Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Интерполиэлектролитные комплексы 9
1.1. Образование, строение и свойства 9
1.2. Белок-полиэлектролитные комплексы 20
Глава 2. Формирование и свойства ПЭ пленок, полученных методом последовательной адсорбции полиэлектролитов (ПАП) на плоских подложках 25
2.1. Получение пленок методом ПАП 25
2.2. Структура и свойства "многослойных" ПЭ пленок 26
Глава 3. Полиэлектролитные микрокапсулы, полученные методом ПАП ..31
3.1. Формирование полиэлектролитных оболочек на поверхности коллоидных частиц 31
3.2. Образование полых полиэлектролитных микрокапсул 36
3.3. Некоторые физико-химические свойства полых ПЭ микрокапсул 40
Глава 4. Включение макромолекулярных соединений в ПЭ
микрочастицы/капсулы с применением метода ПАП 44
4.1. Мультислои макромолекул на поверхности коллоидных частиц 45
4.2. Включение макромолекул в ПЭ микрокапсул путем изменения проницаемости их оболочки 45
4.3. Покрытие кристаллов белков ПЭ оболочкой 45
4.4. Метод, основанный на преципитации вещества на поверхности коллоидной матрицы 47
4.5. Включение макромолекул в микрокапсулы, полученные на основе МФ-микрочастиц 47
4.6. Обобщение методов включения: преимущества и недостатки. Постановка задачи 49
Глава 5. Кристаллизация карбоната кальция 52
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 6. Материалы, оборудование и методы исследования 54
6.1. Материалы и реактивы 54
6.2. Оборудование 55
6.3. Методы исследования 56
6.3.1. ПЭ микрочастицы, полученные на высоленных агрегатах белка 56
а. Получение ПЭ микрочастиц 56
б. Определение содержания белка в микрочастицах и растворах 57
в. Определение эстеразной активности химотрипсина 57
г. Высвобождение белка из микрочастиц при различных рН 58
д. Изучение кинетики высвобождения белка из микрочастиц 58
е. Повторное включение белка в ПЭ микрочастицы, полностью
высвободившие белок 58
6.3.2. Белок-содержащие СаСОз микрочастицы 59
а. Получение СаСОз микрочастиц 59
б. Включение белков в СаСОз микрочастицы методом адсорбции в порах 59
в. Получение белок-содержащих СаСОз микрочастиц методом совместного осаждения 60
6.3.3. Включение белков в ПЭ микросферы "каркасного" типа 61
а. Получение "каркасных" ПЭ микросфер (ПАА/ПСС)4 61
б. Иммобилизация белков путем включения в сформированные ПЭ
микросферы 61
в. Изучение высвобождения белков из микросфер 62
6.3.4. Измерение активности ГОД 63
6.3.5. Измерение амидазной активности ХТР 63
6.3.6. Получение магнитных наночастиц Рез04 64
6.3.7. Модификация микросфер магнитными наночастицами Fe304 65
6.3.8. Получение ПЭ микросфер путем ПАП на белок-содержащих СаСОз микрочастицах 65
а. Включение белков в микросферы (ПАА/ПСС)4 65
б. Включение Asp f2 в микросферы (ПЛЛ/АЛГ)4.
Эксперименты in vivo 66
6.3.9. Белок-содержащие гелевые микросферы с ПЭ оболочкой 67
а. Иммобилизация ОВА 67
б. Модификация микросфер ПГК-ПЭГ. Изучение адсорбции БСА 68
6.3.10. Изучение стабильности комплекса ПСС-ПАА при изменении рН .68
6.3.11. Получение ПЭ и белков, меченых флуоресцентной меткой 69
6.3.12. Подготовка ДС и ДЕ для использования в работе 69
6.4. Физико-химические методы, использованные при работе с микрочастицами 70
6.4.1. Световая оптическая микроскопия 70
6.4.2. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) 70
6.4.3. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕМ) 71
6.4.4. Метод адсорбции/десорбции азота (метод Брунауэра-Эммета-Теллера) 71
6.4.5. Конфокальная флуоресцентная сканирующая микроскопия (КСФМ) 71
6.4.6. Флуоресцентная микроскопия 72
6.4.7. Микрогравиметрия 72
6.4.8. Спектроскопия координационного рассеяния (СКР) 72
6.4.9. Элементный анализ 72
6.4.10. Расчет концентрации микросфер 73
6.4.11. Измерение гидродинамического радиуса полиэлектролитов 73
6.4.12. Измерение -потенциала СаСОз микрочастиц 73
6.4.13. Лиофильное высушивание 73
6.4.14. УФ-видимая спектроскопия 74
6.4.15. Флуоресцентная спектроскопия 74
6.4.16. Рентгеноструктурный анализ широкого угла рассеяния 74
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 7. Иммобилизация ХТР путем ПАП на агрегатах белка 75
7.1. Получение, структура и свойства белок-содержащих микрочастиц ....75
7.2. Высвобождение белка из микрочастиц 80
7.3. Изучение активности иммобилизованного ХТР 85
Глава 8. Включение белков в ПЭ микросферы "каркасного" типа 86
8.1. Синтез и характеристика пористых микрочастиц из карбоната кальция .86
8.2. Получение и структура (ПАА/ПСС)4 микросфер "каркасного" типа 96
8.3. Белок-содержащие "каркасные" ПЭ микросферы 105
а. Включение белков в сформированные микросферы (ПАА/ПСС)4 105
б. Создание дополнительной ПЭ оболочки на поверхности
"каркасных" микросфер с белком 109
в. Изучение каталитической активности микросфер с ХТР в
водно-органических смесях 115
г. Модификация микросфер наночастицами БезСХ» 117
8.4. Формирование ПЭ микросфер путем ПАП на белок-содержащих СаСОз
микрочастицах 119
8.4.1. Изучение включения белков в СаСОз микрочастицы 119
а. Метод адсорбции в порах (АП) 119
б. Метод совместного осаждения (СО) 126
8.4.2. Получение белок-содержащих ПЭ микросфер 131
а. Включение белков в микросферы (ПАА/ПСС)4 131
б. Включение Asp f2 в микросферы (ПЛЛ/АЛГ)4.
Изучение иммунного ответа на микросферы с Asp f2 in vivo 134
8.5. Сравнительные характеристики методов включения белков в ПЭ микросферы "каркасного типа" 137
Глава 9. Иммобилизация белков в гелевые микросферы с ПЭ оболочкой ..138
9.1. Включение ОВА в гелевые Са-альгинатные микросферы 138
9.2. Высвобождение ОВА из Са-альгинатных микросфер 142
9.3. Модификация микросфер ПГК-ПЭГ 142
ВЫВОДЫ 146
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 148
- Образование, строение и свойства
- Получение пленок методом ПАП
- Формирование полиэлектролитных оболочек на поверхности коллоидных частиц
Введение к работе
Одним из интенсивно развивающихся направлений современной биотехнологии является иммобилизация высокомолекулярных биологически активных веществ (ВБАВ) в нано- и микрообъекты, такие как липосомы, мицеллы, микро- и нано-частицы (-капсулы, -сферы). Такого рода системы используются в различных областях промышленности (в том числе в каталитических целях) и медицины (в качестве систем направленной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных препаратов).
Традиционные методы включения ВБАВ в микрообъекты фиксированного размера и формы (сферы, капсулы) основываются на физико-химических процессах преципитации, полимеризации, коацервации и т.д. [1]. Эти методы предполагают использование органических растворителей, поверхностно-активных соединений, а также поперечно-сшивающих агентов, что может повлечь снижение биологической активности иммобилизованного препарата. Более того, в большинстве случаев, получаемые сферические микрочастицы полидисперсны. Поэтому актуальной является разработка новых методов иммобилизации ВБАВ в микрообъекты в мягких условиях.
Данная работа посвящена разработке новых подходов к включению ВБАВ (на примере белков) в полиэлектролитные микрочастицы с применением метода последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов. Этот процесс не требует сложного аппаратурного оформления и осуществляется в водных растворах, являющихся естественной средой для большинства ВБАВ. Особое внимание уделено возможности дизайна полученных микрочастиц в зависимости от цели их применения.
Образование, строение и свойства
Полимеры имеют склонность к образованию надмолекулярных структур. Известно, что даже в разбавленных растворах полимеров происходит ассоциация макромолекул. Более того, явления ассоциации наблюдаются в растворах неполярных полимеров в неполярных растворителях, в которых могут иметь место только слабые ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Указанное общее свойство полимеров обусловлено длинноцепным строением макромолекул, способных кооперативно взаимодействовать друг с другом.
Возникновение еще более устойчивых комплексов можно ожидать в случае, если макромолекулы способны образовывать водородные связи. Например, комплексы полиакриловой и полиметакриловой кислот с полиэтиленгликолем оказываются очень устойчивыми за счет водородных связей, а также гидрофобных взаимодействий в водных растворах.
Наконец, известны комплексы, в которых макромолекулы удерживаются благодаря электростатическому взаимодействию, то есть связаны прочными ионными связями. Исследованию реакций между противоположно заряженными полиэлектролитами в литературе уделено большое внимание, поскольку их изучение представляет несомненный интерес как с точки зрения моделирования процессов, протекающих в живой природе, так и с точки зрения практического использования полиэлектролитных комплексов. В дальнейшем мы будем говорить именно о таких комплексах.
Интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК) образуются в результате реакций между противоположно заряженными полиэлектролитами, протекающих в водных средах и приводящих к возникновению кооперативной системы ионных связей между противоположно заряженными звеньями. ИПЭК представляют собой новый класс веществ, которые обладают рядом уникальных свойств, связанных с природой составляющих их компонентов, степенью завершенности реакции между ними, составом растворителя и др. [2].
При взаимодействии поликислот и полиоснований в водных растворах происходит реакция нейтрализации, сопровождающаяся значительным тепловым эффектом (Рис. 1, схема 1-1). Аналогичные реакции характерны и для низкомолекулярных соединений. В то же время реакции между противоположно заряженными полиэлектролитами в солевой форме, протекающие по схеме 1-2 (Рис. 1), а также реакции, сопровождающиеся выделением протонов или гидроксил-анионов (схема 1-3 и 1-4), присущи только высокомолекулярным соединениям [3].
Образование ИПЭК с точки зрения свободной энергии электростатических взаимодействий ионных групп полиэлектролитов рассмотрено в работе [4]. Между звеньями противоположно заряженных цепей в ИПЭК существуют солевые связи, каждая из которых сравнительно слаба, но суммарная энергия всех связей в ИПЭК велика, поэтому такие комплексы крайне устойчивы. Полагают, что движущей силой процесса образования ИПЭК является выигрыш энтропии системы за счет освобождения низкомолекулярных ионов, ранее иммобилизованных в электрическом поле полиионов, превышающий уменьшение энтропии макромолекулярных цепей [5; 6].
Интервалы рН, в которых протекают интерполимерные реакции, а также области рН, где поликомплексы устойчивы, определяются константами диссоциации соответствующих поликислот и полиоснований.
Поэтому существенной характеристикой полиэлектролитов в реакциях их друг с другом является сила основания и сила кислоты, которые можно выразить через характеристические константы Кхар функциональных групп этих полимеров. В работе [5] рКхар некоторых полиэлектролитов были рассчитаны из кривых зависимости рК = рН ± lg(a/(l-a)) от а (где а-степень диссоциации), как предел рК при х=0. Значения рКхар составили: ПАК (4,8),
ПГК (4,8), ПДМАЭМ (6,2), ПВП (4,2), ПЛЛ (10,5). 10 Важным параметром, характеризующим интерполимерные реакции, является степень превращения 6, которая представляет собой долю образовавшихся межмолекулярных солевых связей от их максимально возможного числа. В реакциях между сильными полиэлектролитами степень превращения не зависит от величины рН и определяется только структурной комплементарностью реагирующих макромолекул. Такие ИПЭК устойчивы при любых значения рН. Для реакций с участием слабых, а также слабых и сильных полиэлектролитов степень превращения 0 зависит от рН среды. Как видно из Рис. 2 реакции образования ИПЭК являются кооперативными и протекают в узком интервале рН растворов.
Интересен вопрос об образовании ИПЭК в кислых и щелочных средах. Существенно, что продуктами завершенных реакций между полиэлектролитами, взятыми в эквимольных соотношениях и протекающих в отсутствие низкомолекулярных солей, являются нейтральные стехиометричные ИПЭК, строение которых не зависит от способа их получения и одинаково для одной и той же пары полиэлектролитов (Рис. 3).
Получение пленок методом ПАП
Получение "многослойных" ансамблей различного рода молекул с применением метода последовательной адсорбции было впервые предложено в 1966 году Илером [50], а позднее данный подход был развит Маллоуком [51]. В 1991 году Дехер продемонстрировал возможность использования последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов для формирование тонких полиэлектролитных пленок [52-54]. Схема адсорбции поликатиона и полианиона на отрицательно заряженной плоской подложке представлена на Рис. 9. Движущей силой данного процесса является электростатическое взаимодействие между противоположно заряженными ПЭ. Это взаимодействие обусловлено наличием некомпенсированных зарядов макромолекул ПЭ, адсорбированного на нерастворимой подложке, что связано со строением ПЭ комплекса, образующегося при контакте противоположно заряженных ПЭ. Именно за счет этого избыточного заряда и появляется возможность наносить разноименные полиэлектролиты последовательно, что приводит к формированию так называемой "многослойной" ПЭ пленки. Многократно повторяя стадии адсорбции ПЭ и удаления (отмывки) несвязавшегося ПЭ, можно получить пленки различной толщины. Так число стадий адсорбции может составлять несколько десятков и даже больше, что приводит к формированию "многослойных" ПЭ пленок толщиной в пределах микрона.
Кроме широко используемых синтетических ПЭ, в методе ПАП были применены различные полисахариды, такие как хитозан, хитозан сульфат, карбоксиметилцеллюлоза, декстран сульфат, гепарин и другие, благодаря наличию амино-, сульфо- и карбоксильной групп в их структуре [55-58]. Белки [59-61; 55; 62], а также нуклеиновые кислоты [59], [63] тоже могут быть составляющими "многослойных" ПЭ ансамблей.
Образование электростатических связей между заряженными ПЭ является не единственным типом взаимодействия, приводящим к образованию "многослойных" ПЭ пленок. Так, водородные связи [64-66] и гидрофобные взаимодействия [67] могут играть существенную роль.
Универсальный характер метода ПАП практически не ограничивает круг используемых компонентов. Основным условием является возможность образования прочного комплекса между адсорбируемыми частицами. Так, для создания "многослойных" ансамблей были использованы не только ПЭ, но и наночастицы полупроводников [68], [69], металлов [70-72] и их оксидов [73-75], супрамолекулярные комплексы металлов [76; 77], сферические частицы из SiC 2 [78-81] и латексные частицы [50; 76; 82].
Структура и свойства "многослойных" ПЭ пленок
Для формирования "многослойных" ПЭ пленок могут быть использованы различные матрицы в зависимости от метода анализа пленок или же их последующего использования. Так, ПЭ пленки, сформированные на стеклянных, кварцевых и силиконовых подложках, изучаются с помощью спектрофотометрического, рентгеновского анализа, элипсометрии, нейтронного рассеяния и т.д. [83-86]. Микропластинки из золота, используемые в микрогравиметрии, могут быть покрыты "многослойными" пленками, что дает возможность измерять массу ПЭ, адсорбированного на каждой стадии адсорбции [87; 88; 86]. Слабозаряженная поверхность матрицы из металла может быть химически модифицирована [89].
Основным вопросом, возникающим при формировании "многослойных" ПЭ ансамблей, является возможность дискриминации ПЭ пленок как обособленных слоев, то есть ламелларных структур. Данные рентгено-структурного анализа и нейтронного рассеяния для такого рода ПЭ ансамблей показали отсутствие четкой слоистой структуры [83; 90] детектируемой, к примеру, в случае чередующейся адсорбции неорганических наночастиц [91; 84; 92]. В то же время изменение знака потенциала поверхности при последовательной адсорбции противоположно заряженных ПЭ наблюдается для подавляющего множества ПЭ пар, что свидетельствует о перезарядке поверхности, то есть наличии на поверхности образующейся пленки молекул ПЭ только одного знака.
Для гибких макромолекул, способных при взаимодействии образовывать не только поверхностные контакты, но и контакты, приводящие к взаимопроникновению отдельных сегментов молекул ПЭ, может быть предложен следующий механизм адсорбции (Рис. 10).
Получение пленок методом ПАП
После получения макромолекулярных ансамблей ПЭ на плоских поверхностях, полиэлектролитные пленки были успешно получены на коллоидных частицах [118; 119]. Процесс образования ПЭ оболочки на поверхности коллоидных частиц подчиняется тем же принципам, что и на плоских подложках в случае, когда размер коллоидной частицы во много раз больше, чем размер молекул полиэлектролитов. Схема данного процесса представлена на Рис. 11, стадии А-Д. Положительно заряженные коллоидные частицы, выступающие в качестве матрицы, (А) инкубируются в растворе отрицательно заряженного ПЭ, после чего молекулы ПЭ адсорбируются на поверхности частицы (А-Б). Несвязавшиеся молекулы ПЭ удаляют (Б-В) и затем наносят ПЭ противоположного заряда (В-Г). Многократное повторение процедур нанесения полиэлектролитов приводит к формированию "многослойной" ПЭ пленки на поверхности коллоидной частицы (Д).
В качестве матриц для ПАП были использованы коллоидные частицы с диаметром от десятков нанометров [120] до десятков микрон [58; 121]. Круг использованных коллоидных частиц разнообразен и широк. Среди них латексные полистирольные (ПС-) и меламинформальдегидные (МФ-) частицы [118; 119], неорганические карбонатные микрочастицы [122], кристаллы органических красителей [123; 124], микрочастицы из полигидроксикарбоновых кислот [121], интактные клетки [125-128], белковые агрегаты [129; 130], микроагрегаты ДНК [131].
Для формирования ПЭ оболочки на коллоидных частицах методом ПАП были использованы как синтетические, так и природные полиэлектролиты. В качестве последних применялись хитозан и хитозансульфат [132; 133], протамин и декстран сульфат [134; 135], ДНК [136], а также белки [137-139]. Однако более широко используются различные комбинации синтетических полиэлектролитов. Полианионами могут выступать сильные полиэлектролиты, такие как ПСС, поли(анилинпропансульфоновая) кислота [61], а также слабые ПЭ, например, полиакриловая кислота [99]. В качестве поликатионов, в основном, используют полиамины с различным числом заместителей при атоме азота - ПАА, ПЛЛ, ПЭИ, ПДАДМА и т.д. коллоидной микрочастицы методом последовательной адсорбции ПЭ (А-Д). Удаление коллоидной матрицы приводит к формированию ПЭ микрокапсулы (Д-Е). ПЭ (-) и ПЭ (+) - отрицательно и положительно заряженные полиэлектролиты.
Основным требованием для использования двух противоположно заряженных ПЭ в качестве ПЭ пары для получения пленки методом ПАП является возможность данных ПЭ образовывать нерастворимый комплекс в условиях формирования ПЭ пленки. Вообще, круг ПЭ, используемых для получения ПЭ пленок методом ПАП, очень широк и более подробно представлен в обзоре [96].
Не только ПЭ, но и липиды [140; 141; 132] и даже неорганические наночастицы вместе с полиэлектролитами [142-144] были использованы в качестве материала для построения "многослойной" оболочки микрокапсул. Включение магнитных частиц в оболочку позволяет манипулировать микрочастицами при приложении внешнего магнитного поля [145]. Конструирование "многослойных" оболочек, с использованием белков и ферментов демонстрирует возможность применения таких структур в качестве биокаталитических систем [61; 137; 138].
Индикатором адсорбции ПЭ может служить смена знака заряда поверхности микрочастиц (электрокинетического потенциала поверхности или -потенциала) при нанесении каждого последующего противоположно заряженного полиэлектролита (Рис. 12) [118].
При последовательном нанесении полиэлектролитов на коллоидные частицы могут быть использованы два подхода [118; 119]. В первом случае берутся избыточные концентрации полиэлектролитов и после адсорбции несвязавшиеся молекулы ПЭ удаляют. Во втором случае полиэлектролиты добавляют в концентрации, достаточной для насыщения "слоя" мембраны микрокапсулы. Для определения этой концентрации в работе [118] рассчитывали зависимость интенсивности флуоресценции ПАА, меченого ФИТЦ, в супернатанте от общей концентрации добавленного ПАА-ФИТЦ (Рис. 13, А) и, таким образом, определяли количество ПАА, достаточного для образования полимерного слоя на поверхности коллоидной частицы (ПААтіп). Кроме того, минимальную необходимую концентрацию полиэлектролита можно определить, исходя из зависимости потенциала поверхности частиц от концентрации добавленного полиэлектролита (Рис. 13, Б). Выход на плато значения величины -потенциала свидетельствует об адсорбции максимально возможного количества ПЭ [118].
