Введение к работе
Актуальность темы
Цефалоспорины - обширный класс антибиотиков с мощным бактерицидным действием, низкой токсичностью, широким терапевтическим диапазоном. Субстанцией для получения более 30 наименований полусинтетических цефалоспоринов 5 поколений является природный бета- лактамный антибиотик цефалоспорин С (цефС), продуцируемый аскомицетом Acremonium chrysogenum.
На протяжении последних тридцати лет был достигнут значительный прогресс в селекции промышленных штаммов A. chrysogenum - суперпродуцентов данного антибиотика, идентификации генов, контролирующих биосинтез цефС, и исследовании характера их регуляции.
Путь биосинтеза цефС хорошо изучен, насчитывает 6 ферментативных стадий, катализируемых продуктами генов «раннего» - pcbAB, pcbC, cefDl, cefD2 - и «позднего» - cefEF, cefG - кластеров биосинтеза антибиотика.
На внутриклеточном уровне биосинтез цефС строго компартментализован. Эффективность процессов внутриклеточного транспорта интермедиатов и экспорта цефС из клетки вносит существенный вклад в общий уровень продукции антибиотика, соотношение выхода конечного продукта и его промежуточных форм в процессе ферментации.
Гены мембранных транспортеров, вовлеченных в процессы транспорта цефС и его интермедиатов, являются перспективными мишенями для создания рекомбинантных штаммов A. chrysogenum с улучшенными производственными характеристиками. Особый интерес представляет белок СеіГ, относящийся к обширному классу MFS транспортеров. CefT осуществляет перенос бета-лактамов через плазматическую мембрану продуцента по принципу Н+-антипортера.
Другой перспективной мишенью генетических манипуляций, направленных на улучшение биосинтеза цефС, является Н+-АТФаза плазмалеммы PMA. Функцией белка является формирование на плазмалемме электрохимического градиента протонов, используемого для всех процессов транспорта метаболитов посредством Н+ -симпортного, Н+ -антипортного механизмов. Таким образом, Н+-АТФаза должна играть существенную роль в энергообеспечении процессов синтеза и транспорта цефС.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей диссертационной работы является изучение роли мембранных транспортеров - Н+-АТФазы плазмалеммы PMA1 и предполагаемого транспортера цефалоспорина С CefT в регуляции продукции бета-лактамов у Acremonium chrysogenum.
Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:
-
Определить хромосомную локализацию и характер экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефалоспорина С у высокопродуктивного штамма A. chrysogenum ВКМ F-4081D и штамма дикого типа АТСС 11550.
-
Создать системы экспрессии CefT из A. chrysogenum, PMA1 из Saccharomyces cerevisiae в виде их гибридов с флуоресцентными белками, изучить функциональную активность и субклеточную локализацию CefT- TagCFP и PMA1-TagYFP в модельном объекте S. cerevisiae.
-
Издать системы экспрессии CefT-TagCFP и PMA1-TagYFP для A. chrysogenum, оптимизировать процедуру агробактериального переноса кассет экспрессии в штамм ВКМ F-4081D.
-
Получить рекомбинантные се/Т-клоны A. chrysogenum ВКМ F-4081D, провести их молекулярно-генетическую характеристику. Изучить влияние экспрессии CefT-TagCFP на биосинтез цефалоспорина С.
-
Получить рекомбинантные pmal-клоны A. chrysogenum ВКМ F-4081D, провести их молекулярно-генетическую характеристику. Исследовать функциональную активность PMA1-TagYFP, изучить влияние экспрессии PMA1 на биосинтез цефалоспорина С.
Научная новизна и практическая значимость работы
В ходе работы был определен характер хромосомного полиморфизма и выявлены закономерности экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефС для штаммов A. chrysogenum, различающихся в 100 раз и более по уровню продукции антибиотика. Полученные данные расширяют существующие представления о механизмах регуляции биосинтеза бета-лактамных антибиотиков у A. chrysogenum, молекулярно-генетических отличиях промышленных штаммов A. chrysogenum, определяющих их способность к суперпродукции цефС.
Разработан подход для изучения функциональной активности и особенностей субклеточной локализации мембранного белка CefT в гетерологичной модельной системе S. cerevisiae. Метод универсален и может быть использован для структурно-функционального анализа других MFS транспортеров грибов, участвующих в процессах экспорта биологически- активных вторичных метаболитов.
Разработана и оптимизирована процедура трансформации высокопродуктивного штамма A. chrysogenum ВКМ F-4081D методом агробактериального переноса (ATMT). С помощью ATMT впервые получены трансформанты высокопродуктивного штамма A. chrysogenum ВКМ F-4081D с конститутивной экспрессией функционально-активных гибридов мембранных транспортных белков CefT и PMA1 слитых с флуоресцентными белками TagCFP, TagYFP.
Показано, что дополнительная экспрессия CefT-TagCFP в высокопродуктивном штамме A. chrysogenum ВКМ F-4081D приводит к изменению профиля биосинтеза цефС: повышению содержания в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов интермедиатов биосинтеза цефалоспорина и снижению выхода конечного продукта, подтверждая тем самым данные о широкой субстратной специфичности CefT, установленные на модельной системе дрожжей-сахаромицетов.
В процессе экспериментальной работы были сконструированы новые универсальные экспрессионные вектора, позволяющие осуществлять агробактериальный перенос и конститутивную экспрессию целевых генов в клетках A. chrysogenum, а также других видов нитчатых грибов.
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Результаты работы получены лично автором или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на всероссийской научной школе для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии» (Москва, 2009 г); 14-ой, 15-ой, 16-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010, 2011, 2012 г); «5-ом Хорватском конгрессе по микробиологии с международным участием» (Примоштен, 2012 г), Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ «Биологические механизмы» (Санкт- Петербург, 2013 г).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них в рецензируемых журналах - 2, в российских и иностранных журналах, входящих в перечень ВАК - 2, тезисы докладов на международных конференциях и семинарах - 2, тезисы докладов на российских научных конференциях - 6, получен 1 патент на изобретение РФ.
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и включают 49 рисунков и 10 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список цитируемой литературы», который содержит 221 ссылку, в том числе 214 иностранных источников.
