Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 7
1.1 Аптамеры 7
1.1.1 Структура и применение аптамеров 7
1.1.2 Поиск и синтез аптамеров 10
1.2 Тромбин 12
1.2.1 Общая сведения 12
1.2.2 Аптамеры к тромбину 16
1.3 Цитохромы 22
1.3.1 Функции цитохромов 22
1.3.2 Суперсемейство цитохромов Р450 22
1.33 Цитохром Р450 51А1 26
1.4 Методы молекулярного моделирования 27
1.4.1 Метод молекулярной динамики : 28
1.4.2 Докинг. Исследование белок-лигандных взаимодействий 31
1.4.3 Виртуальный скрининг 33
1.4.4 Использование компьютерных методов для поиска аффинных
аптамеров 35
2 Объекты и методы 36
2.1 Объекты 36
2.2 Компьютерные методы
2.2.1 Докинг 37
2.2.2 Молекулярная динамика 37
2.2.3 Расчет энергий связывания 38
2.3 Экспериментальные методы 38
2.3.1 Синтез аптамеров 38
2.3.2 Экспериментальная проверка сконструированных аптамеров 39
3 Результаты 40
3.1 Анализ структур комплексов белок-аптамер и разработка стратегии компьютерного конструирования аптамеров 40
3.2 Исследование взаимодействия (анти)тромбинового аптамера с тромбином и претромбином-2 46
3.2.1 Поиск возможных сайтов взаимодействия тромбина с аптамерами методами молекулярного докинга 47
3.2.2 Исследование взаимодействия ТВА с тромбином и претромбином-2 методами молекулярной динамики 50
3.3 Компьютерное конструирование аптамеров к цитохрому Р450 51А1 62
3.3.1 Поиск сайта связывания аптамеров и конструирование "узнающего " фрагмента аптамера 62
3.3.2 Поиск конформации стабилизирующего участка аптамера 68
3.3.3 Экспериментальное тестирование 73
4 Обсуждение 76
Выводы 83
Список литературы
- Докинг. Исследование белок-лигандных взаимодействий
- Использование компьютерных методов для поиска аффинных
- Экспериментальные методы
- Поиск возможных сайтов взаимодействия тромбина с аптамерами методами молекулярного докинга
Введение к работе
Актуальность работы
Аптамеры представляют собой небольшие одноцепочечные молекулы ДНК или РНК, способные связываться с белками с высокой аффинностью и специфичностью [Mayer G., 2009]. В большинстве случаев они состоят из 15-30 нуклеотидов и имеют стабильную пространственную структуру [Baldrich Е., 2010], обеспечивающую селективность связывания с конкретными белками.
В настоящее время исследованию и поиску аптамеров уделяется большое внимание. Они рассматриваются в качестве перспективной замены антител в лекарственной терапии и в качестве высокоаффинных реагентов в биотехнологии [Tombelli S. et al., 2005; Pendergrast P.S. et al., 2005; Mosing R.K. et al., Bowser M.T. et al., 2007]. В отличие от антител, синтез аптамеров намного проще, в них легче вносить изменения для повышения аффинности и селективности, они обладают дополнительными технологическими преимуществами, такими как высокая стабильность при их хранении [Сох J.C. et al., 1998; Ferreira, C.S. et al., 2007].
Для поиска и синтеза аптамеров в настоящее время применяются экспериментальные методы. Основным из них является метод SELEX [Syed, М.А., 2010], который основан на повторяющейся десятки раз процедуре удлинения, полимеризации и отбора олигонуклеотидов из начальной библиотеки нуклеотидов со случайной последовательностью. В результате, создание нового аптамера является трудно предсказуемой задачей с высоким уровнем случайности.
Одним из возможных подходов для ускорения поиска и создания аптамеров является применение методов компьютерного моделирования. Предварительные исследования in silico позволили бы задать начальную библиотеку аффинных олигонуклеотидов для дальнейшего поиска, тем самым минимизировав неопределенность и случайность экспериментального поиска, или проведение полного цикла конструирования аптамеров. Компьютерные подходы успешно применяются на разных этапах поиска и оптимизации структур биологически активных низкомолекулярных соединений [Fukunshini Y. et al., 2009, Veselovsky A.V., Ivanov AS, 2003].
Несмотря на эффективность применения компьютерных методов для поиска и оптимизации низкомолекулярных лигандов, для более сложных по структуре молекул аптамеров они практически не использовались. Применение компьютерных методов молекулярного моделирования в основном ограничивалось исследованиями взаимодействия между уже известными парами белок-аптамер [Lin Р.-Н, 2012]. Примером является
исследование изменения взаимодействий между тромбином и его известным 15-членным аптамером (ТВА, thrombin-binding aptamer) при внесении изменений в структуру олигонуклеотида [Pagano В. et al, 2007].
Для поиска РНК аптамеров к низкомолекулярным соединениям был разработан подход, имитирующий метод SELEX in silico. Было показано, что он позволяет получать правдоподобные результаты, но требует значительных временных затрат и больших вычислительных мощностей [Chushak Y., Stone М.О., 2009]. Подобные работы доказывают перспективность применения компьютерных методов для исследования взаимодействия и поведения белков в комплексе с аптамерами.
Цель работы: разработать подход рационального компьютерного конструирования аптамеров к белкам-мишеням и апробировать его на примере цитохрома Р450 51А1.
Задачи:
1. Отработать методику исследования белок-аптамерных комплексов с использованием
компьютерных подходов на примере тромбина и его 15-членного аптамера.
-
Разработать подход по рациональному направленному конструированию аптамеров in silico.
-
Применить предложенный подход для конструирования аптамеров к цитохрому Р450 51А1 и провести их экспериментальную проверку.
Научная новизна
Предложен метод рационального компьютерного конструирования аптамеров к белкам-мишеням. Он включает поиск потенциального места связывания аптамера на поверхности белка методом молекулярного докинга, отбор коротких олигонуклеотидов, определяющих узнавание и связывание аптамера с белком и конструирование дополнительного участка аптамера, ответственного за поддержание его пространственной структуры. Применимость метода подтверждена на примере цитохрома Р450 51А1.
На основе предложенного метода впервые были найдены аптамеры к белку из семейства цитохромов Р450. Константы диссоциации сконструированных аптамеров для цитохрома Р450 51А1 были в диапазоне 10" - 10" М.
Показано, что различная аффинность антитромбинового аптамера ТВА с тромбином и претромбином-2 обусловлена изменением подвижности петли экзосайта-1 при превращении претромбина-2 в тромбин.
Личный вклад
Автором проведены все компьютерные исследования и расчеты, включая исследование применимость современных компьютерных методов молекулярного докинга, молекулярной динамики и методов оценки энергии взаимодействия для описания и изучения комплексов белков с аптамерами. Было исследовано взаимодействие тромбина и претромбина-2 с 15-членным аптамером ТВ А. Автором был предложен подход двухэтапного рационального конструирования аптамеров к белкам-мишеням. Предложенным методом были разработаны аптамеры к цитохрому Р450 51А1.
Практическая значимость
Разработан подход по направленному компьютерному конструированию аптамеров для целевого белка de novo. На основе предложенного подхода созданы аптамеры к цитохрому Р450 51А1, которые могут быть использованы в качестве аффинных реагентов для цитохромов Р450. Этот подход может применяться на предварительном этапе для создания начальной библиотеки нуклеотидов для метода SELEX для повышения эффективности направленного поиска аптамеров или для проведения полного цикла конструирования аптамеров.
Положения, выносимые на защиту:
-
Предложен двух стадийный подход по рациональному конструированию аптамеров in silico.
-
Компьютерными методами разработаны аптамеры к цитохрому Р450 51А1, и была экспериментально показана их аффинность и селективность к цитохромам Р450.
-
Отличие в связывании ТВ А с пртетромбином-2 и тромбином обусловлено изменением подвижности аминокислотных остатков, контактирующих с аптамером.
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены в виде тезисов и докладов на российских и международных конференциях: "The Sixth international conference of bioinformatics of genome regulation and structure (BGRS'2008)", Новосибирск, 2008; Национальной конференции "Иформационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач, ИВТН-2010"; XIX Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 2011; международной научно-практической конференции "Фармацевтические и медицинские биотехнологии", Москва,
2012; международной интернет-конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии", Казань, 2012.
Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 7 научных работ, из них 2 в рецензируемых журналах из списка ВАК, и пять работ в материалах российских и международных научных конференций.
Объем и структура диссертации
Докинг. Исследование белок-лигандных взаимодействий
Цитохромы Р450 являются широко изучаемым суперсемейством, относящимся к цитохромам класса Ъ, для которого настоящее время известно 11500 индивидуальных белков, выполняющих в организме различные функции. С одной стороны, цитохромы Р450 участвуют как в метаболизме эндогенных субстратов (таких как липиды, витамины, гормоны), с другой же, представители этого суперсемейства участвуют в окислении экзогенных соединений (ксенобиотики, лекарства). Считается, что до 75% лекарств метаболизируется с участием этих ферментов.
Основная функция цитохромов Р450 заключается в проведении монооксигеназной реакции - присоединения одного атома кислорода к органическому субстрату и окисления второго атома кислорода до Н20 (Схема). На рисунке 11 представлены основные стадии каталитического цикла цитохрома Р450, приводящего к гидроксилированию субстрата (R-H).
На первом этапе связывание субстрата приводит к смещению дистальной молекулы воды. Это вызывает сдвиг спинового равновесного состояния гемового железа с низко спинового (S = 1/2) к высоко спиновому (S = 5/2), что повышает положительный потенциал железа и способствует переносу электрона от редокс-партнера для перевода железа гема в двухвалентное состояние. Двухвалентное железо в дальнейшем связывает кислород с образованием первого промежуточного состояния. Перенос второго электрона от редокс-партнера переводит железо гема в перекисное состояние, а дальнейшее протонирование способствует образованию гидропероксида (также известного как соединение-О). Последующее протонирование приводит к отщеплению гидроксида и образованию молекулы воды. В результате образуется новое переходное состояние гемового железа - оксиферрил (соединение-1). Этот интермедиат является наиболее значимым в каталитических реакциях большинства цитохромов Р450. Соединение-1 взаимодействует с субстратом и вызывает его гидроксилирование. Высвобождение продукта (R-OH) позволяет воде заново связаться с трехвалентным железом и завершить цикл [Munro A.W., 2007].
В клетках животных обнаружено более 3300 представителей (128 семейств) этого суперсемейства (http://dmehon.ulhsc.edu/P450.statsfile.htmT). Для подавляющего большинства CYP их функции не известны. Остальные цитохромы Р450 условно делят на две группы: цитохромы, метаболизирующие ксенобиотики и CYP, которые участвуют в биосинтезе различных соединений. Белки, относящиеся к первой группе, обладают широкой субстратной специфичностью и способны окислять огромное количество различных соединений. Цитохромы второй группы катализируют отдельные регио- и стереоспецифичные реакции и направлены на синтез определенных метаболитов и, соответственно, имеют узкую специфичность к субстратам, по сравнению с семействами первой группы.
В цитохромов Р450 выделяют участки аминокислотных последовательностей образующие активный центр ферментов, ответственные за связывание субстратов, названные сайт распознавания субстрата (substrate recognition sites, SRSs) [Gotoh О, 1992]. В цитохромах первой группы изменения аминокислотных остатков в этих сайтах часто не приводит к инактивации цитохрома, но сильно изменяет его предпочтения к различным субстратам. Это стало основополагающей особенностью для эволюционной адаптации метаболических процессов организмов к увеличению разнообразия соединений, появляющихся в природе [Negishi М., 1996]. Мутации в цитохромах, относящиеся ко второй группе, могут приводить к серьезным заболеваниям и даже могут быть летальными [Guengerich F.P., 1997].
В настоящее время в банке PDB находится более пятидесяти кристаллических структур цитохромов Р450 млекопитающих и их комплексов. Несмотря на значительные отличия в аминокислотных последовательностях, пространственная организация данных белков схожа (Рис. 12). В пространственной структуре белков семейства цитохромов Р450 преобладают а-спирали и среди них выделяют консервативный участок, образованный спиралями I, L, Е, К, К и аминокислотами, координирующие гем. Остальные же участки, включая сайты распознавания и связывания субстратов, более вариабельны.
Ланостерин 14а-деметилаза человека (CYP51A1) относится к белкам суперсемейства цитохромов Р450. Семейство CYP51 считается старейшим среди всего суперсемейства цитохромов Р450 и является единственным, белки которого обнаружены во всех царствах живых организмов. Структуры данных белков обладают высокой консервативностью [Lepesheva G.I., 2007]. В настоящее время известно более 150 аминокислотных последовательностей белков семейства CYP51. У человека фермент ланостерин 14а-деметилаза играет важнейшую роль в биосинтезе холестерина. Также была выявлена его регуляторная функция в процессах созревания половых клеток [Stromstedt М, 1998].
Этот фермент катализирует трехстадийную реакцию 14 х-деметилирования стеролов, на каждой стадии которой требуется молекула кислорода и NADPH (Рис. 13). При этом 14а-метильная группа сначала превращается в спиртовую, затем в альдегидную, и на конечном этапе отщепляется в виде муравьиной кислоты [Fischer R.T., 1991].
Ингибиторы стерин-14а-деметилазы широко применяются для борьбы с различными простейшими, вызывающими ряд заболеваний, и грибами, так как этот фермент участвует в синтезе эргостерина - важнейшего компонента их клеточных мембран. В настоящее время ингибирование CYP51A1 является перспективным методом борьбы с Trypanosoma cruzi (возбудителя болезни Шагаса), Trypanosoma brucei (возбудителем сонной болезни), представителями рода Leishmania и Mycobacterium tuberculosis [Podust L.M., 2007]. Также ингибиторы CYP51A1 человека рассматриваются как перспективные лекарственные препараты для лечения гиперхолистеринемии [Pikuleva I.A., 2006].
"Молекулярное моделирование" прошло долгий путь с первых дней его использования по настоящее время и за все это время претерпело множество изменений. В современной науке под "молекулярным моделированием" подразумевают применение компьютерных моделей в молекулярных исследованиях различных систем в пределах от нескольких атомов до множества биополимеров. Эти модели используются для моделирования процессов, происходящих во временных рамках от 10"15 до нескольких секунд, в зависимости от точности расчетных методов и используемых компьютерных мощностей. Очевидно, что высокая точность расчетов при больших размерах системы на длительных траекториях симуляций требуют колоссальных компьютерных мощностей. В связи с этим существует проблема выбора методов с оптимальным для каждого конкретного исследования соотношением точности получаемых результатов и объема необходимых компьютерных ресурсов и времени.
Использование компьютерных методов для поиска аффинных
Докинг проводился в программе Dock6.5. В процессе молекулярного докинга аминокислотные остатки оставались неподвижными, в то время как олигонуклеотиды были гибкими и могли изменять свою пространственную конформацию. Предварительно для структур белков были рассчитаны поверхности методом Conolly с использованием пробного атома радиусом 1,4 А. Для расчета электростатических взаимодействий были использованы "решетки" с размером ячейки 0,3 А. Нековалентные взаимодействий учитывались на расстояниях до 12 А. Параметры Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий брались из силового поля Amber (w_AMBER_parm99.defn).
Первичный отбор найденных конформаций комплексов проводился по предсказанной энергии взаимодействия с помощью оценочной функции программы Dock6.5. Дальнейший анализ полученных результатов проводился в программе Sybyl8.1 с использованием макросов, написанных на встроенном языка программирования SPL [StulovS.,2013].
Моделирование молекулярной динамики проводилось с использованием пакета программ Amber9. Исходно система содержала белок или комплекс белок-аптамер, растворитель в явном виде (модель воды tip3p) и ионы Na+ для нейтрализации заряда системы. При построении ячейки для симуляции MD использовали отступ 10А от поверхности комплекса до границ бокса. Для стабилизации аптамеров в центр квадроплекса каждого аптамера был добавлен ион К+ [Reshetnikov R.V., 2011]. Для описания параметров аминокислотных остатков использовалось силовое поле ff03, для нуклеотидов - parmbscO.
Для всех комплексов предварительно была проведена пошаговая минимизация энергии (500 шагов) с последующим нагревом и выравниванием давления на траектории по 100 пс. Полученные таким образом системы были использованы для последующей молекулярной динамики. Симуляции проводились на траекториях 10 не с шагом в 2 фс с использованием баростата Бэрендсена для контроля давления (1 атм) и термостата Ланжевена для поддержания температуры системы 300К. Расчет электростатических взаимодействий производился методом РМЕ.
Анализ траекторий молекулярной динамики проводили с использованием программы ptraj пакета AmberTools и VMD 1.9.1 [Humphrey W., 1996]. Анализ траекторий методом главных компонент (PCA) [Hayward S., 2008] проводили с использованием пакета PCAsuite. При анализе были построены 10 главных векторов, покрывающих около 70% пространства значений. Остальную обработку данных, построение графиков и диаграмм выполняли в программе QtiPlot.
Энергию взаимодействия аптамеров с белками рассчитывали с использованием метода MM-PBSA [Kollman Р.А., 2000; Massova I., 2000]. Расчет энергии проводили на временном отрезке в 2 не на основе 10 мгновенных состояний системы. Сольватационный вклад в энергию связывания рассчитывался с использованием метода Poisson-Boltzmann. Энтропийный вклад был определен методом нормальных мод при помощи программы Nmode пакета Amber9.
Вычисления проводились на многопроцессорном сервере HP со следующими характеристиками: 4 центральных процессора по 6 ядер, 64 Гб оперативной памяти под управлением операционной системы Centos 5.6 и вычислительном кластере, состоящем из 8 узлов с 8 ядрами на каждом и 16 Гб оперативной памяти.
Синтез олигонуклеотидов был выполнен в лаборатории медицинской геномики (к.х.н. Радько СП.) ФГБУ «ИБМХ» РАМН. 5 -биотин-меченые олигонуклеотиды были синтезированы на ДНК-синтезаторе ASM-800 (Биосет, Новосибирск, Россия) по методике производителя. Синтезированные олигонуклеотиды были очищены с применением обращенно-фазовой хроматографии с использованием Poly-Pak картриджей Glen Research (Sterling, VA, США). В процессе синтеза олигонуклеотидов и при их очистке использовали реагенты от Acros Organics І (Geel, Бельгия), за исключением фосфоамидитов и этилтеразола от Glen Research. Биотин связывался с 5 -концом олигонуклеотида через гексаэтиленгликолевый линкер.
Экспериментальная проверка аффинности и селективности синтезированных аптамеров была проведена в лаборатории межмолекулярных взаимодействий (зав. лаб., проф., д.б.н. Иванов А.С.) ФГБУ «ИБМХ» РАМН.
Эксперименты по исследованию взаимодействия ДНК-олигонуклеотидов с белками выполняли на оптическом биосенсоре Biacore Т200 (GE Healthcare Life Sciences, США). В работе использовали оптические чипы SA с иммобилизованным на карбоксиметилированном декстране стрептавидином, на который иммобилизировали биотинилированные олигонуклеотиды. Взаимодействие ДНК-белок исследовали, инжектируя растворы белков в диапазоне концентраций 10 нМ - 1 мкМ. Равновесные константы диссоциации комплексов белков с иммобилизованными олигонуклеотидами вычисляли с помощью программы BIAevaluation Version 4.1 (GE Healthcare Life Sciences, США), из зависимости равновесного сигнала биосенсора от концентрации белка в соответствии с уравнением: Req/Rmax = С / (KD + С), где Req - равновесный сигнал биосенсора при данной концентрации белка, Rmax - максимальный сигнал биосенсора при данном количестве иммобилизованных олигонуклеотидов, С - концентрация белка в растворе, KD -равновесная константа диссоциации. Для оценки селективности были
Экспериментальные методы
Повышенный интерес в последние годы к аптамерам связан с рядом их преимуществ по сравнению с антителами, к которым относят высокую стабильность, низкую иммуногенность, легкость синтеза и др. [Ferreira, C.S., 2007; Jayasena S.D, 1999]. Основной недостаток аптамеров, связанный с трудностью их поиска для ряда белков (в основном с отрицательно заряженной поверхностью), по-видимому, может быть преодолен с использованием их модификаций, получивших название соммамеры [Bordy E.N., 2000], которые могут значительно расширить области применения таких конструкций.
Для поиска аптамеров был разработан метод SELEX [Tuerk С, 1990], но он требует больших количеств чистого белка и синтез больших библиотек олигонуклеотидов. В методе SELEX обычно проводится только отбор нуклеотидов из уже синтезированной библиотеки, в результате в этом методе высока доля случайности и неопределенности, поскольку требует присутствия аптамера (олигонуклеотида с нужной последовательностью) в используемой библиотеке. Кроме того, остается неизвестной место связывания аптамера на мишени и пространственная структура самого аптамера.
Ранее был реализован и апробирован метод, представляющий собой компьютерный аналог SELEX [Chushak Y., 2009]. Но серьезным недостатком этого метода является то, что он требует значительных компьютерных мощностей, и расчеты занимают много времени, при том, что в реализованном алгоритме используется только очень грубая оценка энергии связывания (по оценочной функции докинга).
В предложенном нами подходе, который можно назвать рациональным конструированием аптамеров, аптамеры можно собирать из двух частей - "узнающей" и "структурной". Такой подход не требует предварительной генерации пространственной структуры, она получается только на конечной стадии моделирования, оптимизирует использование вычислительных ресурсов, при этом позволяет использовать более точные оценки энергии связывания и исследовать устойчивость построенных комплексов. Тем не менее, среди возможных ограничений этого подхода можно отметить отсутствие полной автоматизации метода (на ряде стадий требуется экспертная оценка и выбор), возможные сложности при подборе структурной части аптамера, возможное отсутствие высокой корреляции между оценкой энергии связывания, рассчитываемой для узнающей части и экспериментальной величиной связывания для целого аптамера. Тем не менее, используя этот подход, нами были сконструированы аптамеры, способные связываться с цитохромом Р450 51А1, причем полученные в компьютерных экспериментах оценки хорошо коррелировали с экспериментально определенными величинами (Рис. 33).
При выборе "узнающей" части аптамеров для дальнейшего анализа нами было использовано два критерия: частота попадания нуклеотида в составе любого олигонуклеотида в выделенные три зоны (статистический критерий) (Табл. 3) и оценка энергии связывания по внутренней оценочной функции DOCK (Табл. 4). Анализ экспериментальных результатов тестирования аффинности аптамеров позволяет сделать несколько выводов. Олигонуклеотид, выбранный по статистическому критерию (CGT), показал достаточно высокую аффинность, однако она не была самой высокой; более того на основании только статистического критерия трудно было бы отобрать олигонуклеотиды, показавшие наилучшую аффинность (GGG и AGG). Это указывает, что использование только этого критерия является недостаточным. Анализ так же показывает, что выбор олигонуклеотидов по оценочной функции дает более достоверные результаты - олигонуклеотиды, выбранные по высокой величине DockScore, оказались более аффинными, чем олигонуклеотиды с низкой величиной оценки. Тем не менее, коэффициент корреляции между величинами DockScore и экспериментальными величинами невысокий (Рис. ЗЗА). По-видимому, этот критерий наиболее правильно использовать в качестве первоначального для выбора олигонуклеотидов, которые будут использованы в дальнейшем анализе. Метод MM-PBSA для оценки энергии связывания показал свою эффективность. Его коэффициент корреляции с экспериментальными значениями достаточно высок (R2=0,78) (Рис. ЗЗБ) для того, чтобы его предложить в качестве основного критерия. Кроме того, как ранее было отмечено, замена лишь одного центрального нуклеотида "узнающей" части аптамера значительно влияет на его аффинность. Так, аптамеры с CGT в повороте шпильки и CAT связывались с цитохромом Р450 51А1 с константами диссоциации 0,28 и 0,6 мкМ, соответственно, что так же наблюдалось и по предсказаниям энергии связывания методом MM-PBSA. Поскольку для его расчета используется молекулярная динамика, то анализ поведения олигонуклеотидов в комплексе с белком-мишенью можно использовать как дополнительный критерий оценки стабильности комплексов.
Кроме первоначального выбора олигонуклеотидов в предложенном алгоритме конструирования аптамеров, результаты докинга также используются для выбора места связывания аптамеров. Докинг олигонуклеотидов на структуры тромбина и цитохрома Р450 51А1 показал несколько возможных сайтов. Так, для тромбина их было два (Рис. 17), что хорошо согласуется с известными данными о связывании разных аптамеров с обоими сайтами [Tasset D.M., 1997; Padmanabhan К., 1993]. Причем экзосайт-1, с которым связывается исследованный нами аптамер (ТВА) не был основным, с которым связывались большинство локированных тринуклеотидов. Вероятнее всего это обусловлено, с одной стороны, структурой самого сайта, основная часть которого представлена подвижной петлей, «выступающей» над поверхностью белка, а, с другой стороны, особенностями алгоритма докинга, который «предпочитает» укладывать лиганды в углубления на белке для повышения площади контакта. По результатам докинга на структуре цитохрома Р450 51А1 было выделено три таких области (Рис. 26), причем одна из них представляет собой переход от F -спирали к G-спирали, и эта область обогащена положительно заряженными аминокислотными остатками. Можно предположить, что она также (как и в случае экзосайта-1 тромбина) может быть местом связывания аптамера. Конструирование аптамеров к этому участку белка, с последующим соединением их в единую конструкцию с найденным в этой работе аптамером может привести к высокоэффективному и высокоселективному аффинному реагенту. Ранее было показано, что создание таких димерных конструкций приводит к неаддитивному увеличению эффективности связывания аптамеров [Рахметова С.Ю., 201 ОБ]. Это может быть одним из путей дальнейшего повышения аффинности разработанных аптамеров.
Полученные значения констант диссоциации для аптамеров цитохром Р450 51А1 не являются очень высокими, но они лежат в области аффинности ранее найденных аптамеров для других белков (10"6 - 10"" М) [Ahmad К.М., 2011]. Кроме того, полученные аптамеры не проявляли абсолютной селективности. Было показано, что они с той же эффективностью способны связываться с другим представителем этого суперсемейства - цитохромом Р450 ЗА4. Причина этого, вероятнее всего, кроется в том, что участки роверхности, на которые конструировали аптамеры для цитохрома Р450 51А1, у этих белков похожи (Рис. 35). Представители этого суперсемейства, несмотря на частую низкую гомологию в аминокислотной последовательности, сохраняют общую пространственную укладку белковой цепи. Участки связывания аптамеров в обоих белках обогащены положительно заряженными и ароматическими аминокислотными остатками. Поэтому, несмотря на низкую гомологию в аминокислотной последовательности этих участков они имеют близкие физико-химические свойства, что, по-видимому, и определило связывание апрамеров с обоими белками.
Поиск возможных сайтов взаимодействия тромбина с аптамерами методами молекулярного докинга
Для проверки предложенного подхода рационального конструирования аптамеров с применением компьютерных методов в качестве мишени нами был использован цитохром Р450 51А1. Для белков этого суперсемейства ранее не было показано взаимодействие с олигонуклеотидами и аптамеры для них не были известны.
Как было показано на примере тромбина, проведение молекулярного докинга библиотеки тринуклеотидов позволяет достоверно определить сайты связывания аптамеров. Используя этот же подход, нами был проведен поиск возможных мест связывания олигонуклеотидов на поверхности цитохрома Р450 51А1. В результате молекулярного докинга библиотеки тринуклеотидов было найдено три возможных сайта связывания аптамеров, представленные на рисунке 26.
Рис. 26. Три потенциальных места связывания олигонуклеотидов на поверхности цитохрома Р450 51А1. Наиболее перспективный из них располагался на проксимальной стороне CYP51 (сайт II), образованный аминокислотными остатками, расположенными на поверхности белка вокруг ARG448. На этом сайте располагалось более 80% от всех найденных в ходе докинга конформаций тринуклеотидов. Первый сайт располагался в районе спиралей В", G и I. Третий сайт находился на противоположной стороне и образован остатками а-спиралей К, К и А.
На следующем этапе был проведен дополнительный раунд молекулярного докинга библиотек тринуклеотидов, но поиск в этом случае проводился только на найденном сайте II. В результате было найдено 570 различных расположений тринуклеотидов.
Оценивая общее распределение нуклеотидов по поверхности выбранного сайта было обнаружено, что этот участок может быть разделен на 3 зоны, расположенные вокруг ARG448 (Рис. 27).
Отмечены три зоны преимущественного расположение нуклеотидов. Раскраска поверхности белка по электростатическому потенциалу. Первая зона была образована аминокислотными остатками: Tyr426, А1а432, Lys436, Phe437, Val440 и А1а444, вторая - Leul63, Asnl64, Ilel65, Phel68, Tyr354 и Val457, третья - Lysl60, Gly445, Arg446, Arg448, Cys449 и Ile450.
Анализ распределения отдельных типов нуклеотидов по поверхности выбранного сайта показал, что в каждой зоне предпочтительно располагался определенный нуклеотид (Табл. 3).
Стоит отметить, что положений для тринуклеотида CGT (чья последовательность соответствует наиболее часто попадающим нуклеотидам в каждую зону сайта связывания) в результате молекулярного докинга найдено не было. В связи с этим соответствующий тринуклеотид был нами отдельно смоделирован для дальнейшего изучения.
Также нами были выбраны 4 тринуклеотида с лучшими значениями оценочной функции докинга. Ими оказались: GGG, TGC, AGG и GGT, со значениями: -113,6, -109,9, -106,6 и -105,46 Ккал/моль, соответственно. Для контроля было использовано еще два олигонуклеотида с плохими значениями оценочной функции: АСА (-100,0 Ккал/моль) и АСА (-94,8 Ккал/моль).
Таким образом, для дальнейшей проверки предложенного нами подхода конструирования аптамеров на примере цитохрома Р450 51А1 использовали 7 тринуклеотидов (Таблица 3): четыре олигонуклеотида с лучшими значениями оценочной функции DockScore, два - с худшими (контроль) и тринуклеотид CGT, построенный по статистическому распределению нуклеотидов.
Следующий этап нашей работы был направлен на оценку возможности использования отобранных тринуклеотидов в качестве "узнающей" части будущего аптамера.
Для всех семи выбранных олигонуклеотидов (Таблица 4) были построены соответствующие комплексы с цитохромом Р450 51А1 и проведены симуляции молекулярной динамики.
CGT В ходе симуляций структура белка оставалась стабильной. Значения среднеквадратичных отклонений аминокислотных остатков цитохрома держались в районе 1,5-2,5 ангстрем и достигали своего "плато" после двух наносекунд симуляции (Рис. 28).
Значения среднеквадратичных отклонений нуюіеотидов в ходе симуляции молекулярной динамики. Поведение двух олигонуклеотидов в ходе молекулярной динамики значительно отличалось от остальных. Среднеквадратичные отклонения тринуклеотида GGG были минимальными, и их значения составляли около двух ангстрем, что говорило о высокой стабильности комплекса. Комплекс олигонуклеотида АСА с цитохромом, напротив, был наименее стабильным. На это указывал скачок значений RMSD нуклеотидов до 8 ангстрем в первые три наносекунды симуляции, и при визуальном анализе симуляции было отмечено значительное смещение тринуклеотида АСА от его первоначального положения.
На следующем этапе были рассчитаны значения энергии связывания олигонуклеотидов с цитохромом Р450 51А1. Расчет энергии производился для комплексов с использованием метода MM-PBSA после 6 наносекунд симуляции, когда все перестройки были завершены. Результаты представлены в таблице 5.
