фармакологически важных молекул.
Цель работы
Целью работы являлись разработка эффективных бесклеточных систем синтеза на основе экстракта S30 E. coli, а также изучение возможности применения различных мембраномоделирующих сред (мицелл детергентов, бицелл, липосом и липид-белковых нанодисков) для продукции МБ в растворимой форме с пространственной структурой, близкой к нативной, для их последующих структурно-функциональных исследований.
Объектами исследования являлись трансмембранный (ТМ) домен рецепторной тирозинкиназы ErbB3 человека (ТМ-БгЪБ3), включающий одну ТМ-спираль, и мускариновый ацетилхолиновый рецептор М1 типа человека, содержащий семь ТМ- спиралей (М1-мАХР), относящийся к семейству рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR).
Основные задачи исследования
-
Разработать бесклеточные белоксинтезирующие системы для эффективной продукции ТМ-ЕгЪВЗ и М1-мАХР в количествах, достаточных для структурных и функциональных исследований.
-
Подобрать мембраномоделирующие среды, обеспечивающие синтез TM-ErbB3 и М1-мАХР в растворимой форме с пространственной структурой, близкой к нативной.
-
Методами ЯМР-спектроскопии провести сравнительный анализ пространственной структуры ТМ-ЕгЪВ3 в различных мембраномоделирующих средах (мицеллы, бицеллы, липид-белковые нанодиски).
-
Подобрать условия очистки и ренатурации М1-мАХР в составе различных мембраномоделирующих сред.
-
Провести анализ лиганд-связывающей активности М1-мАХР в составе различных мембраномоделирующих сред.
Научная новизна и практическая значимость работы
Все результаты, представленные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.
-
-
Разработаны ББС для эффективной продукции ТМ-ErbB3 и М1-мАХР как в виде осадка РС, так и в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов, бицелл, липосом и липид-белковых нанодисков (ЛБН).
-
Впервые методами ЯМР-спектроскопии определена пространственная структура TM-ErbB3 в окружении мицелл додецилфосфохолина (ДФХ), и установлено, что димеризация домена происходит по мотиву, не типичному для рецепторных тирозинкиназ семейства ErbB.
-
На примере ТМ-БгЪБЗ проведен сравнительный анализ эффективности бесклеточного синтеза МБ в растворимом и структурированном виде в присутствии различных мембранных миметиков. С использованием КД- и ЯМР-спектроскопии, а также кросс-сшивающих реагентов показано, что в окружении мицелл, бицелл и ЛБН ТМ-БгЪБЗ формирует спиральные структуры, способные к димеризации.
-
На примере ТМ-БгЪБЗ показана возможность проведения прямых структурных исследований МБ, котрансляционно встроенных в бицеллы и ЛБН, методами ЯМР- спектроскопии.
-
Показано, что использование в качестве N-концевых партнеров ^-концевого фрагмента бактериородопсина грамположительной бактерии Exiguobacterium sibiricum (ESR-таг), ^-концевого фрагмента рибонуклеазы А (S-таг) и белка Mistic из B. Subtilis позволяет увеличить выход М1-мАХР в 10 - 72 раза до уровня 0.5 - 3.6 мг с 1 мл РС.
-
Осуществлен бесклеточный синтез М1-мАХР в присутствии ЛБН. Наличие правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка М1-мАХР, котрансляционно встроенного в ЛБН, подтверждено методом ЯМР-спектроскопии путем наблюдения специфического взаимодействия с антагонистом рецептора телензепином.
-
Разработаны протоколы солюбилизации и очистки М1-мАХР из осадка РС, а также ренатурации рецептора в смешанных мицеллах додецилмальтозид/холестерил гемисукцинат (ДДМ/ХГС). Показано наличие специфического взаимодействия М1- мАХР в составе мицелл ДДМ/ХГС с телензепином.
Результаты диссертационной работы могут быть интересны как с точки зрения фундаментальной науки, так и для прикладных разработок в области биотехнологии, фармакологии и медицины, например, при создании оптимальных протоколов продукции интегральных МБ. Кроме того, в перспективе, использование результатов работы может быть полезным для создания лекарственных препаратов, направленных на лечение онкологических заболеваний и расстройств нервной системы, связанных с дисфункциями рецепторных тирозинкиназ и мАХР.
Апробация работы
Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на XXII Зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2009), конференции "Euromar" (Флоренция, Италия, 2010), 35-ом конгрессе FEBS (Ґетеборг, Швеция, 20101), Втором русско-греческом симпозиуме BioNanoTox (Ираклион, Крит, Греция, 2011), XIX Международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2011), 36-ом конгрессе FEBS (Турин, Италия, 2011), Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "Х чтения памяти академика Юрия
Анатольевича Овчинникова" (Москва-Пущино, Россия, 2011), XXIV Зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2012), Научной конференции "Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты" (Москва, Россия, 2012).
Личный вклад автора заключается в проведении теоретических и экспериментальных исследований. Основные результаты получены при непосредственном участии автора в планировании и проведении экспериментов. Исследования методами ЯМР-спектроскопии проведены совместно с к.ф.-м.н. н.с. К.С. Минеевым и к.ф.-м.н. с.н.с. З.О. Шенкаревым, сотрудниками лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из которых 3- статьи в реферируемых научных журналах, включенных в список ВАК, 11 - тезисы Российских и международных конференций, также подана 1 заявка на патент РФ.
Структура и объем диссертации
Похожие диссертации на Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков
-
