Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Разнообразие азотфиксирующих микробно-растительных симбиозов в природе 12
1.1.1. Общие положения 12
1.1.2. Эндосимбиозы 14
1.1.3. Эктосимбиозы 16
1.2. Сходства и различия бобово-ризобиального и актиноризного симбиозов 18
1.2.1. Инфекционный процесс и клубенекобразование 18
1.2.2. Гены симбиотической азотфиксации и их регуляция 24
1.2.3. Специфичность симбиоза 27
1.3. Роль лектинов в азотфиксирующем симбиозе 30
1.3.1. Общая характеристика лектинов растений 30
1.3.2. Лектины бобовых растений 31
1.3.3. Функции лектинов в азотфиксирующем симбиозе 34
1.4. «Бородатые корни» как модель корневой системы в симбиотических взаимодействиях 36
1.5. Биоинженерия симбиотических систем 39
Глава 2. Экспериментальная часть 45
2.1. Объекты исследования, бактериальные штаммы и векторы 45
2.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении ПЦР генов лектинов 46
2.3. Реактивы и материалы 47
2.4. Составы использованных стандартных водных растворов 48
2.5. Методы исследований 49
2.5.1. Выделение и очистка ДНК растений 49
2.5.2. Выделение и очистка РНК растений 50
2.5.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК 51
2.5.4. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях 53
2.5.5. Подготовка компетентных клеток E.coli 54
2.5.6. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК 55
2.5.7. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом 55
2.5.8. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей . 56
2.5.9. Синтез кДНК 56
2.5.10. Полимеразная цепная реакция 57
2.5.11. Клонирование генов лектинов бобовых растений в вектор pCAMBIA 1305.1 58
2.5.12. Приготовление компетентных клеток Agrobacterium sp 60
2.5.13. Электропорация клеток Agrobacterium sp 60
2.5.14. Получение композитных растений 61
2.5.15. Анализ (3-глюкоуронидазной (gus) активности 63
2.5.16. Агробактериальная трансформация листовых пластинок табака 63
2.5.17. Обработка «бородатых корней» на люцерне, астрагале и облепихе микросимбионтами 65
2.5.18 Обработка «бородатых корней» микросимбионтами на рапсе и табаке 66
2.5.19. Идентификация клубенекобразующего штамма 67
2.5.20. Микроскопирование клубеньков, образованных на «бородатых корнях» облепихи 67
Глава 3. Результаты и обсуждение 70
3.1. Клонирование химерных конструкций гена лектина в бинарном векторе pCAMBIA 1305.1 70
3.2. Получение трансгенных «бородатых корней» и композитных растений 72
3.2.1 .Получение «бородатых корней» на люцерне посевной 72
3.2.2. Получение «бородатых корней» на астрагале нутовом 74
3.2.3. Получение «бородатых корней» на облепихе крушиновидной 75
3.2.4. Получение «бородатых корней» на рапсе 76
3.2.5. Получение «бородатых корней» на листовых пластинках табака 77
3.2.6. Получение композитных растений 78
3.3. Обработка трансгенных корней микросимбионтами и анализ полученных клубеньков 81
3.3.1. Эксперименты над композитными растениями люцерны 83
3.3.2. Эксперименты над композитными растениями астрагала с PSL 90
3.3.3. Эксперименты над композитными растениями облепихи... 91
3.3.4. Эксперименты над композитными растениями рапса и «бородатыми корнями», полученными на листовых пластинках табака 96
3.4. Создание полностью трансгенных по гену лектина растений 101
3.4.1. Создание полностью трансгенных по гену лектина PSL растений табака 102
3.4.2. Спонтанная регенерация трансгенных по гену лектина PSL проростков астрагала из культуры «бородатых корней» 103
Заключение 107
Выводы 111
Список литературы 112
- «Бородатые корни» как модель корневой системы в симбиотических взаимодействиях
- Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
- Обработка трансгенных корней микросимбионтами и анализ полученных клубеньков
- Спонтанная регенерация трансгенных по гену лектина PSL проростков астрагала из культуры «бородатых корней»
Введение к работе
Актуальность работы. На сегодняшний день важнейшей задачей сельского хозяйства является обеспечение быстрорастущего населения земли продовольствием. Широкое внедрение в производство высокоурожайных сортов возможно лишь при наличии в почве больших количеств легкодоступных соединений азота и это является основным лимитирующим фактором повышения продуктивности агроэкосистем. Применение азотных удобрений не может полностью решить данную проблему, что обусловлено экономическими и экологическими причинами.
Микробиологическая фиксация атмосферного азота позволяет избежать значительных затрат энергетических ресурсов, так как осуществляется за счёт энергии Солнца. Кроме того, это единственный экологически чистый путь снабжения растений доступным азотом, при котором принципиально невозможно загрязнение почв, воды и воздуха (Умаров, 2001). В связи с этим одной из перспективных задач для современного сельского хозяйства является максимальное использование и преумножение симбиотического потенциала культурных растений.
Конечной целью большинства современных экспериментов симбиотической биоинженерии является создание устойчивых эндосимбиотических компартментов в растениях, которые в природе не вступают в эффективный азотфиксирующий симбиоз (Kovalskaya et al., 2003; Гончар и др., 2007). Эти эксперименты основаны на том, что развитие подобных структур, в частности инфекционных нитей, симбиосом и самих клубеньков, можно рассматривать как совокупность реорганизованных процессов нормального гистогенеза и цитодифференцировки, регулируемых новыми сигналами, поступающими от микросимбионтов (Brewin, 1998). Поэтому успехи в изучении генетических систем азотфиксирующего симбиоза позволяют приступить к направленному повышению эффективности подобных мутуалистических взаимоотношений, а также к созданию новых симбиотических комплексов. Одним из подходов для этого является модификация процессов узнавания и ранних симбиотических взаимодействий, во время которых растение выбирает оптимального партнера из состава обширной и генетически разнородной микробной популяции (Тихонович, Проворов, 2005).
Азотфиксация при бобово-ризобиальном симбиозе является наиболее эволюционно продвинутой и эффективной по сравнению с другими симбиотическими системами и создание небобовых трансгенных растений, вступающих в азотфиксирующий симбиоз с клубеньковыми бактериями является перспективным направлением в биоинженерии симбиотических систем. Одним из ключевых факторов на пути формирования бобово-ризобиального симбиоза являются лектины, которые обеспечивают узнавание растением-хозяином специфической для него бактерии. Эти белки, благодаря своим углеводсвязывающим свойствам, определяют избирательные взаимодействия растений с ризобиями, участвуя в адгезии бактерий к корневым волоскам, формировании инфекционных нитей и образовании клубеньков (Kijne et al., 1992). Поэтому эксперименты с трансгенными растениями, несущими различные гены лектинов бобовых, позволяют расширять круг микросимбионтов растений и являются важным этапом в создании новых симбиотических систем.
Цель данного исследования заключалась в получении трансгенных по генам лектинов бобовых растений модельных корневых систем на люцерне посевной, астрагале нутовом, облепихе крушиновидной, рапсе сорта Наппа и табаке линии SR1 и изучении симбиотических взаимодействий полученных корневых систем с различными клубеньковыми бактериями. Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Клонировать последовательности генов лектинов бобовых растений в векторе pCambia 1305.1 и трансформировать полученными конструкциями клетки Agrobacterium rhizogenes 15834.
Разработать методы получения трансгенных по генам лектинов «бородатых корней» на люцерне, астрагале, облепихе, рапсе и табаке.
Изучить симбиотические взаимодействия полученных корневых систем с различными клубеньковыми бактериями.
Путем трансформации Agrobacterium tumefaciens создать трансгенные растения табака, несущие ген лектина гороха посевного, и изучить симбиотические взаимодействия корней с микросимбионтом гороха посевного R. leguminosarum bv. viciae.
Научная новизна работы
Разработан метод получения трансгенных по генам лектинов бобовых растений «бородатых корней» на астрагале, облепихе, рапсе и табаке. Впервые
показана возможность формирования клубенек-подобных структур на
актиноризных растениях с участием ризобий. Обнаружено усиление ризобиальной колонизации на трансгенных по гену лектина «бородатых корнях» рапса и табака. Созданы трансгенные растения табака, несущие ген лектина гороха посевного, и впервые описаны скручивания корневых волосков полученных растений под воздействием микросимбионта гороха посевного. Впервые обнаружена спонтанная светонезависимая регенерация проростков астрагала нутового из культуры «бородатых корней».
Научно-практическая значимость работы
Полученные результаты расширяют представление об участии лектинов в формировании различных видов азотфиксирующего симбиоза. Разработанный экспериментальный подход, основанный на модификации процессов узнавания и ранних симбиотических взаимодействий с помощью лектинов бобовых растений, в перспективе может быть использован для получения стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями. Возможность спонтанной регенерации проростков астрагала нутового из культуры «бородатых корней» открывает новые перспективы в использовании астрагалов в качестве источников биологически активных веществ.
Конкурсная поддержка работы
Работа проводилась при финансовой поддержке программы «Государственная поддержка молодых российских ученых и ведущих научных школ России» (гранты МД-43.2008.4 и НШ-649.2008.4), ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы" (госконтракт 02.518.11.7138) и гранта по инновационным исследованиям «У.М.Н.И.К.» (ГР 001200850086).
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на 2-й международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), 2-м всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2007), всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007), XV международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений»
(Екатеринбург, 2008), международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, входящем в Перечень ВАК.
Структура и объем диссертации
«Бородатые корни» как модель корневой системы в симбиотических взаимодействиях
Закладка клубенькового примордия происходит параллельно развитию инфекционной нити. На этом этапе происходит митотическая реактивация, дифференцировка и пролиферация клеток кортекса, индуцируемая Nod-факторами ризобий. Инфекционная нить, которая через 2-3 суток достигает основания корневого волоска, проникает в кортекс, а затем и в растущий клубенек, где разветвляется и растет, следуя за меристемой. У Mimosoideae и Papilionideae на этом этапе происходит переход бактерий в состояние внутриклеточных симбионтов путем эндоцитоза. При этом в растительную цитоплазму «высвобождаются» мембранные везикулы, содержащие бактерии. В течении некоторого времени ризобий сохраняют свои размеры и палочковидную форму, а затем превращаются в бактероиды. (Brewin, 2004; Oldroyd, Downie, 2008)
Среди актиноризных растений проникновение Frankia в ткани растений через корневые волоски описано для родов Myrica, Comptonia, Alnus и Casuarina (Berry, Sunell, 1990). Мишенью для актиномицетов служат волоски, расположенные у основания боковых корней. Как и в случае бобовых растений, происходит гидролиз клеточной стенки, и в результате разрастания растительных тканей появляется структура аналогичная инфекционной нити. Также параллельно происходит митотическая реактивация клеток кортекса с образованием предклубенька, который практически не участвует в азотфиксации, а служит для дальнейшего проведения актиномицетов в перицикл корня, где происходит закладка настоящих клубеньков. Проникнув в предклубенек, актиномицеты под контролем растения-хозяина начинают формировать везикулы, где, собственно, и происходит фиксация N2 нитрогеназой. Стоит отметить, что Frankia, в отличие от Rhizobium, могут фиксировать азот и в чистой культуре, образуя подобные везикулы (Guan et al., 1995).
Второй способ проникновения ризобий - через межклетники эпидермиса - среди бобовых растений распространен мало. Данное явление встречается только у некоторых представителей мотыльковых, в частности у Arachis, Sesbania и Aeschynomene. У этих растений клубеньки возникают из расположенных в перицикле примордиев боковых корней, при росте которых возникают разрывы эпидермиса, являющиеся сайтами проникновения ризобий. У Sesbania и Aeschynomene клубеньки формируются не только на корне, но и на стебле, причем во втором случае новые меристемы не возникают и клубеньки развиваются из зачатков воздушных корней (Alazard, Duhoux, 1990; Hirsch, LaRue, 1997). Обычно, в случае интерцеллюлярного проникновения ризобий в клетки растений инфекционная нить не образуется, эндоцитоз бактерий происходит из межклеточных пространств и зачастую отсутствует стадия образования бактероидов (Allen, Allen, 1981).
У различных видов люпина развитие симбиоза начинается с проникновения ризобий через разрывы эпидермиса в верхней части корня. После образования примордий в наружном кортексе апикальные меристемы молодых клубеньков распадаются на отдельные зоны, которые продолжают недетерминированный рост в латеральном направлении. В результате у основания корня образуются кораллоподобные выросты, состоящие из многочисленных сросшихся долей, в каждой из которых выявляется плотная центральная группа растительных клеток, наполненных ризобиями. Инфицирование этих клеток осуществляют бактерии, находящиеся в межклеточных пространствах. При этом наблюдают образование структур, сходных с инфекционными каплями, однако инфекционная нить отсутствует (Allen, Allen, 1981; Sprent, 2001).
У Mimosa scabrella инфицирование происходит путем активного внедрения ризобий между клетками интактных участков эпидермиса, где происходит растворение срединных пластинок и формируются структуры, подобные инфекционной нити (de Faria et al., 1988; Brewin, 1998). Практически также происходит инфицирование у актиноризных растений рода Elaeagniis и Ceanothus. Обычно при приникновении Frankia через межклетники предклубеньков не образуется, за исключением Ceanothus, где митотическая реактивация клеток кортекса была найдена и в отсутствие актиномицетов (Miller, Baker, 1886; Liu, Berry, 1991).
У Parasponia проникновение ризобий в корни происходит через разрывы эпидермиса, эндоцитоз отсутствует и ризобий усваивают N2, оставаясь в «фиксационных нитях», которые частично проникают в растительные клетки, но не образуют автономных структур (Hirsch, LaRue, 1997). Это также характерно для древних цезальпиниевых (подсемейство Caesalpinioideae) и примитивных деревянистых мотыльковых (род Cassia, подсекция Chamaecrista) (Sprent, Raven, 1992; Hadri et al., 1998).
Структура ризобиальных и актиноризных азотфиксирующих клубеньков варьирует в отношении: 1 расположения проводящих пучков -периферическое у бобовых или центральное у небобовых растений; 2 локализации примордия - различные слои кортекса у бобовых или перицикл у небобовых; 3 наличия продолжительно функционирующей меристемы -присутствует в недетерминированных, но отсутствует в детерминированных клубеньках (Проворов и др, 2002).
Локализация клубенькового примордия диктуется растением-хозяином (Pawlowski, Bisseling, 1996). Зачастую, для митотической реактивации клеток корня не требуется проникновения микросимбионтов, например, в случае бобово-ризобиального симбиоза достаточно присутствия Nod-факторов (Spaink et al., 1991; Long, 1996). Известно, что некоторые бобовые формируют в стерильных условиях псевдоклубеньки, близкие по структуре к нормальным, возникающим при инокуляции растений их природными микросимбионтами (Truchet et al., 1989; Joshi et al., 1991; Blauenfeldt et al.,1994). Это доказывает содержание генов клубенькового морфогенезиса в геноме бобовых растений. Аналогичные выводы были сделаны и для актиноризных растений (Berg et al., 1992).
В клубеньках всех бобовых растений в центральной части развивается внутриклеточный симбиоз и происходит фиксация N2, а по периферии находятся проводящие пучки, по которым поступают фотосинтаты и выносятся продукты -фиксации. Для большинства эволюционно продвинутых бобовых из подсемейства мотыльковых (Papilionoideae), триб Trifolieae (клевер, люцерна) и Vicieae (горох) характерны недетерминированные клубеньки, способные к длительному росту благодаря активности апикальной меристемы. В этих клубеньках выявляется несколько зон, соответствующих основным стадиям развития симбиоза (инфицирование растительных клеток (I); дифференцировка бактерий во внутриклеточные бактероиды, содержащиеся в особых клеточных компартментах - симбиосомах (II); индукция в бактероидах нитрогеназной активности (III); старение и деградация бактероидов (IV)). Однако у некоторых бобовых {Sesbania, Aeschynomene, соя, фасоль, лядвенец, вигна, арахис) возникают более простые детерминированные клубеньки, лишенные стабильной меристемы и не подразделяемые на гистологически выраженные зоны (Тихонович, Проворов, 1998).
Актиноризные клубеньки относятся к недетерминированным и, в отличие от клубеньков бобовых, характеризуются «корневым» планом строения: проводящие пучки расположены в центре, а азотфиксирующая ткань — по периферии клубенька. При развитии актиноризы сохраняется связь внутриклеточных (везикулы) и межклеточных (гифы) симбиотических структур, что может быть связано с мицелиальным характером роста актиномицетов (Проворов и др, 2002). У Parasponia, так же как и у актиноризных растений, выявлено центральное расположение проводящих пучков в клубеньках и характерно образование предклубеньков на первых этапах инфекции (Lancelle, Torrey, 1984).
Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
Плазмидную ДНК выделяли методом мягкого лизиса (Clewel, Helinski, 1969) с некоторыми модификациями, заключавшимися в сильном уменьшении концентрации сахарозы в суспендирующем буфере и осаждении плазмидной ДНК из осветленного лизата полиэтиленгликолем. Колонией Е. coli, несущей какую-либо плазмиду, засевали 100 мл среды Лурия-Бертани (LB), содержащей 100 мкг/мл ампициллина или другие необходимые антибиотики и выращивали при 37С без встряхивания в течение ночи. Для штамма Е. coli XL 1 -Blue, несущего на эписоме транспозон ТпЮ, определяющего устойчивость к тетрациклину кроме прочих антибиотиков добавляли 12.5 мкг/мл этого антибиотика. Часть полученной ночной культуры переносили, обеспечив ее 100-кратное разбавление, в колбу со свежеприготовленной средой LB, содержащей требуемые антибиотики. Наращивание продолжали до достижения оптической плотности, соответствующей концентрации 2 - 3 х 108 клеток/мл (обычно 14—16 час).
Бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин в центрифуге К-23. Осадок суспендировали в 8 мл 10%-ной сахарозы. После добавления 2 мл свежеприготовленного раствора лизоцима (10мг/мл в 250 мМ трис-HCl, рН7.8) выдерживали 10 мин при 0С и добавляли 2 мл 0.5 М ЭДТА и продолжали инкубацию еще в течение 5 мин при прежних условиях. Лизис проводили с помощью смеси детергентов бридж 58 - дезоксихолат натрия (конечные концентрации 1% и 0.4%, соответственно). Осторожно перемешивали в течение 5 мин, пока раствор не становился вязким и прозрачным. Полученный лизат осветляли в ультрацентрифуге Spinco L2-65B (Beckman-Coulter, США) в бакет-роторе SW-41 в течение 30 мин при 39000 об/мин. Осторожно сливали супернатант, не допуская перетекания вместе с ним иногда образующегося вязкого придонного слоя, содержащего хромосомную ДНК, и добавляли к нему 1/5 объема 5 М NaCl и 1Л объема 50%-го полиэтиленгликоля 6000 (Humphreys et al., 1975). При 0С в холодильнике в течение нескольких часов формировался осадок плазмидной ДНК, содержащий загрязняющее количество РНК, белка, полисахаров.
Сформировавшийся осадок собирали в центрифуге К-23 при 3000 об/мин в течение 10 мин. После растворения осадка в 1хТЕ перед этапом депротеинизации проводили удаление остаточного полиэтиленгликоля встряхиванием с хлороформом и расслаиванием в центрифуге К-23 при 2500 об/мин в течение 5 мин. Депротеинизацию проводили встряхиванием с равным объемом смеси хлороформа и 80%-ого свежеперегнанного фенола (рН 8.0), взятых в соотношении 1:1 в течение 10 мин. Затем проводили центрифугирование в центрифуге К-23 при 2500 об/мин в течение 20 мин. Верхний водно-солевой слой, содержащий ДНК, отбирали и подвергали повторной депротеинизации. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока не исчезала интерфаза, состоящая из денатурированного белка. Затем супернатант встряхивали с равным объемом хлороформа и после центрифугирования осаждали ДНК двумя объемами этилового спирта. Осадок ДНК промывали 70%-ным этанолом для удаления следов фенола и хлороформа и растворяли в соответствующем объеме 1хТЕ.
При анализе рекомбинантных клонов для определения размера вставки применяли быстрый метод щелочного лизиса бактериальных колоний (Birnboim, Doly, 1979). Для этого тефлоновыми палочками (изготовленными вручную из листа фторопласта толщиной 1.5 мм) переносили бактериальные колонии в микроцентрифужные пробирки и тщательно суспендировали в 100 мкл раствора I, содержащего 50 мМ трис-HCl (рН 7.8) и 20мМЭДТА. Затем добавляли 200 мкл раствора II, содержащего 1%-ный раствор ДДС натрия и 0.2 М NaOH. После осторожного перемешивания через 5 мин добавляли 150 мкл 5 М ацетата калия (рН5.0). Тщательно перемешав, выдерживали при 0С в течение 10 мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин в микроцентрифуге Mini-Spin plus (Eppendorf, Германия). Осторожно отбирали осветленную жидкость, не захватывая осадок и липидный слой, и осаждали ДНК двумя объемами этанола при -70С. После растворения сформировавшегося и собранного в микроцентрифуге в минимальном объеме 1 х ТЕ препараты ДНК были готовы или для их непосредственного анализа агарозным гель-электрофорезом или для расщепления соответствующими рестрикционными эндонуклеазами.
Процесс электрофоретического фракционирования препаратов ДНК осуществляли в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК и требуемого разрешения, используя 1 - 2.0%-ные агарозные гели или же 10 -15%-ные полиакриламидные гели. Источниками питания служили приборы модели 250/2.5 фирмы Bio-Rad (США) или модели «Эльф — 4» фирмы ДНК-технология, Россия. Толщина используемых в различных экспериментах гелей варьировала незначительно от 2 до 4 мм. Гребенки для формирования колодцев имели толщину 1.5 мм и отличались шириной зубчиков (от 3 мм до 8 мм). В качестве буферной системы использовали ТАЕ -буфер.
При разделении фрагментов ДНК крупного и среднего размеров (от 13-15тпн до 0.8 тпн) электрофорез проводили в 0.8 - 1.0%-ных гелях агарозы, соответственно, при напряжении 2 - З В на см длины. При разделении мелких фрагментов ДНК (от 2 тпн до 200 пн) использовали 1 - 2%-ные гели агарозы соответственно с градиентом напряжения 8 - 10В на см длины геля. Такой повышенный градиент напряжения способствовал сокращению времени электрофореза и уменьшения диффузии (Sealey, Southern, 1982).
При электрофоретическом фракционировании использовали 1 Kb ДНК маркер 250-10000 п.н. (СибЭнзим, Россия). После окончания электрофореза ДНК в гелях окрашивали бромистым этидием (5 мкг/мл) в течение 10 мин. Флуоресценцию нуклеиновых кислот наблюдали и регистрировали в ультрафиолетовом свете с длиной волны 302 нм при помощи специальной фотодокументационной системы фирмы UVP(CIIIA).
Обработка трансгенных корней микросимбионтами и анализ полученных клубеньков
После инокуляции композитных растений люцерны с корнями трансгенными по гену PSL/AGL ризобиями A. cicer (опыт №10) на корнях были обнаружены клубеньки, схожие с клубеньками, которые формирует S. meliloti (рис. 12).
Рассев содержимого клубеньков на питательную среду выявил наличие в них бактерий, которые оказались идентичны бактериям, использованным для инокуляции. Таким образом, в данном варианте наблюдались нетипичные симбиотические отношения между люцерной и клубеньковыми бактериями астрагала с образованием инфицированных клубеньков. Полученные результаты полностью совпадают с таковыми в работе, где применялась экзогенная обработка корней люцерны лектином PSL/AGL в присутствии ризобий из клубеньков А. сісег (Баймиев и др., 2009).
Бактерии из клубеньков A. сісег, как показало секвенирование по гену 16S рРНК, родственны A. tumefaciens (Баймиев и др., 2009). Схожесть генов 16S рРНК некоторых клубеньковых бактерий астрагалов и агробактерий отмечалась еще в работах Гао с соавт (Gao et al., 2001), что впрочем неудивительно, поскольку, несмотря на различия в способе существования, род Agrobacterium входит в семейство Rhizobiaceae. Отсюда можно предположить, что в них могут автономно реплицироваться одинаковые плазмиды. Так, например, в результате введения pSym плазмиды R. leguminosamm bv.viciae или R. legwninosarum bv. trifolii в A. tumefaciens, лишенной собственной Ті плазмиды, бактерии приобретали способность нодулировать соответственно горох и клевер с образованием неактивных клубеньков (Hooykaas et al., 1981; 1982). А при введении 315 тпн плазмиды pRt4Sa R. leguminosarum bv. trifolii в A. tumefaciens, трансконьюгант был способен нодулировать не только клевер, но и люцерну с образованием также неэффективных клубеньков (Abe, 1998). Ризобий S. meliloti физиологически и генетически схожи со штаммами R. leguminosarum биоваров trifolii и viciae (Diaz et al., 1989; Terefework et al., 1998; Loris et al., 1998). Они могут различаться содержанием pRme плазмид, но все характеризуются наличием плазмид, имеющих размер более чем 700 тпн (Banfalvi et al., 1981; Rosenberg et al., 1981; 1982), несущих гены нитрогеназы, а также гены, контролирующие клубенькообразование (Banfalvi et al., 1981; Rosenberg е t a 1., 1981; Long eta 1., 1982). Интродукция 20-40 тпн участка мегаплазмиды S. meliloti, на котором локализованы некоторые гены, ответственные за начальные стадии клубенькообразования, в A. tumefaciens приводила к формированию неэффективных клубеньков на корнях люцерны; меристема и васкуляр клубеньков были в норме, но они не имели бактерий и инфекционных нитей (Hirsch et al., 1984). При введении же 290 тпн pSym фрагмента мегаплазмиды S. meliloti, содержащего гены нитрогеназы и nod гены, в A. tumefaciens наблюдали уже проникновение бактерий, но только в поверхностные слои ткани корневых волосков люцерны атипичным инфекционным путем. Меристематическая зона и центральная ткань клубеньков также были без бактерий (Truchet et al., 1984). Причем показано, что некоторые nod гены S. meliloti, ответственные за инфекционные процессы, индуцируются экссудатами люцерны и способны экспрессироваться в агробактериях (Yelton et al., 1987). Таким образом, агробактерии, которые генетически близки к ризобиям & meliloti и R. legnminosarum (Laguerre et al., 2001), могут быть реципиентами nod генов многих клубеньковых бактерий и их почвенные сапротрофные формы {Agrobacterium radiobacter), не имеющие Ti-плазмиды, теоретически способны «становиться ризобиями». Однако, разнообразные эксперименты по трансформации Agrobacterium sp. генами нодуляции, пока не привели к обнаружению инфекционных нитей или клубеньков с бактериями на корнях люцерны при инокуляции ее таким трансформантом (Truchet е t al., 1984; Hirsch et al., 1985; Yelton et al., 1987).
Показано, что иногда чужеродные лектины способны усиливать чувствительность растений к факторам «чужих» ризобий. Например, трансгенный по гену лектина гороха PSL красный клевер становился отзывчивым не только на ризобий гороха R. leguminosarum bv. viciae, но и формировал псевдоклубеныш при инокуляции его неспецифичными Mesorhizobium loti и S. meliloti (Diaz et al., 2000).
В наших экспериментах лектин PSL/AGL способствовал понижению специфичности симбиоза люцерны посевной с микросимбионтами, возможно, благодаря тому, что замена углеводсвязывающего участка лектина гороха участком лектина астрагала изменила специфичность лектина к моносахаридам, расширив их спектр (Губайдуллин и др., 2006). В связи с этим можно предположить, что подобные гибридные лектины с «расшатанной» специфичностью к углеводам могут вызывать симбиотические реакции у более широкого круга ризобий, чем природные лектины, что мы, возможно, и наблюдали.
Через три месяца после начала экспериментов трансгенные по гену PSL «бородатые корни» композитных растений обрабатывали микросимбионтом гороха посевного R. leguminosarum bv. viciae. Этими же бактериями в контрольных опытах были обработаны трехмесячные растения с естественной корневой системой и композитные растения с бородатыми корнями, не содержащими ген лектина.
Также контрольные и композитные (без гена лектина) растения были обработаны бактериями, выделенными из клубеньков А. сісег. В последнем случае через месяц после инокуляции на корнях были получены многочисленные клубеньки, инфицированные ризобиями. Количество клубеньков на композитных и контрольных растениях практически не отличалось (опыт №12).
В контрольных опытах на спонтанное образование клубеньков и контаминацию без обработки ризобиями, а также в опытах с инокуляцией композитных растений (без гена лектина) ризобиями R. leguminosarum bv. viciae видимых симбиотических реакций не происходило (опыт №13). Однако после обработки этими бактериями трансгенных по гену PSL бородатых корней композитных растений были обнаружены изгибы и скручивания корневых волосков (опыт №14), что также подтверждает, как и в случае люцерны (опыты №6, №8), стимулирующий эффект лектина на стадии преинфекции.
Спонтанная регенерация трансгенных по гену лектина PSL проростков астрагала из культуры «бородатых корней»
На сегодняшний день существуют несколько работ по созданию ассоциаций каллусной ткани табака с различными азотфиксирующими микросимбионтами, в частности с цианобактериями (Баулина и др., 1984) и ризобиями (Gibson et al., 1976). В последнем случае была показана даже некоторая нитрогеназная активность подобной системы. Также на корнях табака были получены азотфиксирующие псевдоклубеньки при использовании ассоциативных комплексов микроорганизмов, выделенных из природных синцианозов саговниковых растений и папоротников рода Azolla (Горелова и др., 2004).
Подавляющее большинство работ по ассоциативным микросимбионтам рапса посвящены улучшению минерального питания растений. Delftia acidovorans и Achromobacter piechaudii ускоряют рост растений и повышают урожайность, так как активно участвуют в метаболизме соединений серы (Banerjee, Yesmin, 2002). Представители Micrococcus sp., Rhodococcus sp, Bacillus sp. и Azotobacter nigricans могут выступать в качестве ассоциативных азотфиксирующих партнеров (Ковальская и др, 2001). Хотя в природе рапс не вступает в симбиоз с ризобиями, при обработке целлюлазой и пектолиазой корневых волосков проростков рапса в присутствии ризобий происходило образование клубеньков, морфологически и структурно подобных клубенькам бобовых и обладающих незначительной нитрогеназной активностью (Cocking et al., 1991). Следовательно, если обеспечить специфическое взаимодействие ризобий с трансгенными по гену лектина корневыми волосками рапса, то можно добиться если не получения настоящих клубеньков, то хотя бы полноценных ассоциативных отношений между рапсом и ризобиями.
Отметим, что клубеньковые бактерии рода Rhizobium могут выступать в качестве ассоциативных микросимбионтов для многих экономически ценных небобовых культур, таких как рис, кукуруза, пшеница, рапс, подсолнечник и т. д. Эти бактерии способны колонизировать корневую систему и повышать урожайность растений, выделяя ростостимулирующие вещества и защищая от фитопатогенов. Как показали исследования последних лет, ризобии принимают активное участие в усвоении растениями труднорастворимых соединений фосфора и даже, проникая в надземную часть растения, могут усиливать процесс фотосинтеза (Chao , 1990; Hoflich et al., 1995; Chabot et al., 1996; Biswas et al., 2000; Gutierrez-Zamora, Martinez-Romero, 2001; Тильба и др., 2004; Chi et al., 2005; Черемных и др., 2007; Perrine-Walker et al., 2007). Поэтому получение искусственных симбиотических ассоциаций этих бактерий является одними из наиболее перспективных направлений на пути создания экологически ориентированного сельского хозяйства.
Адсорбция ризобий на корневых волосках происходит за счет двойного специфичного связывания лектина и с бактериями и с растительными клетками. В экспериментах с обработкой сахарами, к которым специфичен лектин бобового растения, показано, что З-О-метил-Б-глюкоза и метил-a-D-маннопиранозид ингибируют адсорбцию бактерий Я. legiiminosamm к корням гороха (Kato et al., 1981; Badenoch-Jones et al., 1985). 2-диоксиглюкоза препятствует прикреплению R. leguminosarum bv. trifolii к корням белого клевера (Dazzo et al., 1976). Gal и GalNAc оказывает такое же действие в системе B.japonicum-соя. (Stacey et al., 1980; Lodeiro et al., 2000).
Однако, во многих исследованиях показано, что связывание лектина с клетками корней менее специфично, чем связывание с бактериями и может отличаться от его специфичности к моносахаридам. Например, лектин сои, специфичный к GalNAc, был способен адсорбировать В. japonicum (симбионт сои) к корням люцерны, лектин которой специфичен к Glc и Man (van Rhijn et al., 2001). В системе В. japonicum — соя, предобработка ризобий лектинами РНА фасоли стимулировала их адсорбцию к корневым волоскам, однако она была значительно меньше, чем в случае предобработки лектином сои (SBL) (Lodeiro, 2000). По всей видимости, лектин на данной стадии формирования симбиоза индуцирует у ризобий синтез ряда факторов, которые могут специфично агглютинировать бактерии с корнями растений. Хотя предварительная инкубация лектином и живых и мертвых R. leguminosarum bv. trifolii значительно увеличивала их связывание с корнями белого клевера (Dazzo et al., 1976). Например, в прикреплении R. legiiminosarum bv. trifolii к корневым волоскам клевера выделяют фазу специфического обратимого связывания бактерий с корневой поверхностью (2-диоксиглюкоза ингибирует это связывание) и фазу жесткого связывания экстрацеллюлярными микрофибриллами, синтезированными de novo (Dazzo et al., 1984). В синтезе этих микрофибрилл принимают участие некоторые nod гены (Halverson, Stacey, 1986). Нужно сказать, что при взаимодействии Agrobacterium sp. с рецепторами растительных клеток также индуцируется синтез фибрилл для связывания бактерий с растительной поверхностью (Matthysse, 1981, 1983; Deasey, Matthysse, 1984).
Таким образом на первом этапе бобово-ризобиального симбиоза бактерии колонизируют ризоплану растения-хозяина, в результате которой их численность в прикорневой зоне возрастает на 3 - 4 порядка за счет взаимодействия их поверхностных липополисахаридов с растительными лектинами (Dazzo, Truchet, 1983; Diaz et al., 1989; Kijne et al., 1992). Полученные в данной работе результаты также показали многократное увеличение численности бактерий, что подтверждает взаимодействие микросимбионтов с лектином на поверхности трансформированных корней рапса и табака.
Создание искусственных азотфиксирующих ассоциаций культурных растений с эндофитными микроорганизмами, которые выделены из природных симбиозов, является относительно новым направлением в биоинженерии симбиотических систем. На сегодняшний день уже выделены штаммы Rhizobium, которые успешно колонизируют в природе корни небобовых растений. Например, показано, что наиболее перспективными штаммами для создания азотфиксирующих ассоциаций риса являются ризобии клевера R. leguminosarum bv. trifolii R4, так как эти бактерии способны колонизировать корни и заселять межклетники, способствуя увеличению урожая (Biswas et al., 2000; Chi et al., 2005; Perrine-Walker et al., 2007). В случае кукурузы и латука в качестве подобного штамма можно использовать ризобии фасоли R. leguminosarum bv.phaseoli Р31 и R1, которые успешно колонизируют корни этих растений в почве (Chabot et al., 1996; Gutierrez-Zamora, Martinez-Romero, 2001). Использование лектинов бобовых растений в качестве трансгенов может стать следующим шагом к получению стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями.
