Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Исследование физико-химических изменений во фракциях мозга крыс при гипотермии 15 стр
1.1. Исследование белков субклеточных фракций мозга крыс при гипотермии 15 стр
1.2. Электрофоретическая подвижность белков головного мозга при гипотермии 26 стр
1.3. Исследование проницаемости мембран митохондриальной фракции мозга крыс в норме и при гипотермии 43 стр
1.4. Исследование релаксации протонов воды в тканях крыс при гипотермии 53 стр
ГЛАВА 2. Исследование окислительных процессов в гомогенатах тканей мозга и печени крыс при гипотермии 58 стр
2.1. Влияние гипотермии 30С и введения 2,4-динитрофенола на дыхание гомогенатов тканей мозга и печени крыс 61 стр
2.2. Перекисное окисление липидов мозга и печени крыс при введении 2,4-динитрофенола и гипотермии 30С 72 стр
2.3. Влияние гипотермии 30С на дыхание гомогенатов тканей мозга и печени, адаптированных к холоду крыс 76 стр
2.4. Влияние глубокой гипотермии 20С на дыхание гомогенатов тканей мозга и печени крыс 84 стр
2.5. Влияние гипотермии на потребление кислорода гомогенатами печени сусликов 85 стр
2.6. Температурные зависимости дыхания гомогенатов тканей мозга при гипотермии 20С 88
ГЛАВА 3. Исследование влияния введения спермина на дыхание изолированных митохондрий печени крыс при гипотермии 107 стр.
3.1. Влияние нембуталового наркоза на дыхание изолированных митохондрий печени крыс 120 стр.
3.2. Влияние гипотермии на дыхание изолированных митохондрий печени крыс 126 стр.
3.3. Влияние системного введения различных доз спермина на дыхание изолированных митохондрий печени крыс при нормотермии 131 стр.
3.4. Влияние системного введения спермина на энергетику изолированных митохондрий печени крыс при глубокой гипотермии на фоне нембуталового наркоза 132 стр.
ГЛАВА 4. Исследование температурных зависимостей активностей ферментов при гипотермии 138 стр.
4.1. Исследование температурной зависимости активности ами-нотрансфераз при гипотермии 138 стр.
4.2. Исследование температурной зависимости активности глута-миназы из мозга крыс при гипотермии 147 стр.
4.3. Исследование температурной зависимости активности глута-миназы в синаптосомальной фракции мозга крыс и сусликов при гипотермии 155 стр.
4.4. Исследование температурной зависимости активности глута-минсинтетазы в мозге сусликов при гипотермии и зимней спячке 161 стр.
4.5. Исследование температурной зависимости активности лактат-дегидрогеназы в тканях крыс при гипотермии 163 стр.
4.6. Исследование температурной зависимости активности сукци-натдегидрогеназы мозга и печени крыс при гипотермии 169 стр.
4.7. Исследование температурной зависимости активности ацетил-холинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов при гипотермии и зимней спячке 176 стр.
4.8. Влияние гипотермии на кинетические характеристики Na, К- АТФазы синаптических мембран коры мозга крыс 194 стр.
ГЛАВА 5. Исследование электрической активности мозга и сердца крыс при общей гипотермии 208 стр.
5.1. Влияние гипотермии на электрическую активность мозга крыс 215 стр.
5.2. Влияние внутрибрюшинного введения 2,4-динитрофенола на электрическую активность мозга крыс при гипотермии 221 стр.
5.3. Влияние тяжелой воды (D2O) на электрическую активность мозга крыс при гипотермии 224 стр.
5.4. Влияние введения этилового спирта на электрическую активность мозга крыс при гипотермии 228 стр.
5.5. Влияние введения гамма-оксимасляной кислоты (ГОМК) на электрическую активность мозга крыс при гипотермии 228 стр.
5.6. Влияние внутрибрюшинного введения мочевины на электрическую активность мозга крыс при общей гипотермии 230 стр.
5.7. Влияние внутрибрюшинного введения диметилформамида на электрическую активность мозга крыс при общей гипотермии 242 стр.
5.8. Влияние внутрибрюшинного введения ацетамида на электрическую активность мозга крыс при гипотермии 245 стр.
5.9. Влияние внутрибрюшинного введения диметилмочевины на электрическую активность мозга крыс при гипотермии 252 стр.
5.10. Влияние внутрибрюшинного введения сахарозы на электрическую активность мозга крыс при общей гипотермии 253 стр.
Заключение 267 стр.
Выводы 279 стр.
Список литературы 281 стр.
- Исследование белков субклеточных фракций мозга крыс при гипотермии
- Влияние гипотермии 30С и введения 2,4-динитрофенола на дыхание гомогенатов тканей мозга и печени крыс
- Влияние нембуталового наркоза на дыхание изолированных митохондрий печени крыс
- Исследование температурной зависимости активности ами-нотрансфераз при гипотермии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Выяснение молекулярных механизмов температурных адаптации у млекопитающих является одной из актуальных проблем современной экологической физиологии. В основе любой адаптации лежат изменения на молекулярном уровне.
Температура - один из важнейших факторов, определяющих скорость химических, физических и биологических процессов. От температуры зависит также стабильность биологических структур и, прежде всего, стабильность молекулярных структур. Уже поэтому изменение температуры окружающей среды требует выработки адаптивных механизмов в живых организмах. У животных существует две основные стратегии температурных адаптации: пойкило-термия и гомойотермия. У пойкилотермных животных температура тела изменяется вслед за изменениями температуры окружающей среды. Поскольку все молекулярные процессы зависят от температуры, можно было бы предположить, что и физиологическая активность пойкилотермных животных должна существенно зависеть от температуры тела. Например, при снижении температуры тела скорость физиологических процессов в организме пойкилотермного животного должна тоже снижаться. Биологические последствия этого очевидны - выживаемость организма, при прочих равных условиях будет снижена. Поэтому у пойкилотермных животных эволюционно выработана адаптация к изменению температуры тела - температурная компенсация физиологической активности. Эта адаптация приводит к слабой зависимости физиологической активности от температуры тела в определенном температурном диапазоне. Молекулярным основам температурных адаптации и, в частности, температурной компенсации у пойкилотермных животных посвящено множество работ. Анализ этих работ содержится в ряде прекрасных обзоров [Хочачка, Сомеро, 1977, 1988; Проссер, 1977; Хаскин, 1981; Шмидт-Ниельсон, 1982; Слоним, 1985; Эмирбеков, Львова, 1985]. На уровне ферментов суть механизма температурной компенсации состоит в формировании особой третичной структуры белка, из-
меняющейся с температурой таким образом, что активность фермента изменяется при этом незначительно.
Гомойотермия - это стратегия температурной адаптации, при которой температура тела гомеостатирована в определенном диапазоне интенсивностеи теплообмена организма с внешней средой. Температура тела у гомоиотермных животных поддерживается терморегуляторными механизмами в узком температурном диапазоне при значительном изменении температуры окружающей среды. Температура тела гомойотермного животного обычно изменяется на 1-2С в широком диапазоне физиологической активности. Например, у млекопитающих во время сна ректальная температура на несколько десятых градуса ниже, чем при бодрствовании. Такие небольшие колебания температуры тела не приводят к существенному рассогласованию биохимических и биофизических процессов в клетках, и поэтому физиологическая активность не нарушается.
При интенсивном теплоотборе терморегулятори ые механизмы гомойотермного организма не справляются со своей гомеостатической функцией, и температура тела может значительно снижаться. Соответствующие состояния гомойотермного организма называются гипотермическими. Гипотермические состояния классифицируют по глубине и длительности. Различают кратковременную гипотермию - длительность от нескольких минут до нескольких часов; пролонгированную гипотермию - длительность от нескольких часов до нескольких дней. По глубине различают мягкую гипотермию - температура тела (tp) 35 - 32С, умеренную гипотермию - tp = 32 -25С, глубокая гипотермия - tp = 25-20С, сверхглубокая гипотермия - tp = 20 -15С. Эта классификация обусловлена тем, что при разных температурах тела в организме интенсифицируются или подавляются различные биохимические и физиологические процессы. Мягкая и умеренная гипотермия у ненаркотизированных животных обычно сопровождается повышением терморегуляторного тонуса. Глубокая гипотермия подавляет терморегуляцию и возбудимость нервной системы (холодовой наркоз).
Глубокая гипотермия является опасным для жизни гомойотермного организма состоянием. Пролонгирование глубокой гипотермии увеличивает риск летального исхода. Механизмы, ведущие к летальному исходу при глубокой гипотермии, многообразны и до сих пор не вполне ясны. Самое общее заключение состоит в том, что глубокая гипотермия подавляет жизненно важные функции, что в конечном итоге становится несовместимым с жизнью. Например, электроэнцефалограмма (ЭЭГ) у крысы становится изоэлектрической при ректальной температуре, равной примерно 20С [Петров, Гублер, 1961, Blair, 1964], сердце перестает биться при tp < 15С, дыхание прекращается при tp = 16 - 18С. В то же время следует подчеркнуть, что, используя различные приемы, у млекопитающих можно создавать состояния обратимой глубокой гипотермии с температурой тела, близкой к 0С [Popovic, Popovic, 1974]. При этом, однако, эти состояния должны быть кратковременными и физиологическая активность в этих состояниях почти полностью подавляется.
Считается, что у гомойотермов отсутствует температурная компенсация физиологической активности. Поскольку температура тела у гомойотермов го-меостатирована необходимость в температурной компенсации отпадает. В то же время предполагается, что пойкилотермия является эволюционно более ранней стратегией температурной адаптации [Lyman, 1982; Слоним, 1985]. Одним из крупных обобщений эволюционной теории является положение о том, что новые возможности (функции) в эволюции возникают на базе уже достигнутого. При этом новое не означает отрицание предыдущего багажа. Основываясь на этих рассуждениях, можно предположить, что пойкилотермические механизмы регуляции физиологических функций имеются и у гомойотермов, хотя и в латентной форме. Считается, что при экстремальных состояниях у высших организмов активизируются эволюционно более древние механизмы функционирования. Например, при гипоксических состояниях активизируются гликоли-тические (более древние по сравнению с окислительным фосфорилированием) механизмы энергообеспечения клеток [Hochachka, 1986, 1996]. Рассуждая в этом ключе, можно предположить, что при экстремальных состояниях у гомой-
8 отермов могут активизироваться пойкилотермные механизмы терморегуляции. Поскольку речь идет о температурных адаптациях активизировать эти механизмы у гомойотермов, видимо, можно искусственно снижая температуру тела, то есть, вызывая гипотермические состояния. Именно при гипотермических состояниях у гомойотермов вероятнее всего и могут включаться механизмы, компенсирующие изменения температуры тела.
Упрощая, можно сказать, что разработка методов перевода гомойотермного животного в пойкилотермный режим представляют большой интерес с теоретической и практической точек зрения [Тимофеев, 1983]. На физиологическом уровне признаками, указывающими на то, что в некоторых экспериментальных условиях у млекопитающего включаются элементы системы пойки-лотермной регуляции физиологической активности, могут служить, например, такие изменения температурной зависимости физиологической активности, которые следовало бы интерпретировать, как проявление температурной компенсации. Например, ослабление температурной зависимости какого-либо биохимического или физиологического процесса следует рассматривать, как проявление температурной компенсации. Вопрос о возможности температурной компенсации у гомойотермов затронут А.Д Слонимом в его обзоре [Сло-ним, 1985]: «Температурная зависимость жизненных явлений (Qio) и её градиент в регулирующих и регулируемых системах (в эту цепь включены также явления гистерезиса, связанного с периодическими изменениями, как во внешней среде, так и в деятельности организма) используются не только пойкилотерма-ми, но и гомойотермами». С терморегуляторной точки зрения тело пойкило-термного и гомойотермного организма можно разделить на оболочку (кожа и подлежащая жировая прослойка, мускулатура) и ядро (внутренние органы, мозг, сердце, печень и т. д.) [Майстрах, 1981]. Оболочка тела непосредственно контактирует с окружающей средой и поэтому температура оболочки в зависимости от температуры окружающей среды изменяется в широком диапазоне. В ядре температура более стабильна. Можно сказать, что оболочка тела более пойкилотермна по сравнению с ядром. Изменчивость температуры оболочки
9 коррелирует с меньшей температурной зависимостью биохимических процессов в тканях оболочки у пойкилотермов [Слоним, 1985]. Другими словами в оболочке имеет место температурная компенсация, если сравнивать ее с ядром. Например, Q|0 для дыхания тканей мозга, печени, сердца и мышцы у круглоголовой вертихвостки составляют соответственно 1.8, 1.5, 1.3 и 1.1 [Слоним, 1985]. Поскольку генетический аппарат клеток тканей ядра и оболочки идентичен, материальная основа для осуществления температурной компенсации физиологических и биохимических процессов существует и в клетках тканей ядра тела. Но, как писал Е.В.Майстрах: «К сожалению, пока почти нет данных о «температурной компенсации» у гомойотермов» [Майстрах, 1981].
При гипотермических состояниях у гомойотермов снижается температура не только оболочки, но и ядра. Поэтому можно предположить, что при гипотермии у них возможна индукция (включение) температурной компенсации и в тканях таких органов как мозг, печень, сердце и т. д.
Одним из важных вопросов теории температурных адаптации является величина AtC, на которую нужно изменить температуру тела, чтобы вызвать адаптивное изменение. С теоретической точки зрения адаптивный ответ может быть вызван таким изменением температуры тела, при котором механизмы срочной адаптации уже не могут обеспечить нормальное функционирование клеток тканей при новой температуре тела. Априори вычислить критическое значение AtC невозможно. Однако можно оценить эту величину, исходя из величины температурного диапазона, в границах которого гомеостатирована температура тела у гомойотермных животных. Как уже было сказано выше, этот диапазон составляет несколько градусов. Хочачка и Сомеро [Хочачка, Со-меро, 1988] приводят данные, согласно которым изменение средней температуры акклимации всего на 3С приводит к изменению Кт для пирувата для лак-татдегидрогеназы из мышц двух близких видов рыб от 0,26 ± 0,02 мМ до 0,20 ±0,02 мМ. Этот факт говорит о том, что изменение температуры тела весьма существенно влияет на скорости биохимических и биофизических процессов в клетках, и поэтому даже незначительные (около 1%) изменения температуры
10 тела требуют адаптивного ответа.
Температурные зависимости элементарных химических и физических процессов обычно могут быть описаны с помощью уравнения Аррениуса:
К = К -е RT
где К - константа скорости процесса
Ко - предэкспоненциальный множитель
АЕ - энергия активации
R - газовая постоянная
Т - абсолютная температура
Для химических процессов, протекающих в клетке, энергия активации
составляет около 10 ккал/моль (41,9 кдж/моль). Отношение скоростей реакций при двух температурах Т| и Т2 можно вычислить по формуле
_Д( 1 _ 1 ч
k RTKT т'
— -е
Пусть Т| = 301 К и Т2 = 300 К, тогда для ДЕ = 41.9 кДж/моль получим К|/К2 = 1.057. Таким образом, при энергии активации 41,9 кжд/моль увеличение температуры на 1 градус (0,3%) приводит к ускорению реакции на 5,7%. Если же температура увеличивается на 3 С, то увеличение скорости составит уже 18%. При энергии активации 60 кдж/моль (~14 ккал/моль) увеличение температуры на 3С увеличит скорость реакции на 30%. Из этих оценок следует, что долговременное изменение скоростей элементарных процессов в клетке на 20-30% уже требует адаптивных изменений. Естественно, кратковременные изменения скоростей реакций, не связанные с изменениями температуры тела,
могут многократно превышать эти 20-30%, но при этом не требуется адаптивных изменений, так как имеющиеся в наличии регуляторные механизмы обеспечивают согласование отдельных элементарных стадий друг с другом на коротких отрезках времени. Можно, однако, предположить, что значительные изменения температуры тела могут вызвать адаптивные ответы при относительно кратковременном действии, поскольку, чем сильнее изменяется температура, тем сильнее изменяются и скорости процессов. Например, при АЕ = 42 кдж/моль и AT — 20 С увеличение скорости составит уже 2,85 раза (увеличение на 185%), а при АЕ=62 кдж/моль увеличение составит уже 4,83 раза.
Столь значительные изменения скорости отдельных стадий, видимо, требуют изменений структуры ферментов и надмолекулярных структур. Следует, однако, отметить, что в некоторых системах и при нормотермии скорости биохимических процессов могут изменяться весьма существенно, но эти изменения происходят быстро и не требуют изменений на структурном уровне. Например, в летательных мышцах насекомых скорость гликолиза за доли секунды возрастает в 100 и более раз при переходе от покоя к полету [Ньюсхолм, Старт, 1977]. За столь короткое время изменения структуры ферментов произойти, естественно, не могут, однако, в летательных мышцах насекомых существует специальный механизм аллостерическои регуляции активности гликолитических ферментов, позволяющий быстро увеличивать активность ферментов уже при малых изменениях концентраций продуктов распада АТФ [Ньюсхолм, Старт, 1977]. В других же системах клетки столь мощной системы усиления малых метаболических сигналов может и не быть. Для таких систем, возможно, и нужны изменения на структурном уровне для нормального функционирования при длительном изменении температурного режима. Короче говоря, температурные компенсации должны наблюдаться не для всех систем клетки.
У гомойотермных организмов в природе могут при экстремальных ситуациях наступать гипотермические состояния различной глубины и длительности (акцидентальная гипотермия). С биологической точки зрения целесообразно было бы, поэтому, сохранить у них (гомойотермов) способность выжи-
12 вать и при низких температурах тела. Следовательно, у них должны были выработаться механизмы включения (индукции) температурной адаптации при этих аварийных гипотермических состояниях.
Цель и задачи. Имея в виду вышеизложенное, нами было предпринято исследование изменений, происходящих в мозге млекопитающего (крыса) при гипотермических состояниях различной глубины и длительности с целью обнаружить проявления температурной компенсации при этих состояниях. Используя различные биохимические, биофизические и физиологические методы были исследованы изменения белков в мозге крыс при гипотермии, изменения системы окислительного фосфорилирования в митохондриях, температурные зависимости активности ферментов, электрическая активность мозга. Исследовано также влияние введения различных веществ (2,4-динитрофенола, этилового спирта, гамма-оксимасляной кислоты, Д2О, мочевины, и ее аналогов) на электрическую активность мозга крыс при гипотермических состояниях.
Основные положения, выносимые на защиту.
Гипотермические состояния различной глубины и длительности стимулируют дыхание митохондрий тканей мозга и печени крыс в различных метаболических состояниях. Возрастает фосфорилирующее и разобщённое дыхание. Увеличивается кальциевая ёмкость изолированных митохондрий печени.
Интенсификация дыхания в тканях при гипотермических состояниях сопровождается усилением свободно-радикальных процессов в тканях мозга и печени.
При гипотермических состояниях в мембранах клеток мозга крыс происходят химические изменения (накопление малонового диальдегида), уменьшающие их механическую прочность.
Введение животным перед охлаждением спермина дозозависимо снижает стимулирующее действие гипотермии на дыхание гомогенатов тканей печени.
При гипотермии изменяются температурные зависимости активности ряда ферментов ткани мозга (аланин- и аспартатаминотрансферазы, лак-
13 татдегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, глутаминаза, ацетилхолинэстераза, Ыа,К-АТФаза), что указывает на возможность индукции температурной компенсации в тканях «ядра» у гомойотермов.
Введение веществ, подавляющих энергетический обмен в клетке, повышает критическую температуру тела, при которой прекращается электрическая активность мозга крыс.
Введение адаптогенных веществ (мочевина, ацетамид, диметил-формамид) снижает критическую температуру прекращения электрической активности мозга крыс.
Научная новизна. Полученные данные указывают на то, что и при кратковременных гипотермических состояниях в клетках ткани "ядра" теплокровного животного могут включаться механизмы температурной адаптации. Впервые исследовано изменение температурных зависимостей активности ряда ферментов при гипотермических состояниях различной глубины и длительности. Впервые исследовано влияние гипотермии на дыхание митохондрий мозга и печени в различных метаболических состояниях. Показано появление низкотемпературного оптимума на кривой температурной зависимости активности глутаминазы мозга крыс и сусликов, положение, которого зависит от температуры тела при гипотермии. Обнаружено существенное увеличение степени субстратного ингибирования активности ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов при гипотермии и зимней спячке. Впервые показано снижение критической температуры тела, при которой прекращается электрическая активность мозга млекопитающего, при введении животным мочевины и родственных ей соединений.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные могут быть использованы для построения теории температурных адаптации у млекопитающих. Они свидетельствуют в пользу предположения о возможности индукции температурной компенсации активности физиологически важных ферментов при существенном снижении температуры тела гомойотермного животного. Что говорит об эволюционной связи между пойкилотермией и го-
14 мойотермией. Возможность снижения критической температуры, при которой прекращается электрическая активность мозга при общем охлаждении, посредством введения мочевины и её аналогов позволит разработать меры для повышения выживаемости организма при акцидентальнои гипотермии и расширить применение искусственной гипотермии в хирургической практике.
Апробация работы. Отдельные результаты работы докладывались на научных конференциях и съездах: Механизмы адаптации живых организмов к влиянию факторов среды (1 Всеросс. совещание, Ленинград, 1977), Адаптивные функции мозга (Всесоюзн. симп., Баку, 1980), Важнейшие теор. и практ. проблемы терморегуляции (Конференция, Новосибирск, 1982), 1 Всесоюзн. биофизический съезд (Москва, 1982), Актуальные вопросы патологии (Материалы V закавказской научной конференции патофизиологов), Биохимич. механизмы зимней спячки и сна (Махачкала, 1985), Фундаментальные достижения нейрохимии - медицине (Конференция, Горький, 1987), Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины (Межд. Конференция, Харьков, 1988), Механизмы зимней спячки (Всесоюзн. симп., Махачкала, 1990), Биохим. аспекты Холодовых адаптации (Междунар. конференция, Харьков, 1991), Успехи современной криобиологии (2 Междунар. конференция, Харьков, 1992), Sixteenth Biennial Meeting of ISN (Boston, 1997), Twelfth General Meeting of ESN (St.Petersburg, 1998), Seventeenth Biennial Meeting of ISN (Berlin, 1999), 7-ая Пущинская конференция молодых учёных (Пущино, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 72 работ.
Исследование белков субклеточных фракций мозга крыс при гипотермии
Изменение температуры тела влияет, прежде всего, на скорости биохимических процессов в клетках тканей. Это, в свою очередь, может приводить к изменениям на структурном уровне. Часть этих изменений может быть необратимой, и обнаруживается в опытах in vitro. Так, было обнаружено, что охлаждение крыс до ректальной температуры 19-20С приводит к увеличению содержания белка в водорастворимой фракции мозга [Мусаев, 1972]. Анализ этих изменений позволил нам предположить, что они обусловлены деструктивными процессами в мембранных структурах при гипотермии. Предполагалось, что увеличение содержания белков в водорастворимой фракции при гипотермии обусловлено перераспределением белков между фракциями. С целью проверки этого предположения в настоящей серии экспериментов проведено исследование изменений содержания белка и белковых SH-групп в различных субклеточных фракциях мозга при гипотермии 19-20С. Исследована также активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в водорастворимой и микросомальной фракциях. АХЭ является мембранным ферментом, который локализован на внешней поверхности плазматической мембраны. Поэтому перераспределение этого фермента между фракциями при гипотермии может свидетельствовать о большем разрушении мембран при гомогенизации.
Опыты проведены на белых крысах обоего пола весом 150-180 г. Гипотермию вызывали с помощью Холодовых одеял, через которые пропускали холодную воду.
Фракционирование мозга проводили по Уитекеру и Баркеру [Whittaker, Barker, 1972]. После декапитации животных мозг отделяли от мозжечка и гомогенизировали в 0.32 М сахарозе (соотношение ткань: раствор сахарозы = 1:10 вес/объём) в гомогенизаторе стекло-тефлон (диаметр пестика 25 мм, зазор 0.5 мм, скорость вращения 1700 об/мин, 25 проходов вверх-вниз). Гомогенат центрифугировали при 850 g 11 минут. Супернатант (7 мл) отбирали пипеткой, а осадок ресуспендировали в 0.32 М сахарозе и вновь центрифугировали при 850 g 11 минут. Супернатант (3 мл) объединяли с супернатантом от первого шага, а осадок отбрасывали. Объединённый супернатант (10 мл) центрифугировали при 20 000 g 30 минут в ультрацентрифуге «Superspeed-75». Супернатант (фракция 1С) представляет собой раствор белков со взвешенными в нём микросомами, осадок - грубая митохондриальная фракция (IP). Фракцию IP ресуспендировали в 5 мл 0.32 М сахарозы и наносили на градиент сахарозы 1.28 М -1.20 М - 1.00 М - 0.80 М. Затем центрифугировали при 100 000 g 90 минут в swing-out роторе. Фракции собирали шприцем с загнутой иглой. На границе растворов 0.32 М - 0.80 М собирали миелиновую фракцию, 0.80 М - 1.00 М -фракцию плазматических мембран, 1.00 М - 1.20 М - фракцию «лёгких» синап-тосом, 1.20 М - 1.28 М - фракцию «тяжёлых» синаптосом, на дне - митохондрии (рис.1).
Идентификация фракций проводилась с помощью электронного микроскопа. Фракции осаждали центрифугированием, фиксировали глутаральдеги-дом, заливали в дуркупан и после обработки срезов уранилацетатом и цитратом свинца фотографировали под электронным микроскопом.
В отдельной серии экспериментов фракцию 1С разделяли на две, осаждая микросомы центрифугированием при 100 000 g 30 минут. Таким образом, получали супернатант (фракция ПС) и осадок (фракция IIP), который для исследования ресуспендировали в 0.32 М сахарозе. Все операции проводили на холоду. Белок определяли по Лоури с сотрудниками. Белковые SH-группы - по Седлаку и Линдсею с помощью реагента Эллмана [Sedlak, Lindsey, 1968]. Активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) определяли по Эллману [Ellman et al., 1961] с той лишь разницей, что не добавляли специфический ингибитор псев-дохолинэстеразы. Полученные результаты подвергнуты статистической обра ботке с использованием критерия Стьюдента. Применённый нами градиент сахарозы для разделения грубой митохондриальной фракции позволяет лучше отделить синаптосомы от митохондрий, так как, если разделение проводить в градиенте с нижним раствором 1.20 М сахарозы, то часть более плотных синап-тосом оседает вместе с митохондриями. Кроме того, с новым градиентом получается две фракции синаптосом: «лёгкие» и «тяжёлые». Под электронным микроскопом, однако, нам не удалось обнаружить различия между этими синапто-сомальными фракциями: в обеих фракциях синаптосомы имеют синаптические пузырьки, фрагменты постсинаптического аппарата, внутрисинаптические митохондрии (рис.2-5). Охлаждение крыс до 19-20С приводит к увеличению содержания белка во фракции 1С (на 11.6%) и уменьшению во фракции IP (на 10%) (таблица 1).
Влияние гипотермии 30С и введения 2,4-динитрофенола на дыхание гомогенатов тканей мозга и печени крыс
Кратковременная гипотермия 30С приводит к увеличению дыхания на эндогенных субстратах на 73% по сравнению с контролем. Более вероятно, что активация эта связана с активацией при гипотермии ферментативного аппарата митохондрий, что приводит к увеличению скорости утилизации эндогенных субстратов. Известно, что при гипотермии, особенно на начальной стадии снижения температуры тела, происходит резкая активация терморегуляторного тонуса: организм стремиться удержать температуру тела на исходном уровне, несмотря на возросшую теплоотдачу [Петров, Гублер, 1961; Popovic, Popovic, 1974]. Эта реакция сопряжена с активацией секреции катехоламинов и кортико-стероидов надпочечниками и повышением их концентрации в крови [Эмирбе-ков и др., 1995]. Известно, что тиреоидные гормоны также являются стимуляторами тканевого дыхания, действуя как разобщители окислительного фосфо-рилирования [Venditti et al.,2003; Silva, 2003]. Хотя механизм этого действия до сих пор не выяснен.
Гипотермия 30С приводит к статистически достоверному возрастанию скорости потребления кислорода в метаболическом состоянии 2 на 37% по сравнению с контролем. Поскольку в этом состоянии лимитирующей стадией является скорость транспорта протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану, это увеличение, можно объяснить, разобщающим действием гипотермии на окислительное фосфорилирование за счет увеличения пассивной проницаемости внутренней митохондриальной мембраны для протонов. Это предположение согласуется и со снижением Р/О при гипотермии 30С.
Добавление АДФ стимулирует дыхание также и при гипотермии 30С. При этом скорость V3 при гипотермии 30С на 39% выше, чем при нормотер-мии. Поскольку лимитирующая стадия в этом метаболическом состоянии - это акцепция протонов в АТФ-синтетазном комплексе, то можно предположить, что увеличение V3 при гипотермии происходит за счет активации АТФ-синтетазы. Например, активация АТФ-синтетазы могла произойти за счет модификации её аннулярных липидов при гипотермии.
Гипотермия 30С не повлияла на скорость дыхания в состоянии 4. Разобщенное дыхание при гипотермии 30С достоверно возрастает на 24%. Это свидетельствует о том, что активность переносчиков электрон-транспортной цепи при гипотермии 30 С возрастает, так как именно их активность является лимитирующей стадией в этом метаболическом состоянии.
Таким образом, из полученных данных следует, что гипотермия 30С активирует как сопряженное, так и разобщенное дыхание. При этом скорость фосфорилирования резко снижается, составляя 54% от скорости фосфорилиро-вания в контроле. Это свидетельствует о снижении сопряженности окисления и фосфорилирования при гипотермии 30С. Об этом также свидетельствует уменьшение отношения Р/О. Уменьшение отношения Р/О возможно также вследствие активации внешнего пути окисления в митохондриях [Жигачёва и др., 1976; Агуреев, Мохова, 1979; Агуреев и др., 1981]. Несмотря на то, что мозг составляет лишь 0.5% от веса тела (для крысы), он потребляет 20% поглощенного организмом в целом кислорода [Иванов, 1979] и, следовательно, примерно 20%» образующегося в организме тепла приходится на долю мозга. Отсюда следует, что мозг ифает важную роль в балансе теплообмена организма с внешней средой. Следовательно, увеличение скорости окислительных процессов в мозге при гипотермии 30 С можно рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на поддержание постоянной температуры тела в условиях повышенного теплообмена. Таким образом, можно предположить, что мозг участвует в химической терморегуляции, так называемом «несократительном термоге-незе».
При гипотермии одним из возможных объяснений стимуляции дыхания в тканях может быть усиление липолиза в тканях при снижении температуры тела и увеличение концентрации свободных жирных кислот, которые являются разобщителями окислительного фосфорилирования [Эмирбеков и др., 1995]. Однако для мозга липиды не могут служить быстрым источником энергии.
Совместное действие гипотермии 30С и внутрибрюшинного введения 2,4-ДНФ также приводит к стимуляции дыхания гомогенатов ткани мозга крыс. Скорость дыхания в состоянии 1 возрастает на 50%. Однако, это значение статистически достоверно не отличается от скорости дыхания при гипотермии 30С и введении 2,4-ДНФ раздельно. Таким образом, влияние этих двух факторов - физического и химического - не аддитивны.
Скорость V2 также возрастает (на 27%) и это возрастание статистически достоверно по сравнению с контролем, но при этом не отличается от раздельного влияния каждого из этих факторов.
Скорость V3 при совместном действии гипотермии 30С и 2,4-ДНФ также возрастает на 37% по сравнению с контролем, что практически совпадает с действием гипотермии. Таким образом, и в данном случае эффекты этих двух воздействий не аддитивны. Скорость дыхания V4 при совместном действии гипотермии 30С и введения 2,4-ДНФ увеличивается на 17% по сравнению с контролем. Разобщенное дыхание возрастает на 55% по сравнению с контролем. Таким образом, во всех метаболических состояниях наблюдается активация дыхания по сравнению с контролем, однако, эффекты двух воздействий не аддитивны. Следует отметить, что скорость фосфорилирования при совместном действии обоих факторов практически такая же, как в контроле и при действии 2,4-ДНФ.
Обращает на себя внимание, что при нормотермии среднее значение V5 оказалось даже ниже, чем V3 и близко к V4. Можно предположить, что низкое значение V5 в контроле вызвано частичным торможением оксалоацетатом. Это может происходить в том случае, если активность фермента конденсирующего оксалоацетат с остатком уксусной кислоты ниже, чем активность ферментов нижней части цикла Кребса. В этом случае оксалоацетат может накапливаться в клетке и, являясь сильным ингибитором сукцинатдегидрогеназы, тормозить дыхание. Одним из объяснений увеличения V5 при введении 2,4-ДНФ в организм животного является то, что 2,4-ДНФ стимулирует активность цитратсин 67
тетазы. В работе Ещенко с сотрудниками [Ещенко и др., 1976] показано, что внутрибрюшинное введение 2,4-ДНФ крысам в дозе 30 мг на кг веса приводит к увеличению активности цитратсинтетазы в 2.3 раза. Другое объяснение увеличению V5 могло бы заключаться в том, что при введении 2,4-ДНФ активируется переаминирование оксаолацетата с образованием аспартата. А он уже не является ингибитором сукцинатдегидрогеназы.
Влияние нембуталового наркоза на дыхание изолированных митохондрий печени крыс
При п=1 выходная функция оптимизирует выходной поток реакции синтеза АТФ при оптимальной эффективности сопряжения при степени сопряжения равной 0.786. При п=2 оптимизируется выходная мощность при оптимальной эффективности (q=0.910). При п=3 оптимизируется выходной поток при минимальных затратах энергии (q=0.953). И, наконец, при п=4 максимизируется выходная мощность при минимальных затратах энергии (q=0.972). Регуляция степени сопряжения, соответствующей различным состояниям клетки, осуществляется, главным образом, концентрацией свободных жирных кислот в цитозоле. Причем, действие жирных кислот, возможно, связано со специальным уменьшением эффективности энергосопрягающего механизма, а не с неспецифическим увеличением пассивной проницаемости внутренней митохонд-риальной мембраны [Stucki, 1983]. Следует также подчеркнуть, что линейное сопряжение между силами и потоками в митохондриях наблюдается и вдали от равновесия, хотя феноменология неравновесной термодинамики изложенная выше, соответствует системам, находящимся вблизи равновесия. Stucki предполагает, что линейное сопряжение вдали от равновесия есть следствие эволюционного отбора, направленного на увеличение эффективности преобразования энергии при окислительном фосфорилировании. При изменении физиологического состояния могут происходить существенные изменения энергетической нагрузки (потребления АТФ), при которых может нарушаться линейность сопряжения, то есть нарушение линейной зависимости термодинамических потоков от термодинамических сил. В этом случае регуляторные (адаптивные) механизмы направлены на восстановление линейности сопряжения и тем самым эффективности преобразования энергии при окислительном фосфорили-ровании. Согласно нашим данным величина коэффициента сопряжения, q, во всех исследованных нами вариантах опыта изменялась в довольно узком интервале значений от 0.888 до 0.923. Эта степень сопряжения соответствует, согласно Stucki, величине n = 2, то есть во всех состояниях оптимизируется максимальная выходная мощность при оптимальной эффективности.
Важной характеристикой состояния митохондрий является величина кальциевой ёмкости. Под кальциевой ёмкостью понимают максимальное количество кальция, которое можно закачать в митохондрию прежде чем в ней образуется так называемая временная пора (mitochondrial transition роге), через которую могут проникать довольно крупные молекулы (до 1500 Да). Образование этой поры приводит к массовому выходу кальция из митохондрии и повышению его цитозольной концентрации. Что, в свою очередь, может запустить цепочку процессов, ведущих к гибели клетки. Митохондрии играют центральную роль в регуляции концентрации внутриклеточного кальция. При стимуляции нервных клеток экстраклеточный кальций поступает в клетку. Высокая концентрация кальция в цитозоле запускает ряд биохимических процессов, ведущих в конечном итоге к смерти клетки. Поэтому избыток кальция закачивается внутрь митоходрий. Впоследствие митохондрии выделяют кальций в ци-тозоль, а оттуда он поступает в экстраклеточное пространство вследствие Na /Са - обмена. Чем больше кальциевая ёмкость митохондрий, тем большие перегрузки кальцием может вынести клетка. Перегрузка клеток кальцием может возникнуть при различных экстремальных состояниях. Например, в мозге при гипоксии деполяризация мембраны нейрона приводит к длительному выделению возбуждающего медиатора глутамата, действие которого на метабо-тропные рецепторы приводит к входу кальция в постсинаптические нейроны в избыточных количествах. Это может вызвать гибель нейронов. Механизм образования временной митохондриальной поры не известен. Известно, что эта пора состоит из нескольких белков, включая гесокиназу, креатинкиназу, транслокатор адениновых нуклеотидов [Beutner et al., 1996; Cassarino, Bennet, 1999; Crompton, 1999]. Ряд данных указывает на то, что пора играет важную физиологическую роль, участвуя в транспорте кальция из митохондрии в цитозоль, транспорте белков. Открытие поры зависит от ряда факторов. В том числе от мембранного потенциала. Ингибиторы электронного транспорта, кальций, свободные радикалы, свободные жирные кислоты стимулируют образование поры. Само формирование поры стимулирует образование свободных радикалов ми-тохондриальным комплексом I [Batandier et al., 2004].Это может играть важную роль в развитии патологических процессов.
Из таблиц 1 и 2 следует, что нембуталовый наркоз достоверно снизил скорости V3 и V5 соответственно на 11% и 10%, и уменьшил величину дыхательного контроля на 9%, на основании чего может быть сделан вывод о разобщении дыхания и фосфорилирования в изолированных митохондриях под влиянием наркоза. С этим предположением, однако, не согласуется тот факт, что наркоз практически не повлиял на значение коэффициента Р/0 (уменьшение составило всего лишь 5%). В то же время коэффициент сопряжения при наркозе уменьшился, хоть и не намного (на 2%). Возможно, что небольшое снижение дыхательного контроля может и не повлиять на это соотношение. В литературе описано разобщение дыхания и фосфорилирования в митохондриях печени при системном введении оксибарбитуратов - люминала, амитала и гексенала [Иваненко, 1972], а также при эфирном наркозе [Хватова, Швец, 1969].
Наркотическое действие барбитуратов, как и других анестетиков, связывают с их гидрофобными свойствами и взаимодействием с липидами клеточных мембран [Дарбинян, Головчинский, 1972]. С этой точки зрения разобщение окислительного фосфорилирования можно объяснить влиянием нембутала на липиды внутренней митохондриальной мембраны, что приводит к увеличению ее проницаемости для протонов и падению ДцН+.
Исследование температурной зависимости активности ами-нотрансфераз при гипотермии
Ложная операция практически не влияла на активность АЛТ в гомогенатах мозга крыс и незначительно снижала активность ACT (табл. 2). Адреналэктомия увеличивала активность АЛТ по сравнению как с интактньми, так и с ложнооперированными животными соответственно на 27.8 и 31.4%. Активность ACT, напротив, снизилась на 34.2% по сравнению с интактными животными и на 21.7% по сравнению с ложнооперированными (сравнения проведены при температуре инкубации 37С). Охлаждение ложно-оперированных животных приводит к резкому снижению активности АЛТ ткани мозга на 46.0% по сравнении интактньми животными и на 44.4 % по сравнению с ложнооперированными. При этом происходит значительное изменение характера температурной зависимости активности АЛТ. У гипотермированных ложнооперированных животных температурная зависимость АЛТ в Аррениу-совских координатах характеризуется прямой с наклоном, соответствующим АЕ = 22.07±0.2 кдж/моль, в то время как ложная операция не изменяет характера температурной зависимости по сравнению с интактными животными.
При гипотермии адреналэктомированных животных происходит снижение активности АЛТ мозга на 33.1 % по сравнению с ее активностью у адреналэктомированных нормотермичеких животных (см. табл. 2); изменения температурной зависимости не происходит. Таким образом, кратковременная гипотермия животных всех трех исследованных групп вызывает снижение активности АЛТ в ткани мозга. Наиболее вероятный вывод из полученных данных заключается в том, что изменения активности АЛТ при кратковременной гипотермии не определяются, по-видимому, реакцией надпочечников, а являются следствием процессов, происходящих в самой ткани мозга.
При гипотермии ложнооперированных крыс активность ACT увеличивается незначительно (на 5.1 %) по сравнению с нормотермией ложнооперированных животных; температурная зависимость при этом напоминает таковую для АЛТ у интактных животных. Гипотермия у адреналэктомированных животных характеризуется увеличением активности ACT на 73%, по сравнению с нормотермией адреналэктомированных животных. Таким образом, адреналэктомия приводит к изменению реакции ACT на охлаждение, и в этом, видимо, также проявляется ее функциональное отличие от АЛТ. Пролонгирование ги-потермического состояния (20С) в течение 2-х часов приводит к возрастанию активности аминотрансфераз (см. табл. 1). Температурная зависимость активности АЛТ при этом изменяется весьма значительно. Активность фермента при температуре инкубации 30С оказывается ниже, чем при 20С. Столь значительное изменение температурной зависимости активности фермента при пролонгировании гипотермического состояния свидетельствует, очевидно, о существенных изменениях структуры ферментной молекулы. Дальнейшее пролонгирование гипотермического состояния приводит к повышению активности АЛТ и также сопровождается изменением температурной зависимости. После пролонгирования гипотермии в течение 2 часов температурная зависимость АЛТ может быть аппроксимирована прямой с наклоном, соответствующим АЕ = 22.6±0.8 кдж/моль.
Температурная зависимость ACT при пролонгировании гипотермии так же претерпевает заметные изменения, заключающиеся в том, что эффективная энергия активации уменьшается до 9.6±0.8 кдж/моль. Эти изменения энергии активации сопровождаются повышением активности фермента, и через 2 ч пролонгирования гипотермии она оказывается даже выше, чем у интактных животных. В общем, изменения активности АЛТ и ACT коррелируют с динамикой содержания в мозге таких важных компонентов азотистого метаболизма, как амидные группы белков, аммиак, глутамат, аспартат и у-аминомасляная кислота. В динамике гипотермии 20С содержание указанных соединений претерпевает фазные изменения, причем через 2—3 ч количества этих веществ приближаются к норме. Эти изменения активности аминотрансфераз и количества азотистых метаболитов в ткани мозга при гипотермии безусловно, следует считать взаимосвязанными и отражающими переход метаболизма мозга в качественно новое стационарное состояние.
Из всей сложной картины изменений активности аминотрансфераз при гипотермии для нас является важным тот факт, что при пролонгировании гипо 145 термин происходит существенное изменение температурной зависимости активности АЛТ. Этот факт следует рассматривать как проявление индуцированной низкой температурой тела температурной компенсации активности фермента. Переаминирование аланина под действием АЛТ даёт пируват, который в митохондриях под действием пируватдегидрогеназы образует в конечном итоге ацетил-СоА, необходимый для работы цикла Кребса. Возможно, что активность АЛТ при низких температурах тела необходима для поддержания энергетического обмена в мозге на адекватном потребностям нейронов уровне. Последние данные говорят о том, что образующийся внутриклеточно глутамат в клетках мозга входит в цикл Кребса посредством трансаминирования, но входит не в тот же пул, в который поступает экстраклеточный глутамат [McKenna et al., 1996]. Причём внутриклеточный глутамат, необходимый для синаптической функции, образуется из глутамина под действием глутаминазы синаптических окончаний. Следовательно, изменение активности аминотрансфераз при гипотермии может отражать процесс регуляции синаптической активности при низких температурах тела. Изменение температурной зависимости активности ферментов, возможно, является одним из механизмов температурной компенсации. Этот механизм у гомойотермов, как уже отмечалось выше, обычно не проявляется, так как температура тела у них гомеостатирована. Аминотрансфе-разы являются водорастворимыми ферментами. При гомогенизации тканей они обнаруживаются в супернатанте. Это говорит о том, что механизмы изменений активности, обнаруженные нами при гипотермии, не связаны с изменениями их взаимодействия с мембранными структурами. Поэтому следует предположить, что при гипотермии происходит модификация структуры самой молекулы фермента. В литературе нет сведений об эндогенных ингибиторах или активаторах аминотрансфераз, которые бы существенно влияли на активность этих ферментов. На активность этих ферментов может повлиять изменение степени амидированности белковой молекулы фермента или какой-либо другой вид химической модификации. Однако в отсутствие экспериментальных данных эти предположения остаются открытыми. В то же время скорость утилизации раз 146 личных субстратов, происходящей с участием аминотрансфераз, зависит не только от концентрации субстратов аминотрансфераз, но и от концентрации интермедиатов различных метаболических путей. Например, было показано, что пируват в концентрации 1 мМ активирует митохондриальную ACT в культуре астроцитов мозга крыс [McKenna et al., 1996]. Предполагается, что пируват снижает константу Михаэлиса для глутамата. Роль аминотрансфераз в энергетическом обмене мозга состоит в том, что они могут быстро мобилизовать энергетические ресурсы цитоплазматического глутамата для производства АТФ. Скорость потребления глюкозы мозгом млекопитающего составляет примерно 0.5-1.0 мкМ/г ткани/мин [Clarke, Sokoloff,1999]. Уже через 10-30 минут после введения меченой глюкозы от 70 до 80% метки оказывается в аминокислотном пуле. Это говорит о высокой активности трансаминаз в мозге. Согласно Мак-Ильвейну [Мак-Ильвейн, 1962] переаминирование в мозге может происходить со скоростью 1900 мкМ/г ткани/час, то есть 30 мкМ/г ткани/мин. Таким образом, возможности аминотрансфераз в 30-60 раз превосходят скорость поступления глюкозы в ткани мозга. Для чего нужна такая высокая скорость переаминирования? Ведь субстраты переаминирования в мозге образуются из глюкозы и в стационарном состоянии скорость их преобразования не может превосходить скорость поступления глюкозы в клетки. Высокая активность трансаминаз, видимо, связана с тем, что физиологическая активность нейронов имеет прерывистый характер: периоды электрического молчания сменяются генерацией потенциалов действия.
