Содержание к диссертации
Введение
1. Интерполиэлектролитные комплексы 9
1.1. Образование, строение и свойства 9
1.2. Белок-полиэлектролитные комплексы 20
2. Формирование и свойства ПЭ пленок, полученных методом последовательной адсорбции полиэлектролитов (ПАП) на плоских подложках 25
2.1. Получение пленок методом ПАП 25
2.2. Структура и свойства "многослойных" ПЭ пленок 26
3. Полиэлектролитные микрокапсулы, полученные методом ПАП 31
3.1. Формирование полиэлектролитных оболочек на поверхности коллоидных частиц 31
3.2. Образование полых полиэлектролитных микрокапсул 36
3.3. Некоторые физико-химические свойства полых ПЭ микрокапсул 40
4. Включение макромолекулярных соединений в ПЭ микрочастицы/капсулы с применением метода ПАП 44
4.1. Мультислои макромолекул на поверхности коллоидных частиц 45
4.2. Включение макромолекул в ПЭ микрокапсул путем изменения проницаемости их оболочки 45
4.3. Покрытие кристаллов белков ПЭ оболочкой 45
4.4. Метод, основанный на преципитации вещества на поверхности коллоидной матрицы 47
4.5. Включение макромолекул в микрокапсулы, полученные на основе МФ-микрочастиц 47
4.6. Обобщение методов включения: преимущества и недостатки.
5. Кристаллизация карбоната кальция 52
6. Материалы, оборудование и методы исследования 54
6.1. Материалы и реактивы 54
6.2. Оборудование 55
6.3. Методы исследования 56
6.3.1. ПЭ микрочастицы, полученные на высоленных агрегатах белка 56
а. Получение ПЭ микрочастиц 56
б. Определение содержания белка в микрочастицах и растворах 57
в. Определение эстеразной активности химотрипсина 57
г. Высвобождение белка из микрочастиц при различных рН 58
д. Изучение кинетики высвобождения белка из микрочастиц 58
е. Повторное включение белка в ПЭ микрочастицы, полностью высвободившие белок 58
6.3.2. TITLE3 Белок-сод ержащие СаС03 микрочастицы TITLE23 59
а. Получение СаСОз микрочастиц 59
б. Включение белков в СаСОз микрочастицы методом адсорбции в порах 59
в. Получение белок-содержащих СаС03 микрочастиц методом совместного осаждения 60
6.3.3. Включение белков в ПЭ микросферы "каркасного" типа 61
а. Получение "каркасных" ПЭ микросфер (ПАА/ПСС)4 61
б. Иммобилизация белков путем включения в сформированные ПЭ микросферы 61
в. Изучение высвобождения белков из микросфер 62
6.3.4. Измерение активности ГОД 63
6.3.5. Измерение амидазной активности ХТР 63
6.3.6. Получение магнитных ианочастиц Fe304 64
6.3.7. Модификация микросфер магнитными наночастицами Fe304 65
6.3.8. Получение ПЭ микросфер путем ПАП на белок-содержащих СаСОз микрочастицах 65
а. Включение белков в микросферы (ПАА/ПСС)4 65
б. Включение Asp fl в микросферы (ГО1Л/АЛГ)4. Эксперименты in vivo 66
6.3.9. Белок-содержащие гелевые микросферы с ПЭ оболочкой 67
а. Иммобилизация ОБА 67
б. Модификация микросфер ПГК-ПЭГ. Изучение адсорбции БСА 68
6.3.10. Изучение стабильности комплекса ПСС-ПАА при изменении рН .68
6.3.11. Получение ПЭ и белков, меченых флуоресцентной меткой 69
6.3.12. Подготовка ДС и ДЕ для использования в работе 69
6.4. Физико-химические методы, использованные при работе с микрочастицами 70
6.4.1. Световая оптическая микроскопия 70
6.4.2. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) 70
6.4.3. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕМ) 71
6.4.4. Метод адсорбции/десорбции азота (метод Брунауэра-Эммета-Теллера) 71
6.4.5. Конфокальная флуоресцентная сканирующая микроскопия (КСФМ) 71
6.4.6. Флуоресцентная микроскопия 72
6.4.7. Микрогравиметрия 72
6.4.8. Спектроскопия координационного рассеяния (СКР) 72
6.4.9. Элементный анализ 72
6.4.10. Расчет концентрации микросфер 73
6.4.11. Измерение гидродинамического радиуса полиэлектролитов 73
6.4.12. Измерение ^-потенциала СаСОз микрочастиц 73
6.4.13. Лиофильное высушивание 73
6.4.14. УФ-видимая спектроскопия 74
6.4.15. Флуоресцентная спектроскопия 74
6.4.16. Рептгеноструктурный анализ широкого угла рассеяния 74
7. Иммобилизация ХТР путем ПАП на агрегатах белка 75
7.1. Получение, структура и свойства белок-содержащих микрочастиц 75
7.2. Высвобождение белка из микрочастиц 80
7.3. Изучение активности иммобилизованного ХТР 85
8. Включение белков в ПЭ микросферы "каркасного1' типа 86
8.1. Синтез и характеристика пористых микрочастиц из карбоната кальция .86
8.2. Получение и структура (ПАА/ПСС)4 микросфер "каркасного" типа 96
8.3. Белок-содержащие "каркасные" ПЭ микросферы 105
а. Включение белков в сформированные микросферы (ПАА/ПСС)4 105
б. Создание дополнительной ПЭ оболочки на поверхности "каркасных" микросфер с белком 109
в. Изучение каталитической активности микросфер с ХТР в водно-органических смесях 115
г. Модификация микросфер наночастицами VQ^OA 117
8.4. Формирование ПЭ микросфер путем ПАП на белок-содержащих СаСОз микрочастицах 119
8.4.1. Изучение включения белков в СаСОз микрочастицы 119
а. Метод адсорбции в порах (АП) 119
б. Метод совместного осаждения (СО) 126
8.4.2. Получение белок-содержащих ПЭ микросфер 131
а. Включение белков в микросферы (ПАА/ПСС)4 131
б. Включение Asp f2 в микросферы (ПЛЛ/АЛГ)4. Изучение иммунного ответа на микросферы с Asp Ї2 in vivo 134
8.5. Сравнительные характеристики методов включения белков в ПЭ микросферы "каркасного типа" 137
9. Иммобилизация белков в гелевые микросферы с ПЭ оболочкой 138
9.1. Включение ОВА в гелевые Са-альгинатные микросферы 138
9.2. Высвобождение ОВА из Са-альгинатных микросфер 142
9.3. Модификация микросфер ПГК-ПЭГ 142
Выводы 146
- Белок-полиэлектролитные комплексы
- Некоторые физико-химические свойства полых ПЭ микрокапсул
- Высвобождение белка из микрочастиц
Введение к работе
Одним из интенсивно развивающихся направлений современной биотехнологии является иммобилизация высокомолекулярных биологически активных веществ (ВБАВ) в нано- и микрообъекты, такие как липосомы, мицеллы, микро- и нано-частицы (-капсулы, -сферы). Такого рода системы используются в различных областях промышленности (в том числе в каталитических целях) и медицины (в качестве систем направленной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных препаратов).
Традиционные методы включения ВБАВ в микрообъекты фиксированного размера и формы (сферы, капсулы) основываются на физико-химических процессах преципитации, полимеризации, коацервации и т.д. [I]. Эти методы предполагают использование органических растворителей, поверхностно-активных соединений, а также поперечно-сшивающих агентов, что может повлечь снижение биологической активности иммобилизованного препарата. Более того, в большинстве случаев, получаемые сферические микрочастицы полидисперсны. Поэтому актуальной является разработка новых методов иммобилизации ВБАВ в микрообъекты в мягких условиях.
Данная работа посвящена разработке новых подходов к включению ВБАВ (на примере белков) в полиэлектролитные микрочастицы с применением метода последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов. Этот процесс не требует сложного аппаратурного оформления и осуществляется в водных растворах, являющихся естественной средой для большинства ВБАВ. Особое внимание уделено возможности дизайна полученных микрочастиц в зависимости от цели их применения.
Белок-полиэлектролитные комплексы
Белковые молекулы являются полиамфолитами, так как входящие в их состав аминокислоты могут быть заряжены как положительно (лизин, аргинин, гистидин), так и отрицательно (аспарагиновая и глутаминовая кислоты). Поэтому на поверхности белков в нейтральных средах присутствуют как положительные, так и отрицательные заряды. В связи с такой особенностью строения белковых молекул, с ними могут взаимодействовать соединения, содержащие ионогенные группы, в том числе и полиэлектролиты. Результатом такого взаимодействия является образование нековалентных белок-полиэлектролитных комплексов (БПЭК). БПЭК существуют в основном за счет солевых связей и отличаются высокой прочностью, благодаря кооперативному характеру взаимодействия [23; 24]. БПЭК является частным случаем более широкого круга комплексов полимерных молекул, содержащих противоположно заряженные группы. Строение и свойства БПЭК и ИПЭК во многом сходны. Для белков, в отличие от регулярных ПЭ, образование нерастворимых стехиометричных комплексов малохарактерно. Это объясняется пространственной раздел енно стью зарядов на белке. Поэтому для их полной компенсации необходим низкомолекулярный электролит или избыток высокомолекулярного ПЭ, который обычно характеризуется высокой плотностью заряда. Кроме того, белки являются полиамфолитами, поэтому велика вероятность того, что на поверхности БПЭК будут присутствовать нескомпенсированные заряды, обеспечивающие ему растворимость. Ярким примером образования БПЭК является взаимодействие бычьего сывороточного альбумина (БСА) с различными полиэлектролитами [24; 25], Показано, что при взаимодействии БСА с ПВП при рН 7,0, то есть при рН рІБСА (рівсл 4,9), когда компоненты заряжены разноименно, в зависимости от соотношения белок:полиэлектролит могут образовываться как растворимые, так и нерастворимые комплексы. При этом связывание белка происходит кооперативно, а его распределение на макромолекулах поли катион а неравномерное. Отмечается, что в присутствии небольшого количества соли при взаимодействии белков с полиэлектролитами, когда они заряжены разноименно, всегда образуются равновесные комплексы, характеризующиеся определенными составами, значениями молекулярных масс и размером частиц.
Важным фактором стабильности БПЭК является величина плотности заряда полиэлектролита. Так увеличение плотности заряда в ряду пекти н альгинат декстрансульфат сопровождается возрастанием устойчивости комплексов, образованных этими ПЭ и химотрипсином [26]. Стабильность БПЭК может быть обусловлена гидрофобными взаимодействиями или водородными связями, возникающими вследствие неионных взаимодействий между молекулами белка и неполярными участками полиэлектролита. Благодаря этим взаимодействиям образование БПЭК может происходить даже при таких значениях рН, при которых знаки заряда белковых глобул и цепей полиэлектролитов совпадают. Образование поликомплексов в условиях, когда компоненты заряжены одноименно, наблюдали при взаимодействии БСА с ПАК, ПМАК и ПСС [25]. В этих условиях образуются растворимые комплексы, в которых связывание белка с полиэлектролитом происходит кекооперативно. Это неравновесные соединения, в которых молекулы белка распределяются по цепям полиэлектролита равномерно. Такие комплексы в растворе находятся в конформации статистического клубка [25]. Белок может быть нековалентно связан не только с полиэлектролитом, но и с интерполиэлектролитным комплексом. Так в работе [27] проводилось включение амилоглюкозидазы в комплекс ПСС-ПДАДМА. Отмечается высокое сохранение активности иммобилизованного препарата. Такого рода БПЭК находят широкое применение в виде композитных гелей, пленок, гранул и т.д. при использовании в медицине [28] и биотехнологии [28; 29]. Как правило, глобулярные белки, взаимодействуя с противоположно заряженной молекулой полиэлектролита, образуют "палочкообразные" структуры (Рис. 8), состоящие из молекулы полиэлектролита и одной или нескольких молекул белка [24; 25; 30]. Как для ИПЭК, для БПЭК, существует характеристический состав, который не зависит от количеств белка и полиэлектролита в растворе [29]. где Б - белок; ПЭ-полиэлектролит; СБПЭК - стехиометричный БПЭК; БПЭКхар - БПЭК характеристического состава. Состав и свойства БПЭК зависят от таких параметров как рН, ионная сила, количество зарядов на поверхности белка и степень полимеризации полиэлектролита. При изменении рН меняется количество зарядов на поверхности белковой глобулы, что приводит к изменению числа межмолекулярных контактов между белком и полиэлектролитом, в результате чего меняется характеристический состав комплекса. Наличие в системе низкомолекулярного электролита оказывает влияние на БПЭК. При увеличении ионной силы низкомолекуляный электролит начинает конкурировать с полиэлектролитом за солевые связи с белком, что приводит к ослаблению связи белок-полиэлектролит.
При низкой ионной силе для БПЭК, как и для ИПЭК наблюдается образование неравновесного комплекса. Для того, чтобы образовался равновесный БПЭК, необходимо добавлять небольшое количество соли в растворы полиэлектролита и белка. При высокой концентрации соли происходит полное разрушение комплекса белка с полиэлектролитом, а сильное обессоливание системы приводит к электростатической дестабилизации частиц БПЭК. БПЭК, подобно ИПЭК, вступают в реакции белок-полиэлектролитного замещения. При этом наблюдаются такие же закономерности: преимущественное образование комплекса белка с более высокомолекулярным полиэлектролитом и увеличение скорости реакции замещения в присутствии низкомолекулярного электролита. В литературе накоплен обширный материал о влиянии полиэлектролита на белок при их комплексообразовании. В ряде работ [30-34] говорится о том, что взаимодействие белков и ферментов с полиэлектролитами, как природными (полисахариды), так и синтетическими, приводит к повышению их стабильности - устойчивости по отношению к изменению рН раствора, температуры, диэлектрической проницаемости среды и т.д. Имеются также данные, свидетельствующие об обратном. К примеру, известно, что образование комплексов таких белков как гемоглобин, лизоцим, цитохром С с карбоксиметилцеллюлозой приводит к уменьшению устойчивости белков к тепловой денатурации [25]. В работах [30; 31] показано, что взаимодействие белков и ферментов с полиэлектролитами может приводить к деформации их вторичной и третичной структуры и к изменению их активности. Образование БПЭК подавляет межбелковую агрегацию. В то же время отмечаются случаи отсутствия существенных изменений вторичной и третичной структуры и физиологической активности белков и ферментов в полиэлектролитных комплексах [25]. Таким образом, практически невозможно обобщение фактов такого рода и предсказание на их основе функциональных свойств природных полиэлектролитов (белков и ферментов), связанных в такие комплексы. В литературе представлено множество работ по взаимодействию белков с полиэлектролитами. В обзоре [35] описано взаимодействию белков не только с ПЭ, но и с ПЭ комплексами. На данный момент такому взаимодействию посвещено немного работ. Включение белков в ПЭ комплексы [36-42] является перспективным методом, альтернативным широко применяемой иммобилизации белков в полимерные гидрогели [43; 44]. Включением в ПЭ комплексы удается повысить стабильность белков, что отмечается во многих работах [45-48], контролировать высвобождение белка [49], а также разделять смеси различных белков. Описанные в литературе экспериментальные данные позволяют констатировать, что функциональные свойства белков и ферментов, иммобилизованных на полиэлектролитах, зависят от химической природы и строения как белка, так и полиэлектролитов, знака и величины их зарядов, состава полиэлектролитного комплекса, а также значений рН и ионной силы окружающей среды.
Некоторые физико-химические свойства полых ПЭ микрокапсул
Среди физико-химических свойств микрокапсул рассмотрим механические свойства капсул и их поведение в растворах при изменении внешних условий, таких как рН, ионная сила, температура и свойства растворителя. Оболочка полой микрокапсулы имеет размер на несколько порядков меньше, чем диаметр микрокапсулы. Вклад одного "слоя" ПЭ в оболочку капсулы составляет несколько нанометров, тогда как капсула имеет диаметер несколько микрон. Так, ПЭ микрокапсулу можно представить как воздушный шарик, с очень тонкой и легко деформируемой оболочкой. Деформация и разрушение микрокапсул могут быть вызваны существенным повышением осмотического давления в процессе получения самой капсулы при растворении коллоидного ядра, покрытого ПЭ пленкой. При получении микрокапсул (ПСС/ПДАДМА)5 на МФ-частицах наблюдается увеличение размера капсул до 5,5 мкм по сравнению с размером исходных МФ-частиц (3,8 мкм) [153]. Высвобождение продуктов гидролиза МФ-частиц является причиной повышения осмотического давления и увеличения размера капсул. При уменьшении диаметра исходных МФ-частиц наблюдается повышение числа недеформированных микрокапсул в силу меньшего осмотического давления в капсулах меньшего размера [153]. Схожая тенденция наблюдалась при получении капсул на МФ-частицах с использованием других ПЭ пар [147; 134]. В работе [153] показано, что в процессе растворения МФ-частиц часть капсул деформируется, а также наблюдается разрушение ПЭ оболочки. Увеличение числа ПЭ слоев и увеличение размера исходных МФ-частиц приводит к существенному увеличению числа поврежденных микрокапсул. В присутствии высокомолекулярных веществ, не способных диффундировать через оболочку капсулы, например ПЭ, полые капсулы деформируются [153]. На Рис. 17 представлены фотографии (КСФМ) капсул (ПСС/ПДАДМА)5 в присутствии различных концентраций ПСС (70 кДа). ПСС не проникает внутрь капсул, в результате чего создается избыточное осмотическое давление. Концентрация ПСС, приводящая к резкому увеличению числа деформированных капсул составила 2,6 % (Рис. 17). Форма капсул изменяется при деформации, что легко может быть зафиксированно оптической или флуоресцентной конфокальной микроскопией (Рис. 17). ПЭ пара, используемая для получения микрокапсул, влияет на эластичность оболочки, что, безусловно, отражается на интактности капсул как в процессе их получения при растворении МФ-частиц, так и в присутствии ПСС [153].
Критическое давление (давление при котором происходит деформация микрокапсул) прямо пропорционально модулю эластичности (р.), квадрату толщины оболочки (8) и обратно пропорционально радиусу микрокапсулы (г): Ркр = 4д(5/г)2. Модуль эластичности для ПЭ микрокапсул составляет величину в сотни МПа. При этом разница в модуле эластичности для микрокапсул, полученных при использовании ПСС/ПАА и ПСС/ПДАДМА, составляет 5-6 раз [153]. Молекулярная масса ПЭ также оказывает влияние на эту величину [153]. Изменение рН среды может влиять на состояние ПЭ комплекса, из которого состоит оболочка микрокапсулы. В случае, если один полиэлектролит (или оба ПЭ) является слабым, структура и, как следствие, проницаемость оболочки микрокапсулы зависят от рН. Важной характеристикой микрокапсулы является проницаемость ее оболочки. В работе [154] изучалось влияние рН на проницаемость капсул (ПСС/ПАА)4. Показано, что при рН ниже 6,0 капсулы находятся в открытом состоянии, имея нарушенное строение оболочки, которая, в результате этого, может пропускать высокомолекулярные соединения - к примеру декстран (м.м. 77 кДа). При рН больше 8,0 оболочка имеет упорядочную структуру и непроницаема для высокомолекулярных соединений. При этом реализуется закрытое состояние. В интервале рН между 6,0 и 8,0 присутствуют капсулы, находящиеся как в открытом, так и в закрытом состояниях. Можно предположить, что проницаемость напрямую связана с наличием дефектов в структуре ПЭ оболочки. Эти дефекты образованы в результате стерических затруднений при образовании ПЭ комплекса между ПСС и ПАА. Электростатическое отталкивание между "свободными" (несвязанными с группами другого ПЭ) заряженными группами в цепи ПЭ способствует образованию дефектов. При повышении рН заряд на ПАА падает, что приводит к меньшему отталкиванию между "свободными" аминогруппами ПАА, увеличению подвижности участков ПАА и, как следствие, закрытию дефектного участка. Дополнительно адсорбированные на микрокапсулах ПЭ слои могут закрыть образовавшиеся дефекты [155]. Следует отметить, что присутствие агентов, необратимо нарушающих целостность "многослойной" ПЭ оболочки, может приводить к образованию существенных дефектов в структуре оболочки, в результате чего капсулы становятся проницаемыми для макромолекул при любых рН [140; 126], Изменение ионной силы раствора также влияет на структуру ПЭ комплекса, как материала оболочки микрокапсулы. Изменение ионной силы приводят к обратимому процессу образования и зарастания дефектов в ПЭ оболочке, что, по-видимому, связано с механизмом, предложенным выше. В работе [156] показано, что с увеличением ионной силы раствора, проницаемость мнкрокапсул увеличивается. Выдерживание микрокапсул при повышенной температуре может приводить к интересному явлению - изменению размера частиц [156]. При этом микрокапсулы (ПСС/ПДАДМА)І, полученнные на основе МФ-частиц при нагревании (40 С, 2 часа) увеличивались в диаметре от 5,5 до 7,5 микрон. Обратный эффект происходил с микрокапсулами (ПСС/ПАА)5, полученными на тех же матрицах. В работе [156] обсуждаются возможные причины такого поведения микрокапсул.
Авторы предполагают, что изменение числа ионных контактов в ПЭ комплексе, из которого состоит оболочка капсул, при изменении температуры приводит к реорганизации структуры комплекса. Меняется степень гидротации ПЭ, оболочка становится более рыхлой или же более плотной, что приводит к изменению протяженности ПЭ оболочки, и, как следствие, диаметра микрокапсулы. Изменение диэлектрической проницаемости среды при перемещении капсул (ПСС/ПАА)э в органический растворитель (спирты и насыщенные углеводороды) не приводило к разрушению микрокапсул [157]. Более того, некоторые микрокапсулы получают при удалении матрицы, покрытой ПЭ оболочкой, в органических растворителях (этанол, хлороформ) [123]. В работе [157] продемонстрирована возможность удерживания органического растворителя внутри капсулы. Возможно, стабильность ПЭ микрокапсул в водных и органических средах обусловлена наличием в ПЭ комплексе ПСС-ПАА как гидрофильных (заряженные группы ПЭ), так и гидрофобных (углеводородный остов) составляющих. Включение ВБАВ (белки, пептиды и т.д.) в микрочастицы сферической формы (м/с, м/к) представляет важность с точки зрения промышленного использования, а также для применения в медицине и фармакологии. Под микрообъектами будем подразумевать частицы, имеющие размер от 1 до десятков микрон. Благодаря маленьким размерам, микрочастицы обладают большой поверхностью для контакта с внешней средой, что характеризует их как потенциальные эффективные катализаторы, системы для разделения смесей различных компонентов и т.д. Микросферы и микрокапсулы с включенным ВБАВ находят применение в медицине и фармакологии в качестве систем доставки включенных компонентов [158], причем способ доставки в первую очередь определяется размером частиц [1]. Анализ литературы показал, что в качестве полимерных микросистем доставки наиболее широко используются микросферы из полигидроксикарбоновых кислот, а также микрочастицы, полученные эмульсионными методами с применением поверхностно активных компонентов и сшивающих агентов или с помощью специальных механических методов распыления [159-161; 158; 162], Зачастую условия получения микрочастиц приводят к инактивации ВБАВ [163], более того в большинстве случаев, получаемые микрочастицы полидисперсны, Поэтому получение микрочастиц контролируемого размера и разработка новых методов включения ВБАВ в водной среде без дополнительных агентов представляет непосредственный интерес. Техника ПАП на коллоидных микрочастицах, приводящяя к формированию ПЭ микрокапсул, является перспективной для включения высокомолекулярных соединений в такого рода структуры. В данной главе представлены методы, предложенные в литературе для включения макромолекул, в том числе ВБАВ, в ПЭ микрочастицы, полученные методом ПАП.
Белок-сод ержащие СаС03 микрочастицы
Эквивалентный объем (5-15 мл) 0,1-0,6 М водного раствора Na2C03 быстро приливали при перемешивании (400-900 об/мин) к раствору СаОг той же концентрации (водный раствор или 80 мМ ТРИС-буфер, рН 8,0). После некоторого времени перемешивания (10-120 сек), суспензию образовавшихся частиц оставляли на 5-7 минут до полной кристаллизации карбоната кальция. Далее осадок СаСОз промывали 50 мл воды или 80 мМ ТРИС-буфера, рН 8,0, центрифугировали и удаляли супернатант. Отмывку повторяли 3 раза. Осадок распределяли тонким слоем на чашку Петри и сушили 1,5 часа при 50-60 С в сушильном шкафу. Сухие микрочастицы СаСОз хранили в закупоренной емкости при комнатной температуре. Для изучения рН-зависимой адсорбции белков в СаСОз микрочастицы (диаметр частиц 4,8 микрон) смешивали эквивалентные объемы суспензии микрочастиц (120-300 мг/мл, рН в суспензии доводили до значения 7-10 добавлением НС1 при интенсивном перемешивании) и растворов белков (0-2,4 мг/мл) с тем же рН (рН доводили HCl/NaOH). После инкубации на качалке в течение часа, микрочастицы осаждали центрифугированием (200 g, 5 мин), супернатант отделяли и анализировали. Частицы промывали дважды раствором с тем же значением рН (объем суспензии частиц оставался неизменным), используя центрифугирование (200 g, 5 мин)/ресуспендирование. Частицы с включенным ЛАК (рН при включении 7,0) также промывали раствором с рН 10. Количество адсорбированного и вышедшего при промывке белка рассчитывали при сравнении оптической плотности исходных растворов белков и растворов супернатантов (X = 280 нм). Для включения белков в СаСОз микрочастицы с целью получения белок-содержащих микросфер (микрокапсул) использовали следующую процедуру. 20-40 мг СаСОз микрочастиц диаметром 4,8 микрон суспендировали в 2 мл раствора белка (4-6 мг/мл) в соответствующем буфере. После инкубации на качалке в течение часа, микрочастицы осаждали центрифугированием (200 g, 5 мин) и отделяли супернатант.
Далее частицы промывали дважды тем же буфером (1,5 мл), используя центрифугирование (200 g, 5 мин)/ресуспендирование. в. Получение белок-содсржащих СаСОз микрочастиц методом совместного осаждения 2,5 мл 1 М раствора СаСЬ в 80 мМ ТРИС-буфер, рН 8,0 смешивали с 5 мл свежеприготовленного раствора белка с концентрацией 1-10 мг/мл (ОБА, ЛАК, ХТР, ЛИЗ) в том же буфере. К смеси, перемешиваемой на магнитной мешалке (650 об/мин), быстро добавляли 7,5 мл 0,33 М водного раствора Ыа2СОз. После 30 сек перемешивания, суспензию образовавшихся частиц оставляли на 5-7 минут. Осадок частиц центрифугировали (200 g, 3 мин), супернатант отделяли, добавляли 15 мл 40 мМ ТРИС-буфера, рН 8,0 и перемешивали суспензию частиц 20 мин при 250-350 об/мин. Процедуру промывки частиц повторяли 3 раза. Количество адсорбированного и вышедшего при промывке белка рассчитывали при сравнении абсорбции (Х=280 им) исходных растворов белков и растворов супер натантов, отобранных при осаждении микрочастиц (в качестве контроля использовали растворы 80 и 40 мМ ТРИС-буфера, рН 8,0, соответственно). При необходимости анализируемые растворы были разбавлены буфером до получения значения оптической плотности в пределах 0,15-0,85. Содержание белка в полученных частицах рассчитывали как отношение массы включенного белка к массе частиц. В соответствии с вышеописанной методикой, были получены СаСОэ микрочастицы, содержащие ОБА, при времени перемешивания исходных растворов (СаСЬ + ОВА и Ыа2СОз) в течение 15 и 45 секунд. а. Получение "каркасных" ПЭ микросфер (ПАА/ПСС)4 ПЭ микросферы "каркасного" типа получали путем последовательной адсорбции противоположно заряженных ПЭ на СаСОз микрочастицах, за которой следовало растворение матрицы из СаСОз в ЭДТА. СаСОз микрочастицы ресуспендировали в водном или буферном (30 мМ ТРИС-буфер, рН 8,0) растворе ПЭ (2-4 мг/мл), содержащем 0,5 М NaCl (концентрация частиц 2-3 весовых %). Микрочастицы инкубировали при интенсивном перемешивании на шейкере (300-400 об/мин) в течение 15 минут. Затем частицы промывали от не связавшегося полиэлектролита. Для этого их центрифугировали 3-5 минут при 100-200 g. Супернатант отделяли, и к осадку добавляли тот же объем воды/буфера в 0,5 М NaCl. Процедуру промывки повторяли 3 раза. Далее проводили нанесение противоположно заряженного ПЭ в тех же условиях. При агрегации частиц между собой в процессе адсорбции ПЭ, суспензию микрочастиц подвергали обработке ультразвуком (максимальная мощность) в течение 1-3 сек. После необходимого числа стадий адсорбции ПЭ, микрочастицы ресуспендировали в эквивалентном или большем объеме 0,2 М раствора ЭДТА, рН 7,2. Через 20 мин инкубации на шейкере (300-400 об/мин), образующиеся после удаления карбонатной матрицы ПЭ микросферы осаждали центрифугированием (8-10 мин, 700-1200 g), и удаляли супернатант. К осадку добавляли новую порцию ЭДТА. После трех процедур обработки ЭДТА, микросферы промывали в воде 3 раза (время инкубации 3-5 минут) и хранили в виде суспензии или в лиофильно высушенном состоянии при 4 С. б. Иммобилизация белков путем включения в сформированные ПЭ микросферы 0,4 мл суспензии ПЭ микросфер (ПАА/ПСС) полученных как описано в предыдущем разделе, в 30 мМ универсальном буфере, содержащем 150 мМ NaCl, рН 3,5,7,9, (концентрация частиц 1,14 108 частиц/мл) были смешаны с эквивалентным объемом раствора белков (ГОД - 0,53 мг/мл или ХТР - 0,30 мг/мл) в том же буфере.
После инкубации на шейкере в течение 1 часа, микросферы осаждали центрифугированием (2500 g, 6 мин) и отделяли супернатант. Осадок промыли дважды раствором универсального буфера с тем же значением рН, каждый раз доводя объем суспензии до 0,8 мл и инкубируя микросферы в буфере в течение 15 минут. Оптическая плотность в растворах супернатантов была определена при длине волны X = 280 нм. При необходимости растворы были разбавлены соответствующим буфером до получения значения оптической плотности раствора в пределах 0,15-0,85. Количество адсорбированного и вышедшего при промывке белка было определено из отношения измеренных оптических плотностей. Аналогичным образом проводили включение белков в ПЭ м/с (ПАА/ПСС)4ПЛА. Содержание белка в микросферах рассчитывали как отношение количества включенного белка к массе носителя - ПЭ микросфер с белком. Массу микросфер с белком определяли взвешиванием лиофильно высушенного образца белок-содержащих микросфер. Эффективность включения белка определяли как отношение количества белка в суспензии ПЭ микросфер к количеству белка, взятого для включения. Для модификации микросфер с белком путем формирования на поверхности микросфер ПЭ оболочки, проводили стадии адсорбции ДЕ, ДС, ПСС и ПА А на ХТР(ГОД)-содержащих микросферах (ПАА/ПСС)4 и (ПАА/ПСС)4ПАА. При этом осаждение м/с проводили в течение 6-8 мин (700-1200 g), а ПЭ (2 мл, 2-3 мг/мл) наносили в 30 мМ универсальном буфере, содержащем 150 мМ NaCl. рН буфера был равен 5,0 и 7,0 для м/с с ХТР и ГОД, соответственно. Конечные белок-содержащие микросферы были получены в последовательности (ПААЛТССУХТР-ДЕ-(ПСС/ПАА)2ПСС и (ПАА/ПСС)4ПАА-ГОД-ДС-(ПАА/ПСС)2. в. Изучение высвобождения белков из микросфер Для изучения высвобождения белков (ХТР и ГОД, меченых флуоресцентной меткой) после включения в ПЭ микросферы при определенном рН, микросферы с белком осаждали (800-1200 g, 7-10 мин) и к осадку добавляли раствор (обычно 0,5-2,0 мл) буфера с соответствующим значением рН. После инкубации микросферы осаждали (8000-10000 g, 3-5 мин), добавляли к пробе супернатанта суспензию микросфер без белка с тем же количеством частиц, что исходная суспензия микросфер с включенным белком. Далее добавляли 2,5-3,0 мл 0,5-1,0 М фосфатного буфера (рН 7,4) и прописывали спектр флуоресценции. Пробу микросфер с белком растворяли в 0,1 М NaOH, также добавляли фосфатный буфер и измеряли флуоресценцию.
Высвобождение белка из микрочастиц
Исследование влияния рН на высвобождение ХТР из микрочастиц показало, что высвобождение белка наблюдается при увеличении рН среды (Рис. 23, 24). В интервале рН 3-11 микрочастицы не растворяются, так как комплекс ПСС-ПАА в этих условиях находится в нерастворимом состоянии. При рН 12 и выше микрочастицы растворяются. Изучение стабильности стехиометрического комплекса ПСС-ПАА было проведено в соответствии с методикой, использованной в работе [в] для титрования ПЭ комплексов, Из данных потенциометрического титрования ПАА и комплекса ПСС-ПАА (Рис. 25А) была получена зависимость доли образовавшихся межмолекулярных ионных связей в комплексе от их максимального числа (Э) от рН (Рис. 25Б). Учитывая, что разрушение ионных связей ПЭК происходит в узком диапазоне рН (Глава 2.1), можно сделать вывод, что ослабление ионных взаимодействий в комплексе ПСС-ПАА происходит в интервале рН от 10-11. При рН более 11,5 комплекс ПСС-ПАА растворяется. Так, условия стабильности микрочастиц с ХТР в водной среде находятся в соответствии со стабильностью стехиометрического комплекса ПСС-ПАА. Таким образом, высвобождение белка из микрочастиц обусловлено изменением поверхностного заряда молекул ХТР, что приводит к ослаблению взаимодействия со свободными (не связанными ионными контактами) заряженными группами ПСС и ПАА. Депротонирование свободных (несвязанных с сульфо-группами ПСС) аминогрупп ПАА при рН 8,0 (рКа ПАА около 8) также может сказываться на взаимодействии ХТР с ПАА в микрочастицах. ПСС остается ионизованным во всем интервале рН. С увеличением числа стадий ПАП от 3 до 11 профиль высвобождения белка смещается в щелочную область (Рис. 23). Число стадий ПАП оказывает непосредственное влияние на кинетику высвобождения белка из микрочастиц. Скорость выхода белка падает с увеличением числа ПАП от 1 до 11 (Рис, 24), По-видимому, обе зависимости обусловлены дополнительным связыванием белка с полиэлектролитами при увеличении числа стадий ПАП, когда структура микрочастиц стабилизируется сеткой из полиэлектролитного комплекса, препятствующей высвобождению белка. При рН 10 и 11 уже через 1 час инкубации наблюдается практически полное высвобождение белка из микрочастиц (3 и 5 ПАП, Рис. 23).
То же происходит через несколько часов (5-6 часов) в среде ТРИС-буфера с рЫ 8,0 (Рис. 24). После суток инкубации микрочастиц (11 ПАП) при рН 8,0 (ТРИС-буфер) около 40 % белка остается в частицах. рН-профиль высвобождения белка из микрочастиц (11 ПАП) сильно сдвинут в щелочную область по сравнению с профилями, полученными для микрочастиц (1, 3 и 5 ПАП). Эти данные свидетельствуют о существенном усилении связывания белка с микрочастицами при увеличении числа ПАП. Интересной особенностью является способность микрочастиц реагировать на поочередную смену рН от 3, когда белок не выходит из микрочастиц, до 8, когда наблюдается высвобождение ХТР (Рис. 26). При выдерживании микрочастиц (11 стадий ПАП) в течение 1 ч (рН 8,0) в раствор переходит 18 % белка. При последующем помещении частиц в среду с рН 3,0 за то же время в растворе оказывается около 3 % белка, т.е. высвобождение белка приостанавливается. В результате повторения данных операций наблюдается ступенчатое высвобождение белка (Рис. 26). Таким образом, "утечка" белка является обратимым процессом, зависящим от рН. Обратимое связывание белка с микрочастицами можно использовать для накопления белка в микрочастицах. Так, нами была показана возможность включения ХТР в микрочастицы, освободившиеся от белка ("пустые" ПЭ м/ч, 92 % белка вышло после многократной промывки при рН 8,0) после инкубации "пустых" частиц в растворе белка (3 и 10 мг/мл) при рН 8,0 и дальнейшей смене рН до 3,0 (Рис. 27). При этом белок был захвачен в микрочастицы и его содержание может достигать 43 % относительно белка, содержащегося в частицах изначально. То есть удалось "вернуть" около половины белка, включенного в микрочастицы. После высаливания и солюбилизации (] мМ HCI) ХТР практически полностью сохраняет активность (86±9 % по сравнению с нативным ХТР). Однако, после первой стадии адсорбции ПСС и растворения полученных частиц, активность ХТР значительно снизилась и составила 17±3 %. Активность иммобилизованного в ПЭ микрочастицах белка (5 ПАП) составила еще меньшую величину (5±3 %). Очевидно, что именно образование комплекса ХТР с ПЭ приводит с существенному снижению ферментативной активности иммобилизованного препарата. Мы полагаем, что падение активности может быть связано со следующими факторами: а) стерические затруднения при дифузии субстрата к молекулам белка; б) высокая локальная концентрация ХТР в частицах приводит к конверсии субстрата лишь частью (вблизи поверхности частиц) молекул фермента; в) измененная при агрегировании (высаливание ХТР) конформация молекул фермента фиксируется при образовании белок-ПЭ комплекса в процессе ПАП (уже на стадии обработки агрегатов белка ПСС). После включения белка из раствора (20 мг/мл ХТР) в "пустые" микрочастицы (Рис. 27), активность включенного ХТР существенно повысилась и оказалась равной 88+13 %. При таком включении вышеупомянутые факторы не проявляются. Вообще, комплексообразование ферментов с ПЭ может снизить активность или не оказывать влияния (см. Глава 1.2), которое зависит от природы реагирующих веществ и условий. Так, авторы работы [129] по иммобилизации лактатдегидрогеназы в сетку ПЭ комплекса, полученную путем ПАП (ПСС и ПАА) на агрегатах белка, отмечают семикратное падение активности иммобилизованного фермента.
Таким образом, предложен новый подход к иммобилизации белков в ПЭ микрочастицы путем ПАП на агрегатах, полученных при высаливании белка. На примере ХТР показано, что данная методика дает возможность включения белков в ПЭ микрочастицы и получения стабильных при хранении препаратов. ХТР был иммобилизован с высокими выходами 70-80 %. Микрочастицы характеризуются высоким содержанием белка (50-70 весовых %). Показана возможность регулирования высвобождения включенного белка путем изменения числа стадий ПАП и рН среды, а также включения белка в частицы, высвободившие белок. Метод иммобилизации белков в ПЭ микрочастицы, описанный в предыдущей главе, помимо указанных преимуществ имеет ряд недостатков: существенную потерю ферментативной активности иммобилизованного ХТР, вызванную комплексообразованием агрегированных молекул белка с полиэлектролитами, а также невозможность контроля размера белок-содержащих ПЭ микрочастиц, имеющих нерегулярную форму. Более того, круг белков для иммобилизации данным методом ограничен необходимостью получения агрегатов белка. В тоже время, при изменении рН среды белок практически полностью высвобождался из остающихся стабильными "пустых" микрочастиц, состоящих из ПЭ комплекса ПСС-ПАА. Такие микрочастицы были использованы для включения (захвата) белка, который после включения сохранил ферментативную активность. Таким образом, микрочастицы регулируемого размера и определенной формы, состоящие из комплекса ПСС-ПАА могут быть использованы в качестве микроконтейнеров для иммобилизации белков путем захвата из окружающей среды. Данная глава настоящей работы посвящена получению и характеристике подобного рода частиц - ПЭ микросфер, полученных на основе СаСОз пористых микрочастиц. Рассматривается включение белков (ферментов) в ПЭ микросферы, возможность контроля высвобождения и каталитическая активность включенных ферментов. 8.1. Синтез и характеристика пористых микрочастиц из карбоната кальция Впервые сферические микрочастицы из карбоната кальция были получены и применены в качестве деградируемои матрицы для получения ПЭ микрочастиц в работе [122] (глава 3.2). Однако, карбонатные частицы не были охарактеризованы, а структура полученных ПЭ частиц не установлена. Более того, образцы полученных СаС03 микрочастиц были полидисперсны [122] (диаметр частиц от 3 до 18 микрон) и до сих пор не удавалось получить СаСОз микрочастицы с более узким распределением по размерам, В данной диссертационной работе нами подобраны условия получения пористых сферических микрочастиц из СаС03.
