Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор
1.1 Классический метод кристаллизации мембранных белков 12
1.2 Кристаллизация in meso и фазовая диаграмма моноолеина 17
1.3 Гипотетический молекулярный механизм кристаллизации мембранных белков в кубической фазе 19
1.4 Теоретическое представление о кристаллизации in meso 21
1.5 Классификация и свойства детергентов 23
1.6 Влияние детергентов на липидную мембрану 28
1.7 Влияние детергентов на фазовое поведение системы моноолеин/вода 30
1.8 Структура и кристаллы, выращенные при кристаллизации in meso 32
1.9 Із-фаза 35
1.10 Кристаллизация из бицелл 35
1.11 Кристаллизация из везикул 37
1.12 Бактериородопсин 38
1.13 Двойникование кристаллов 41
1.14 Заключение 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1 Выделение и очистка бактериородопснна 45
2.1.1 Материалы для культивирования бактерий и выделения бактериородопснна 45
2.1.2 Культивирование бактерий 45
2.1.3 Выделение пурпурных мембран 46
2.1.4 Выделение и солюбилизация бактериородопснна 46
2.1.5 Определение концентрации и качества бактериородопснна 47
2.1.6 Электрофоретическое разделение белков 47
2.1.7 Определение концентрации детергента 48
2.1.8 Дополнительная очистка солюбилизированного бактериородопсина. Метод повышения качества БР 48
2.2 Кристаллизация бактериородопсина
2.2.1 Материалы для кристаллизации
2.2.2 Кристаллизация в мостиках методом диффузии паров воды 49
2.2.3 Кристаллизация бактериородопсина из пурпурных мембран в мезофазе моноолеина 49
2.2.4 Отбор и подготовка кристаллов для кристаллографических экспериментов 50
2.3 Кристаллографические измерения и обработка рентгеновских данных 50
2.3.1 Тестовые измерения и определение фактора двойникования кристаллов . 50
2.3.2 Установка для рентгеновской кристаллографии белков 51
2.3.3 Выбор стратегии измерений 51
2.3.4 Обработка рентгеновских данных 52
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение. исследование механизма кристаллизации мембранных белков методом inmeso
3.1 Дополнительная очистка солюбилизированного белка 56
3.2 Кристаллизация БР из пурпурных мембран, минуя стадию солюбилизации 59
3.3 Поведение кристаллизационной системы при изменении объемного соотношения белковый раствор / липид 65
3.4 Поведение кристаллизационной системы при добавлении различного рода добавок 70
Сравнительный анализ кристаллизации бактериородопсина с 3.5 использованием п-октил-Р-В-глюкопиранозида и п-октил-p-D-тиоглюкопиранозида 72
3.6 Исследование кристаллизации БР с добавлением детергентов из семейства глюкопиранозидов с различными гидрофобными хвостами 75
3.7 Исследование кристаллизации БР с добавлением детергентов из других семейств с различными гидрофобными хвостами
ГЛАВА 4. Результаты и обсуждение. Бактерпородопсин
Основные выводы работы
Благодарности
Библиографический список используемой литературы .
- Гипотетический молекулярный механизм кристаллизации мембранных белков в кубической фазе
- Структура и кристаллы, выращенные при кристаллизации in meso
- Дополнительная очистка солюбилизированного бактериородопсина. Метод повышения качества БР
- Поведение кристаллизационной системы при изменении объемного соотношения белковый раствор / липид
Введение к работе
Мембранные белки являются основными функциональными компонентами клеточных мембран и составляют примерно одну треть от общего числа белков, закодированных в геноме. Исследование мембран на молекулярном уровне имеет огромное значение не только в расшифровке всех клеточных процессов, но и для понимания изменений, ведущих к аномальным трансформациям клеток, а также для создания лекарств. Более того, 70% существующих в настоящее время лекарственных средств направлены на мембранные белки. Однако, хотя количество мембранных белков с известной структурой за последние годы возросло, оно не сравнимо пока с тем же показателем по водорастворимым белкам.
Актуальность. Согласно базе данных мембранных белков с известной структурой ( Proteins xtal.html) и банку данных RCSB () на сегодняшний день лишь 218 из более 50000 зарегистрированных белковых структур высокого разрешения относятся к числу уникальных мембранных белков. Данный факт объясняется, прежде всего, трудностью получения кристаллов белков этого класса вследствие их амфифильной природы и необходимостью использования детергентов на всех этапах работы, а также, как правило, их нестабильностью вне нативного мембранного окружения. Нестабильности можно избежать при возвращении белка обратно в липидный бислой при кристаллизации методом в кубической фазе [1]. Несмотря на то, что этот сравнительно новый метод кристаллизации позволил сделать ряд принципиальных прорывов в области кристаллизации мембранных белков [2-6], механизм кристаллизации в липидной мезофзе (in mesd) остается до конца неизвестным. Кристаллизация каждого следующего мембранного белка, как правило, требует длительного и дорогостоящего перебора многочисленных параметров кристаллизационной системы, что неминуемо приводит к повышению временных и финансовых затрат. Развитие методов кристаллизации на базе мембранных систем для повышения эффективности производства высококачественных кристаллов мембранных белков для последующего структурного анализа является одной из самых приоритетных задач современной структурной биологии.
Цель работы заключалась в развитии метода кристаллизации in meso, основываясь на изучении механизма кристаллизации мембранных белков в липидной мезофазе на примере модельного белка бактериородопсина. Получение высококачественных кристаллов бактериородопсина для установления молекулярного механизма универсального и первого шага биоэнергетики векторного транспорта протона через мембрану клеток являлось комплементарной задачей работы.
Состояние исследуемых проблем. Новый подход в кристаллизации мембранных белков из липидной кубической фазы позволил преодолеть сложности и получить структуры около восьми различных типов мембранных белков. Так, только с помощью метода in meso впервые после почти 30 лет неудачных попыток, при которых использовались стандартные методы кристаллизации, удалось получить кристаллы бактериородопсина (БР) кристаллографического качества [7], также впервые был закристаллизован комплекс двух белков и решена его структура [3;4]; совсем недавнее достижение в сіруктурной биологии — структура человеческих р2-адренергического и Агл-аденозинового GPCR (рецепторов, сопряженных с G белком) [5;6]. Следует отметить, что на сегодняшний день именно на GPCR белки направлено действие около 25-50% лекарств на рынке, а ежегодный объем их продаж составляет свыше 40 миллиардов долларов. [8-10]. Решенные структуры самых разнообразных белков свидетельствуют о широком диапазоне применения и высоком потенциале данного метода. Однако повышение эффективности этого метода сдерживает отсутствие систематических исследований самой кристаллизации. В результате до сих пор остается неизвестной роль амфифильного окружения, а также механизм роста кристаллов в данной системе [11-13].
Кристаллизация в липидной кубической фазе позволила получить структуру основного состояния бактериородопсина с разрешением 1,55 А. Благодаря новому методу получены некоторые данные о структурах промежуточных состояний белка, внесшие вклад в понимание молекулярных основ функционирования бактериородопсина и других светочувствительных белков этого класса [14]. Вместе с тем надо отметить, что отдельные сведения о механизме переноса остаются противоречивыми. Данные трёх групп авторов, опубликовавших структуры ранних промежуточных состояний, разняться между собой из-за относительно невысокого качества кристаллов, в том числе зачастую обладающих понижающим информативность дефектом двойникования.
Научная новизна работы. Разработан новый эффективный метод кристаллизации мембранных белков в липидной фазе непосредственно из мембран, содержащих белок, с добавлением детергента в кристаллизационную систему. Данный подход к кристаллизации позволяет обойти ряд принципиальных трудностей, в том числе неизбежные потери мембранных белков и снижение их качества, связанные с солюбилизацией и/или обменом детергента, и, что не мало важно, позволяет существенно повысить эффективность работы.
Впервые проведены систематические исследования кристаллизации мембранного белка. Прежде всего, изучено влияние детергентов - влияние гидрофобных и гидрофильных взаимодействий на кристаллизационный процесс в мезофазе. Эксперименты с варьированием концентраций детергентов, относящихся к различным семействам и имеющих разное соотношение полярного и неполярного фрагментов, позволили выдвинуть предположение, что в успехе кристаллизации in meso значительную роль играет толщина липидного бислоя мезофазы, а не детали химического строения амфифильных молекул (липидов, детергентов). Данные исследования впервые показали возможность кристаллизации мембранного белка в подавляющем большинстве типов детергентов, как в коротко-, так и в длинноцепочечных, и позволили определить количественные характеристики, оптимальные для кристаллизации.
В процессе исследования механизма кристаллизации мембранных белков в липидной мезофазе отработан в деталях метод кристаллизации БР из пурпурных мембран (ПМ) с добавлением различных типов детергентов. Данный метод позволил найти новые условия образования больших высококачественных кристаллов бактериородопсина, дифрагирующих до 1,2 А, что дало возможность впервые установить ряд принципиальных элементов механизма транспорта протона.
Кроме того, в работе впервые был разработан метод повышения чистоты солюбилизированного бактериородопсина с помощью замораживания белкового препарата и последующего его ультрацентрифугирования. Данная процедура эффективно работает и позволяет значительно улучшить качество белка и в случае других мембранных белков таких, как галородопсин, сенсорный родопсин II и его комплекс с трансдьюсером.
Практическая ценность работы. Полученные в работе результаты представляют собой огромный интерес для структурной биологии, в частности, для процедур очистки и кристаллизации белков с целью последующего структурного анализа. Как показывает практика, результат кристаллизации и качество кристаллов зависят от чистоты исходного препарата белка. Разработанный новый метод дополнительной очистки ретинальных белков может быть использован для повышения качества и чистоты препарата как в случае других мембранных, так и в случае растворимых белков.
Результаты исследования механизма кристаллизации в липидпой мезофазе и разработанный новый подход к кристаллизации представляют интерес с точки зрения понимания механизма кристаллизации, что важно для дальнейшего развития экспериментальных методов кристаллизации мембранных белков. Приведенные в работе выводы и диаграммы кристаллизации БР в мезофазе с добавлением различных детергентов говорят о возможности получения кристаллов мембранных белков в любом детергенте, минуя стадию замены детергента на более подходящий для кристаллизации. Отраженные в диаграммах оптимальные условия роста кристаллов БР (в частности, диапазон концентраций детергента) могут быть использованы в качестве отправной точки при поиске условий кристаллизации других белков. Разработанный метод кристаллизации уже позволил получить кристаллы бактериородопсина высокого качества дифракции, что в свою очередь позволит улучшить структуру основного и промежуточных состояний БР и прояснить молекулярный механизм первого и универсального шага биоэнергетики клетки.
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав и заключения. Первая глава представляет литературный обзор современного состояния проблемы кристаллизации мембранных белков. Особое внимание уделено используемым в большинстве структурных исследований мембранных белков детергентам и их свойствам. Подробно описаны современные методы кристаллизации с акцентом на изложении различных аспектов кристаллизации мембранных белков новым методом -в липидной кубической фазе. Вторая глава включает в себя описание материалов, экспериментального оборудования, методов и процедур, использованных при выполнении диссертационной работы. Здесь подробно описан новый метод дополнительной очистки мембранных белков, а также новый подход по кристаллизации бактериородопсина из пурпурных мембран в липидной кубической фазе с добавлением детергента в кристаллизационную пробу. В третьей главе представлены экспериментальные результаты исследований влияния различных факторов на успех кристаллизации бактериородопсина в липидной кубической фазе. Данная глава начинается с описания результатов очистки новым методом солюбилизированного бактериородопсина и других ретинальсодержащих мембранных белков с помощью глубокой заморозки и последующим ультрацентрифугированием. Далее представлены результаты нового подхода к кристаллизации БР непосредственно из пурпурных мембран с добавлением /?-октил-Р->-глкжопиранозида (ОГ), анализируются результаты сравнительной кристаллизации с добавлением более стабильного аналога ОГ — п-октил-р-)-тиоглкжопиранозида (ОТГ), рассматривается влияние различного рода добавок на кристаллизационную систему. Заключительная часть этой главы посвящена рассмотрению и подробному обсуждению данных систематических экспериментов по влиянию структуры и количества добавляемого детергента на кристаллизацию в липидной кубической фазе. В заключении диссертационной работы представлены основные выводы и приведен библиографический список цитируемой литературы.
Гипотетический молекулярный механизм кристаллизации мембранных белков в кубической фазе
К сожалению, в настоящее время не существует ясного и доказанного представления о механизме кристаллизации мембранных белков в липидной кубической фазе. Предполагается, что процесс кристаллизации начинается с реконструкции мембранных белков в непрерывный трехмерный очень искривленный липидный бислой [11-13]. Согласно данной гипотезе встраиванию и равномерному распределению в кубическую фазу способствует локальное действие молекул детергента, в окружении которых находится мембранный белок после солюбилизации. Надо отметить, что реконструированные белки сохраняют свою нативную конформацию и функциональную активность, а также частичную или полную подвижность в латеральном направлении бислоя липидной кубической фазы. Последующее добавление осаждающего вещества (соли) приводит к фазовому разделению и формированию в кристаллизационной системе с одной стороны фазы, обогащенной белком, в которой при условиях кристаллизации образуются и растут кристаллы, с другой стороны, водной фазы. Осадитель, сорбируя воду из кубической фазы (конкурируя при этом с молекулами липида, детергента и белка), вызывает ее «сжатие»: уменьшение постоянной решетки, увеличивающее при этом кривизну поверхности [40-44]. Такие изменения в фазе вызывают скопление молекул белка в определенных частях фазы вследствие минимизации свободной энергии несоответствия гидрофобной области белка и неполярной части липидной мембраны. В кристаллизационной системе возникают локальные флуктуации концентрации белка. Так как молекула белка имеет размеры сопоставимые с размерами ячейки кубической фазы, то скопление нескольких молекул белка в одном месте приводит к локальному уменьшению кривизны в обычных условиях очень искривленного бислоя, что, по-видимому, является фактором образования зародыша кристалла. В то же время ионы соли экранируют заряды на поверхности белков, содействуя их тесному контакту между собой. Предполагается, что вследствие эффекта солевой дегидратации в месте зародышеобразования и роста кристалла липидная кубическая фаза переходит в ламеллярную, которая в свою очередь служит проводником последующих новых молекул белка к растущему кристаллу. При этом молекулы белка упаковываются в кристалле послойно, образуя кристалл первого типа (рис. 1.1).
В связи с предполагаемым механизмом кристаллизации мембранных белков в липидной кубической фазе ожидается, что скорость роста кристалла может быть в среднем замедлена, так как белки распределены в бислое, а осадитель в водном канале мезофазы. Однако замечено, что в некоторых случаях кристаллы появляются уже в течение первого часа кристаллизации, свидетельствуя о том, что длительность процесса роста, ограниченная диффузией, может быть скомпенсирована за счет уменьшения размерности доступного пространства. Количество возможных ориентации белка, что важно для возможной нуклеации и роста кристалла, в случае кристаллизации in meso не велико, так как ориентированный перпендикулярно к плоскости мембраны белок все время находится в липидном бислое, в то время как при кристаллизации in surfo все направления в пространстве доступны и равновероятны.
Почти 10 лет назад был опубликован предполагаемый механизм кристаллизации мембранных белков в кубической фазе [11-13], но до сих пор нет точного представления о том, как белки кристаллизуются из кубической фазы. Вместе с тем есть достаточно оснований полагать, что два свойства мезофазы должны играть важную роль в кристаллизации мембранных белков - это сильно искривленный бислой кубической фазы и эффект гидрофобного несоответствия, что теоретически было проанализировано [45].
В настоящее время существует фактически единственная законченная теоретическая работа по кристаллизации мембранных белков в липидпой кубической фазе [45]. В данной работе упругая энергия возмущенного липидного бислоя вблизи встроенного в кубическую фазу белка рассматривается в качестве основной движущей силой кристаллизации, а седлообразная форма поверхности биконтинуальной кубической фазы, о которой упоминалось выше, играет ключевую роль во взаимодействии белка с мембраной [45]. Реконструкция мембранного белка в сильно искривленный липидный бислой сопровождается обнажением полярного/неполярного интерфейса на границе липид/белок. Для устранения этого гидрофобного несоответствия происходит локальная адаптация (деформация) близлежащего к белку липидного бислоя за счет сжатия или растяжения ацильных цепей, а также, возможно, их наклона относительно нормали к бислою (рис. 1.5). В ряде случаев белок также может приспосабливаться к липидному окружению за счет малых смещений и вращений отдельных а-спиралей или небольших белковых доменов. Однако мембранные белки гораздо менее сжимаемы, чем липидная мембрана: объемный модуль сжатия молекулы оелка в 10 - 10 раз превосходит объемный модуль сжатия липидной молекулы [46].
Как известно, любая деформация (изгиб, сжатие, растяжение, разрыв) поверхности связаны с затратой энергии, которая зависит только от изменения кривизны поверхности. Сумма вкладов средней Н и гауссовой К кривизны дает плотность упругой свободной энергии, которая при малых деформациях связана с кривизной поверхности следующим образом: gc = 2х (Н -. Я0) 2 + KQK , где Н0 -спонтанная кривизна поверхности в расслабленном состоянии, соответствующая глобальному минимуму свободной энергии, к и KG - модули упругости для средней кривизны и гауссовой кривизны, соответственно [38]. Для минимизации энергии упругой деформации бислоя в зоне встроенного белка , необходимо, чтобы он локализовался в области кубической фазы с минимальной гауссовой кривизной (К, Н=0), где будут удовлетворены условия гидрофобного соответствия на границе липид/белок. Иными словами, белкам энергетически выгодно скапливаться в плоских областях мембраны. Поскольку размеры этих областей сопоставимы с размерами белка, то агрегация белков в данной области будет сопровождаться ее спрямлением (гауссова кривизна Н=0), таким образом, приводить к стабилизации и росту образующейся из кубической ламеллярной фазы, энергетически привлекательной для дальнейшей кластеризации белков [45]. На основе этой теории была разработана кинетическая модель кристаллизации белков в кубической фазе с размером кристаллов и характерным временем нуклеации, экспоненциально зависящими от величины постоянной решетки кубической фазы. Так, согласно этой модели в случае кристаллизации в кубической фазе моноолеина каждое увеличении постоянной решетки на 10 А приводит к замедлению нуклеации в -200 раз.
Таким образом, кривизна мембраны и эффект гидрофобного несоответствия мембраной части белков и гидрофобной области липидного бислоя могут представлять собой важный и, главное, эффективный инструмент в механизме кристаллизации белков in meso. Интересно отметить, что геометрия мембраны и сопряженная с ней энергия деформации являются критическими параметрами во многих жизненно важных клеточных процессах. Эффект гидрофобного несоответствия и кривизна мембраны, по-видимому, определяют и регулируют функции и характер взаимодействия интегральных мембранных белков с липидами в мембране, что необходимо для функционирования и поддержания структуры мембраны [47]. Так, в некоторых случаях кривизна мембраны является решающим фактором, регулирующим активность ключевых ферментов и транспортную функцию каналов, а также в белок-липидных взаимодействиях [48].
Надо заметить, что немаловажную роль в описанных выше представлениях о механизме кристаллизации мембранных белков в кубической фазе играют молекулы детергента. В силу своих природных свойств детергент воздействуют на липидный бислой, способствуя встраиванию белка в мембрану, и в то же время, изменяя свойства фазы. Поэтому стоит отдельно остановиться на структуре и свойствах детергентов, и их влиянии на фазовое поведение системы кристаллизации in meso.
Структура и кристаллы, выращенные при кристаллизации in meso
При кристаллизации in meso раствор белка смешивается с МО, в результате самопроизвольно образуется кубическая фаза. Как правило, такой раствор содержит значительное количество детергента, используемого на предварительном этапе солюбилизации и очистки мембранного белка. Известно, что для самоорганизующихся липидных структур, образованных двумя и более компонентами, характерны искривление или разрыв бислоя, нарушение пространственной упорядоченности (деформация решетки), а также непостоянная (негомогенная) кривизна мембраны [56]. В силу своей амфифильной и поверхностно-активной природы детергент влияет на свойства фазы и результат кристаллизации in meso.
В исследовании влияния »-додецил-Р- -мальтопиранозида на поведение системы моноолеин/вода [57] было показано, что при низких концентрациях ДДМ фаза гидратированного моноолеина оставалась относительно стабильной, и происходили лишь переходы из кубической РпЗт в кубичскую ІаЗсі фазу (рис. 1.10). При более высоких концентрациях /г-додецил-Р-)-мальтопиранозида наблюдались дестабилизация кубической фазы и формирование ламеллярной La фазы. Концентрация ДДМ данной трансформации фазы зависит от температуры.
Способность моноолеина формировать ту или иную фазу определяется исходной формой его молекулы с учетом природной кривизны. Молекула МО имеет относительно небольшую полярную группу, состоящую из глицерина и одной эфирной связи (рис. 1.11 А), а гидрофобный хвост при этом достаточно длинный (18 углеводородных групп) с изгибом в середине цепи вследствие сул -конформации двойной связи между 9-м и 10-м атомами углерода. В жидкокристаллической фазе гидрофобная цепь, с обилием trans/gauche изомеров вдоль всей цепи, достаточно подвижна. Таким образом, динамически усредненную форму молекулы можно представить в виде усеченного конуса с полярной группой в его узкой части и ацильной цепью в широкой. Упаковка конусов друг с другом часто приводит к образованию искривленной поверхности. Кубические фазы имеют искривленную углеводородную/водную поверхность, которая математически приблизительно описывается минимальной поверхностью, периодической в пространстве, разделяющей пространство на две многократно контактирующие, но не пересекающиеся области, со средней кривизной в любой точке этой поверхности равной нулю [59].
В лаборатории М. Каффри (М. Caffrey) было проведено исследование влияния наиболее популярных детергентов на фазовое поведение системы моноолеин/вода в зависимости от температуры, концентрации липида и соли [58]. Идентификация фаз и их микроструктура характеризовалась с помощью SAXS-измерений образцов, подготовленных в соответствии с условиями кристаллизации in mcso. Полученные результаты показали, что кубическая фаза относительно стабильна к добавлению относительно небольших количеств алкил- (гексил-, октил-. нонил-, децил) глюкопиранозидов (рис. 1.10), додецилмальтопиранозида. алкил- (додецил-, гексадецил-) фосхолинов, лаурилдиметиламиноксида, додецилсульфата натрия и CYMAL. Однако большие концентрации детергента вызывали переход системы в ламеллярную фазу [58].
Исследования поведения кубической фазы при добавлении различного количества детергента в систему имеют значение для понимания механизма кристаллизации in meso. Авторы данного исследования говорят о том, что, во-первых, небольшое количество детергента может способствовать кристаллизации белка, локально образуя ламеллярную фазу, в которой, как предполагается, происходит нуклеация и рост кристаллов [13;60]. Во-вторых, растворы белков с высокой концентрацией детергента могут привести к образованию ламеллярной фазы на первом этапе кристаллизации in meso. А затем при добавлении большой концентрации осадительного агента (соли) может произойти обратный фазовый переход из ламеллярной в кубическую, что благотворно повлияет на рост кристаллов [58]. В-третьих, детергенты могут увеличивать размер домена мезофазы, тем самым способствуя росту крупных кристаллов.
1.8. Структура и кристаллы, выращенные при кристаллизации in meso
Банк данных мембранных белков (MPDB; http://www.mpdb.ul.ie/) [61] представляет собой ценный Интернет-ресурс для анализа статистических данных опубликованных структур мембранных белков. По данным этого сайта на сегодняшний момент с помощью рентгеноструктурного анализа решены структуры более чем 500 интегральных мембранных белков, и около 10% (54 структуры) соответствуют кристаллам, выращенным методом in meso. В течение примерно десяти лет после появления первой структуры бактериородопсина в 1997 году [7] структуры около восьми различных типов мембранных белков были решены при кристаллизации методом in ineso. Наряду со структурой бактериородопсина к заслугам данного метода и принципиальным прорывам в области структурной биологии нужно особенно отметить впервые решенную структуру комплекса двух мембранных белков: сенсорного родопсина с его трансдыосером [3;4], а также совсем недавно полученные структуры таких важных рецепторов человека, как р\-адренергический и Аг\-аденозиновий GPCR (рецепторов, сопряженных с G белком) [5;6]. Можно сказать, что данный метод нашел применение в решении структур разных белков: прокариотического и эукариотического происхождения; мономерных, гомо- и гетероолигомерных белков; содержащих и не содержащих хромофор; а-спиральных и (3-структурных белков (рис. 1.12).
Структуры белков, полученные с использованием кристаллизационного метода in meso, внесли важный вклад в понимание функционирования мембранных белов на молекулярном уровне. Так, на сегодняшний день известны структуры основного и промежуточного состояний бактериородопсина, что привело к колоссальному прогрессу в понимании молекулярного механизма переноса протона БР и других светочувствительных белков этого класса [14;62]. С решением структуры сенсорного родопсина II в комплексе с его трансдыосером [3;4] выявлены ключевые молекулярные моменты передачи сигнала от рецептора в клетку в процессе фото- и хемотаксиса. Кристаллы LHII [27], BtuB [63], и ОрсА [64], выращенные в кубической фазе, обладают особо плотной упаковкой и высокой дифрагирующей способностью. В структурных исследованиях этих белков были выявлены новые детали связывания пигмента (LHJI), поверхностно-активного вещества (LHII) и липида (BtuB). Совсем недавно была получена с высоким разрешением первая структура двух рецепторов, сопряженных с G белком, также известных как семиспиральиые рецепторы, составляющих большое семейство трансмембранных рецепторов [5;6]. Они были закристаллизованы методом in meso. Впервые на молекулярных основах получено начальное понимание о функционировании представителей этой важной группы сигнал-передающих белков. Данная работа показала также важную роль связывания холестерина в стабилизации рецептора и его фармакологическое использование [65]. Как показывают примеры, приведенные выше, а также структуры белков, которые не были упомянуты, все эти данные свидетельствуют о широком диапазоне применения и высокие потенциальные возможности метода кристаллизации in meso.
Дополнительная очистка солюбилизированного бактериородопсина. Метод повышения качества БР
Кристаллизация в мостиках методом диффузии паров воды. Для кристаллизации стандартным методом использовали 24- и 96-луночные планшеты (Falcon, США). Необходимый объем маточного раствора разливали в резервуары планшетов и на полипропиленовые микромостики (Hampton Research, США) или в отведенную лунку (в случае 24- и 96-луночных плашек соответственно) раскапывали соответствующее количество предварительно приготовленной кристаллизационной смеси. Пробы герметизировали и оставляли в темноте при 22С. Первые кристаллы наблюдали через 2-3 недели. Для эксперимента с добавлением липида в кристаллизационную смесь расплавленный при 42С моноолеин смешивали с буфером в пропорции: 1 к 10, 16, 25, 27, 32, 50, 64, 81, 100, 125, 250, 500, 103, 104, 105 и в получившуюся суспензию при 35С добавляли белок. Объем маточного раствора в этом опыте составлял 400 и 600 мкл, объем капли - от 7 до 15 мкл. В случае кристаллизации из насыщенного раствора ю-октил-р-)-глюкопиранозида детергент растворяли в буфере для кристаллизации и смешивали с белком. Соотношение объемов капле к маточному раствору изменяли от 0,0055 до 0,045. Исходные концентрации компонентов в кристаллизационной смеси варьировали в диапазоне: для белка 6-15 мг/мл, детергента 7,3 - 55,3%, Na/K-Pi в кристаллизационном буфере: 250, 600, 800 мМ.
Кристаллизация бактериородопсина из пурпурных мембран в мезофазе моноолеина. Кристаллизацию бактериородопсина в кубической фазе моноолеина проводили в ПЦР пробирках (Biozym, Германия). Для этого расплавленный при 42С моноглицерид (п. 2.2.1.) раскапывали по 4 — 6 мг и осаждали центрифугированием на дно пробирки (10000 об/мин (13000 g) 10 мин). Пурпурные мембраны наилучшего качества (А280/А568 1JX сконцентрированные до конечной концентрации 28 мг/мл осаждением при 20000 g (4С), смешивали в соотношении 1:1 с удвоенной концентрацией детергента в буфере для кристаллизации (п. 2.2.1.). В итоге получали раствор пурпурных мембран (14 мг/мл) с требуемой концентрацией детергента (табл. 2.1) в 250 мМ Na/K-Pi буфере (рН 5,6), который немедленно раскапывали в предварительно приготовленные пробы с расплавленным мопоолеином в соотношении 1 : 2 (МО : препарат белка). В некоторых экспериментах конечная концентрация пурпурных мембран, а также соли в пробе и соотношение моноолеин / белковый раствор варьировались, что указано непосредственно в тексте. Кристаллизационную смесь центрифугировали (1500 об/мин, 5 мин, Тком„) и выдерживали для уравновешивания системы в темноте 48 ч при 22С. В качестве осадителя использовали сухую соль Na/K-Pi рН 5,6 (рЫ определяли для 100 мг/мл раствора соли) с конечной концентрацией в образце: 0,7; 0,9; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,9 М. Соль после добавления в пробу осаждали центрифугированием (1500 об/мин, 5 мин, Тко.чіі), и кристаллизационные пробы выдерживались сутки перед заключительным этапом гомогоиезации. Для равномерного распределения белка внутри кристаллизационной пробы и быстрейшего формирования кубической фазы смесь гомогонезировали последовательным центрифугированием при 24С. начиная с 5000 об/мин и постепенно увеличивая до 10000 об/мин (2700 - 10600 g) с шагом 1000 об/мин. Длительность каждого центрифугирования составляла 10 мин. Между центрифугированиями образцы поворачивали на 90. Кристаллы выращивали в темноте при 22С в течение 2-6 месяцев в зависимости от условий кристаллизации.
За ростом кристаллов следили при помощи стереомикроскопа (OLYMPUS, Япония). Кристаллизационные пробы с лучшими кристаллами (большого размера и правильной формой) отбирали с целью последующего использования в кристаллографических экспериментах. Для отделения кристаллов от кубической фазы содержимое кристаллизационной пробы с помощью микрошпателя переносили в 2.5 мл буфера для растворения фазы (п. 2.2.1) и выдерживали в темноте при 22С в течение 1 - 2 недель. Из растворенных проб кристаллы помещали в криопетли (Hampton Research, США), замораживали до 100 К в криоструе (Cryostream 700 series, Oxford cryosystems, Англия) и тестировали на рентгеновской установке с вращающимся анодом (Brueker-Nonius FR571).
Тестовые измерения и определение фактора двойникования кристаллов проводили на генераторе рентгеновского излучения с вращающимся анодом для оценки дифракционного качества белковых кристаллов перед основными измерениями. Используемый генератор оснащен двумерным Image Plate детектором (MAR Research, Гамбург, Германия) и одноосевым гониометром с горизонтальной осью вращения перпендикулярной рентгеновскому пучку. Измерения проводили при напряжение на аноде 50 кВ, силе тока 70 мА и с длиной волны рентгеновского излучения Л-=1,5418 А (характеристическое излучение Ка линии меди). Во время дифракционных экспериментов диаметр рентгеновского пучка выставляли размером 300 мкм. Для каждого кристалла снимали 3-5 картин дифракции со временем экспозиции 300 -1800 с на одну дифракционную картину и с разрешением в диапазоне 2,0 - 30 А. Данные интегрировали в программе MOSFLM и масштабировали в программе SCALA [104]. Для каждого кристалла определяли долю двойникования. используя программу DETW1N [104], а также ресурс (www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Twinning/. Yeates).
Установка для рентгеновской кристаллографии белков. Измерения картин рентгеновской дифракции проводили на установке ID14-EH1 ESRF (European Synchrotron Radiation Facility), которая предназначена для белковой кристаллографии. На данной установке используется монохроматичное синхротронное излучение с фиксированной длиной волны 0,934 А с размером сечения пучка 50 - 200 мкм (с расходимостью пучка 1/180). Характерная интенсивность около 1012 фотон-мм 2-с" . Установка оборудована азотной криоструей (Cryostream 700 series, Oxford cryosystems, Англия). Для регистрации дифракционной картины на установке используется детектор рентгеновского излучения ADSC Q210 CCD (размер активной области 210 мм х 210 мм, 4096 х 4096 ячеек, время считывания 0,9 с) (Poway, США).
Выбор стратегии измерений. Для выбора стратегии измерений снимали две дифракционные картины, расположенные под углом 90, по которым, используя программу MOSFLM [105], определяли разрешение (обычно 1,3 А - 1,5 А), симметрию (Рбз), постоянные решетки (около 61 А х 61 Ах ПО А), мозаичность (0,2 - 0.6), время экспозиции, угол осцилляции, начальный и конечный вращательный угол измерений. Затем снимали полный набор дифракционных данных, соответствующий для симметрии Рбз повороту кристалла на 90 с типичным углом осцилляции 0,4 и временем экспозиции 4 с на один дифракционный снимок. В случаях превышения интенсивности рефлексов в центральной части детектора его динамического диапазона снимали второй набор дифракционных данных с осцилляцией —1 и временем экспозиции 1 с на одну дифракционную картину с уменьшенной до 37,7% интенсивностью пучка и с разрешением 2 А.
Данные интегрировали в программе MOSFLM [105] и масштабировали в программе SCALA [104]. Для построения моделей по данным с малой долей двойникования использовали пакет программ CCP4I [104]. Для решения фазовой проблемы использовали метод молекулярного замещения, реализованный в MOLREP [104]. В качестве начальной использовали полиаланиновую модель, построенную на основе опубликованной структуры основного состояния бактериородопсина с разрешением 1,55 А [2]. Для первичного построения модели использовали автоматизированную систему уточнения модели ARP/wARP [107]. Для дальнейшего уточнения модели использовали REFMAC5 [108]. Данные с совершенным двойникованием обрабатывали, используя специальные процедуры в CNS [109]. Карты 2Fo-Fc, а также разностные карты Fo—Fc были построены как часть стандартных процедур в REFMAC5. Взвешенные экспериментальные разностные карты Fc-Fc были построены с использованием доработанных стандартных процедур в CNS. Карты электронной плотности изучались в программе Coot [110].
Поведение кристаллизационной системы при изменении объемного соотношения белковый раствор / липид
С целью повышения эффективности кристаллизации мембранных белков in meso был разработан новый метод на базе кристаллизации бактериородопсина в липидной фазе непосредственно из пурпурных мембран, минуя стадию солюбилизации и очистки. Данный метод позволяет избежать в случае БР солюбилизации, в случае других мембранных белков ресолюбилизации, а также исключить зачастую необходимый этап обмена детергента непосредственно перед кристаллизацией и минимизировать неизбежные при этом потери и ухудшение качества белка. Известно, что перевод белка из нативного липидного окружения в растворимое мицеллярное состояние зачастую очень болезненно сказывается на его структуре и функциональности, что может служить причиной снижения качества кристаллов. Как правило, очень трудно подобрать детергент, удовлетворяющий одновременно условиям поддержания стабильности белка в процессе выделения, очистки и его последующей успешной кристаллизации. Во многих случаях солюбилизированиый в одном детергенте мембранный белок переводят (с помощью диализа, гель-фильтрации, реконструкции в липидный бислой с последующей ресолюбилизации в новом детергенте и т. д.) в другой, более подходящий и способствующий кристаллизации [113]. Поиск оптимального солюбилизирующего и подходящего для кристаллизации агента требует перебора многих условий и типов детергентов и неизбежно приводит к росту временных и финансовых затрат.
Как известно, пурпурные мембраны, состоящие из 75% белка бактериородопсина и 25% молекул липида уникального класса [84], выделяются из Halobacterium salinarum без использования детергента. В литературе описаны попытки кристаллизации бактериородопсина непосредственно из пурпурных мембран, минуя стадию солюбилизации [115]. Первая кристаллизация бактериородопсина из пурпурных мембран в липидной кубической фазе была проведена в 1999 году [115]. Пурпурные мембраны после очистки добавлялись к моноолеину в соотношении 40 : 60% (w/w) (стандартные условия образования кубической фазы). Конечная концентрация пурпурных мембран в кубической фазе составляла 3,5 мг/мл. В качестве преципитанта использовалась сухая смесь фосфатов калия и натрия (в конечной концентрации 0,2 - 0,3 мг Na/K-Pi на 1 мг кубической фазы). Кристаллы росли в течение 1 — 6 месяцев при 20С или 12С, в. большом количестве и малых размеров до 50 мкм. Рентгеноструктурные данные интегрировались до разрешения 3,5 А. Данный способ кристаллизации, как в заключение статьи пишут авторы, противоречит принятой догме, что детергенты являются необходимыми компонентами в трехмерной кристаллизации интегральных мембранных белков.
Принципиальным отличием нового разработанного метода кристаллизации бактериородопсина из пурпурных мембран в липидной кубической фазе является добавление детергента в кристаллизационную систему непосредственно на этапе кристаллизации (что тем самым говорит о необходимости использования детергентов при кристаллизации БР из пурпурных мембран in meso). Пурпурные мембраны смешивались с кристаллизационным буфером, содержащим различные концентрации детергента ОГ, и после этого добавлялись к МО в соотношении 2 : 1 (кристаллизационные условия, соответствующие 8G(OF) в табл. 2.1). Кристаллизация индуцировалась добавлением сухой смеси фосфатов калия и натрия. Результаты данной кристаллизации БР из ПМ, полученные через три месяца инкубации в темноте при 22С, представлены на рис. 3.3 в виде диаграммы зависимости максимального размера кристаллов в пробах от концентрации детергента и концентрации соли Na/K-Pi в пробе.
Представленные результаты, как и результаты эксперимента Ноллерта (Nollert) и др., свидетельствуют о том, что бактериородопсин кристаллизуется из пурпурных мембран без предварительной солюбилизации и очистки. Однако по сравнению с кристаллизацией без использования детергента его добавление в кристаллизационную систему приводит к значительному увеличению размеров кристаллов ( в 10 раз) и существенному улучшению их дифракционного качества. Так, кристаллы наибольших размеров 350 - 400 мкм с качеством дифракции рентгеновского излучения до 1,26 А образовывались в течение трех месяцев при 7 - 10% ОГ и при концентрации соли от 1,4 до 1,9 М. Как видно из диаграммы, размер кристаллов существенно зависит от концентрации и-октил-р- -глюкопиранозида. При небольшой концентрации и-октил-р-D-глюкопиранозида (3,5%) вырастало много кристаллов размером от 50 до 150 мкм. С увеличением концентрации детергента (вплоть до 10%) уменьшалось количество образующихся кристаллов, и увеличивался их размер. На диаграмме явно выделяется ограниченная по концентрации и-октил-Р-і глюкопиранозида область кристаллизации, только внутри которой образовывались кристаллы бактериородопсина. В пробах с концентрацией меньшей 1% и в пробах, приготовленных с концентрацией более 13% ОГ, кристаллов не наблюдалось вообще.
Несмотря на то, что по стандартному протоколу бактериородопсин солюбилизируется в течение двух суток при 4С в присутствии 3,75% (w/v) rt-ОКТИЛ-Р- D-глюкопиранозида, отсутствие кристаллов в пробах с небольшими концентрациями детергента нельзя объяснить недостаточной эффективностью солюбилизации пурпурных мембран. Ноллерт и др. получали кристаллы из пурпурных мембран и без добавления детергента. В своей статье авторы говорят о невозможности кристаллизации бактериородопсина из кусков пурпурных мембран внутри липидного кристаллического матрикса из-за их большого размера, а также плоской геометрии островков ПМ по сравнению с изогнутой мембраной кубической фазы. Одно из предположений возможного механизма кристаллизации в этом случае следующее: после добавления соли происходит трехмерная кристаллизация вследствие диффузии мономеров БР вдоль изогнутой мембраны, образовавшихся после дезорганизации ПМ. индуцируемой МО. Возможно, в случае малых концентраций детергента (меньших 1%) белку трудно встроиться в липидный бислой мезофазы. Кроме того, отсутствие кристаллов при концентрациях меньших —1% и больших 13% можно объяснить несоответствием эффективной толщины липидного бислоя МО с гидрофобной областью бактериородопсина. При таких концентрациях толщина липидного бислоя уменьшается настолько, что переход белка в бислой невыгоден в этом случае. При этом возможно, что при больших концентрациях детергента кубическая фаза исчезает и переходит в ламеллярную (исчезает подходящая матрица для кристаллизации).
Ранее в экспериментах зависимости кристаллизации БР в кубической фазе от концентрации и-октил-р--глюкопиранозида в кристаллизационной пробе использовался солюбилизированный белок, и был проварьирован широкий диапазон концентраций детергента [116]. Результаты двух независимых экспериментов представлены на рис. 3.4 в виде контурной карты зависимости среднего размера кристаллов в пробе от концентрации ОГ в растворе белка и конечной концентрации соли. Кристаллы наибольших размеров 250 - 350 мкм образовывались при 10 - 16% ОГ и 0,9 - 1,1 М Na/K-Pi и росли в течение трех месяцев и более. Сравнивая результаты этой кристаллизации и кристаллизации бактериородопсина из пурпурных мембран можно отметить, что солюбилизированный БР кристаллизуется при более высоких концентрациях детергента и более низких концентрациях соли, чем БР из ПМ. При этом размеры и качество образующихся кристаллов сопоставимы.
