Введение к работе
Введение. Ключевым явлением в биоэнергетике клетки является синтез аденозинтрифосфата (АТФ). Создание АТФ требует наличия градиента электрохимического потенциала на мембранах клеток или органелл, его синтезирующих. Данный градиент создается посредством контролируемых ферментами окислительно-восстановительных или фотохимических реакций. Простейшим и наиболее изученным белком, преобразующим энергию света в электрохимический потенциал, является бактериородопсин (БР). Этот трансмембранный белок археи Halobacterium salinarum, поглощая свет, переносит протоны из цитоплазмы во внеклеточное пространство. БР, благодаря доступности в сравнительно больших количествах, простоте очистки и стабильности, в течение последних 30 лет остается одним из самых интенсивно изучаемых мембранных белков.
Актуальность и состояние исследуемых проблем. Для понимания молекулярного механизма работы БР необходимо знать структурные изменения, вызванные поглощением света ретиналем, которые сопровождают фотоцикл белка и приводят к направленному транспорту протона. Наиболее эффективным подходом к решению данной задачи в настоящее время является получение атомарных структур функциональных состояний рабочего цикла БР с помощью рентгеновской кристаллографии высокого разрешения. Использование данного метода требует наличия высокоупорядоченных трехмерных кристаллов белка с одной стороны и эффективных методов фиксирования промежуточных состояний с другой. Способы получения переходных состояний были исследованы ранее [1]. Кристаллы же могут быть получены при использовании нового метода кристаллизации in meso, заключающегося в использовании липидной биконтинуальной мезофазы для кристаллизации мембранных белков [2]. Кристаллизация in meso остается в настоящее время недостаточно изученным методом, что существенно ограничивает его потенциальную применимость для мембранных белков. Несмотря на это, ш meso подход уже позволил получить структуру основного и некоторых промежуточных состояний БР. Однако, опубликованные структуры промежуточных состояний, полученные разными группами, сильно различаются, что ведет к противоречивым заключениям относительно механизмов переноса протона [3-7]. Причины этого в настоящее время остаются до конца невыясненными. Предположительно, отсутствие согласованности может быть связано с недостаточно высоким качеством дифракционных данных, моноэдрическим двойникованием кристаллов, радиационным повреждением кристаллов, а также возникновением новых состояний белка под действием рентгеновских квантов.
Целью исследования являлось выяснение причин, приводящих к возникновению противоречий в области рентгеноструктурного анализа функциональных состояний БР, и поиск путей преодоления сопряженных с ними проблем. Дополнительными задачами работы являлись исследование основного состояния БР с разрешением 1.26А, достигнутым для данного белка впервые, а также исследование липидного окружения молекулы белка в кристаллах, полученных в мезофазах моноолеина (МО) и 1-0-(3,7,11,15)-тетраметилгексадецил-Р-О-ксилозы (Р-ХуЮСіб+4) с участием детергентов различного типа.
Научная новизна. В работе впервые найдены кристаллизационные условия, при которых фактор двойникования кристаллов БР симметрии Рбэ можно определить путем визуального изучения. Это позволило значительно упростить процедуру поиска недвойниковых кристаллов, необходимых для получения высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний БР. Впервые систематически исследована проблема специфического повреждения БР рентгеновскими квантами. В результате продемонстрировано, что специфическое радиационное разрушение, происходящее преимущественно в активном центре молекулы, может приводить к артефактам при анализе структур переходных состояний белка, а также впервые получена количественная зависимость доли белка с разрушенным активным центром от дозы радиации, поглощенной кристаллом белка. В данных расчетах была впервые использована методика оценки дозы, поглощенной белковым кристаллом, основанная на увеличении его В-фактора при радиационном повреждении кристалла.
Благодаря использованию высокоупорядоченных кристаллов, а также методике снятия структурных данных со смещением измерительного пучка вдоль кристалла БР, впервые оказалось возможным установить структуру оранжевой формы БР, образующейся при поглощении белком сверхмалых доз рентгеновского излучения. При этом кристалл поглощал около 0.04МГр при сборе одного набора данных, что на один-два прядка ниже, чем доза рентгеновского облучения, которую поглощали кристаллы БР при сборе рентгеноструктурных данных, опубликованных в литературе.
В работе обсуждается структура основного состояния БР с разрешением 1.26 А, которое впервые достигнуто для БР. Высокое разрешение модели позволило обнаружить новые структурные элементы, необходимые для понимания транспорта протона белком.
В рамках работы впервые проводится систематическое исследование роли детергента в стабилизации кристаллов БР симметрии Рбз, демонстрируется, что молекула детергента не входит в состав кристаллов.
Кроме этого, в работе впервые продемонстрирована возможность использования Р-ХуЮСіб+4 в качестве матричного липида для in тезо кристаллизации, и показано, что молекулы матричных липидов (МО, р-ХуЮС\&и) входят в кристалл и стабилизируют белковый тример, образуя специфические контакты с аминокислотными (АК) остатками в цитоплазматических частях спиралей А-В и Тирі 57 в Е-спирали соседней молекулы БР.
Практическая значимость работы. В ходе работы были решены основные противоречия в области рентгеноструктурного анализа функциональных состояний БР и показаны пути решения основных проблем. Разработанные подходы позволяют получить достоверные структуры основного и переходных состояний, что имеет важное фундаментальное значение, поскольку позволяет установить атомарные детали одного из наиболее общих процессов в жизни клетки - создание электрохимического потенциала на мембране.
Кроме этого, решение конкретных подзадач работы имеет собственное практическое значение. Так работа представляет интерес для белковой кристаллографии вообще. Новые подходы к решению проблемы двойникования могут быть использованы в других лабораториях для устранения данного дефекта кристаллов белка. Результаты исследования радиационного повреждения активного центра БР могут быть использованы при интерпретации рентгеноструктурных данных от кристаллов других белков. Методика оценки дозы, поглощенной кристаллом БР, основанная на увеличении В-фактора кристалла, может быть использована когда размер кристалла белка больше или сравним с размером измерительного пучка.
Исследования роли молекул детергента и матриксообразующего липида в кристаллизации белка важны для понимания механизма кристаллизации in meso и дальнейшего развития метода, поскольку дают представление о роли данных молекул в стабилизации кристалла.
Апробация работы. Основные положения работы и ее отдельные результаты докладывались на Международном симпозиуме "Retinal Proteins: Experiments And Theory" (Бремен, Германия, 2007), 6-й Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва, Россия, 2007), 12-й Международной конференции по кристаллизации биологических макромолекул (Канкун, Мексика, 2008), 4-й Международной конференции "Physics of Liquid Matter: Modern Problems" (Киев, Украина, 2008), 52-й и 53-й Всероссийских молодёжных научных конференциях с международным участием «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Долгопрудный, Россия, 2009, 2010), 14-ой
Интернациональной конференции по ретиналиевым белкам (Санта-Круз, Калифорния, США, 2010), 2-ой Международной научной школе «Современные фундаментальные, медицинские и биотехнологические аспекты исследования биологических мембран» (Долгопрудный, Россия, 2010) и на научных семинарах в Институте структурной биологии г. Гренобля, Институте структурной биологии и биофизики 2 Исследовательского центра г. Юлиха, в Институте кристаллографии Рейн-вестфальского технического университета и в НОЦ «Бионанофизика» МФТИ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы в реферируемых издательствах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав и заключения. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, включает 37 рисунков, 8 таблиц. Библиографический список содержит 213 наименований российских и зарубежных авторов.
Похожие диссертации на Исследование механизма транспорта протона бактериородопсином: получение высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний
