Содержание к диссертации
Введение
CLASS ГЛАВА I. Обзор литературы 1 CLASS 3
1.1. Функциональная организация нервно-мышечного синапса 13
1.1.1. Строение нервно-мышечного синапса 13
1.1.2. Синтез ацетилхолина 15
I.I 3. Хранение и выделение ацетилхолина 17
1.1.4. Потенциалы и токи концевой пластинки 18
1.1.5. Хожнорецепторы и ионные каналы 21
1.1.6. Функциональные обратные связи ( ФОС ) в нервно-мышечном синапсе 23
1.2. Исследование механизма действия препаратов кураре 25
1.2.1. Ранние этапы исследования 25
1.2.2. Химический состав кураре. 27
1.2.3. Исследование количественных закономерностей действия тубокурарина на постсинаптическую мембрану 28
1.2.4. Исследование действия тубокурарина микроэлектродными методами 29
1.3. Теркуроний - новый отечественный миорелаксант с высокой избирательностью действия 38
ГЛАВА 2. Методика 42
2.1. Нервно-мышечный препарат и растворы 42
2.2. Регистрация потенциалов мышечного волокна 42
2.3. Определение эффекта мшрелаксантов 43
ГЛАВА 3. Действие Тубокурарина на спонтанное квантовое выделение ацетшеколина 49
3.1. Скорость развития эффекта тубокурарина 49
3.2. Действие тубокурарина на частоту МПКП 49
3.3. Действие тубокурарина на амплитуду МПКП 52
3.4. Определение константы сродства тубокурарина
по уменьшению амплитуды МПКП 56
3.5. Действие тубокурарина на амплитуду МИШ летних лягушек 59
Выводы 60
ГЛАВА 4. Действие Тубокурарина на амплитуду ПКП при редкой стимуляций нерва 62
4.1. "Прямой" и "поэтапный" методы определения эффекта тубокурарина 62
4.2. Исследование влияния тубокурарина на квантовый состав ПКП 69
4.3. Исследование действия тубокурарина на амплитуду ПКП рассеченных нервно-мышечных препаратов 72
4.4. Количественные закономерности действия тубокурарина на амплитуду ПКП 73
Выводы 79
ГЛАВА 5. Действие тубокурарина на квантовое вьщеление ацетшехолина при частой стишящи HEFBA 80
5.1. Постановка задачи 80
5.2. Стимуляция с частотой 20 имп/с 82
5.3. Стимуляция с частотой 25 имп/с 87
5.4. Стимуляция с частотой 10 имп/с 88
5.5. Обсуждение результатов опытов с частой стимуляцией 91
5.6. Сравнение пресинаптических эффектов тубокурарина и гемихолиния-3 . 92
Выводы. 94
ГЛАВА 6. Действие теркурония на нервно-внешнему передачу лягушки 96
6.1. Скорость развития эффекта теркурония 96
6.2. Действие теркурония на частоту МЛЕЛ 97
6.3. Действие теркурония на амплитуду МИКИ 97
6.4. Действие теркурония на амплитуду ШЇЇ 103
6.4.1. "Магниевые" нервно-мышечные препараты 103
6.4.2. Рассеченные нервно-мышечные препараты .103
Выводы 106
ГЛАВА 7. Обсувдение результатов 107
Общие выводы 117
Список литературы 119
- Функциональная организация нервно-мышечного синапса
- Нервно-мышечный препарат и растворы
- Скорость развития эффекта тубокурарина
- "Прямой" и "поэтапный" методы определения эффекта тубокурарина
Введение к работе
Мышечные релаксанты в настоящее время широко используются в медицинской практике. Способность миорелаксантов вызывать расслабление мышц нашла свое применение при лечении разнообразных поражений нервной системы, сопровождающихся повышенным тонусом скелетной мускулатуры. К числу таких заболеваний относятся столбняк, бешенство, эпилепсия, отравление стрихнином. Особенно успешным применение миорелаксантов оказалось в хирургии и травматологии. Использование миорелаксантов при проведении хирургических операций обеспечгает полное расслабление скелетных мышц, что создает оптимальные условия для оксигенации крови путем принудительной вентиляции легких. Это позволяет отказаться от чрезмерно глубокого опасного наркоза. Широкое использование миорелаксантов в медицине определяет необходимость исследования механизма их действия.
Особое место в ряду миорелаксантов занимает тубокурарин. Помимо того, что он широко используется в клинике, его значение определяется еще тем, что он является своеобразным эталоном при определении характеристик вновь синтезируемых миорелаксантов. В физиологических экспериментах тубокурарин используется часто для устранения мышечных сокращений. По этому поводу И.П.Павлов писал: "...как перерезка спинного мозга, так и наркоз делают невозможным исследование рефлекторных явлений или более или менее ограничивают изучение этой столь обширной области физиологического исследования и затрудняют его. Большие услуги оказало в этом отношении кураре; оно оказывает паралитическое действие на окончания моторных нервов и устраняет таким образом при физиологических опытах колоссаль-
ную и многостороннюю роль скелетной мускулатуры в организме." ( Поли.собр.тр. т.5, стр.281, 1949 ). Тубокурарин - самый изученный миорелаксант, что является, вероятно, как причиной, так я следствием его особого положения. Исследование механизма его действия имеет уже более чем столетнюю историю. Однако до настоящего времени некоторые стороны его действия остаются неясными. В результате ряда исследований было установлено, что тубокурарин снижает чувствительность постсинаптической мембраны К ацетилхолину ( Van Maanen, 1950; del Castillo, Katz, 1957; Jenkinson, 1960; Katz, Miledi, 1978 ) и другим холиномиметическим веществам (del Castillo, Katz, 1957; Hig-men et ai., 196З; Coiquhoun et ai., 1979 ). Остается спорным, однако, вопрос о пресинаптическом действии тубокурарина. Обширная литература по этому вопросу не дает однозначного ответа. Работы, в которых наблюдалось влияние тубокура-рина на квантовое выделение ацетилхолина из нервного окончания ( Lilleheil, Haess, 1961; Biani et al., 1964; Standaert, 1964; Hubbard et al., 1969; 1973; Galindo, 1971; Glavinovic, 1979; Maglehy et al., 1981 ) чередуются с работами, где это влияние обнаружить не удалось ( Dale et al., 1936; Kmjevic, Mitchell, 1961; Beranek, Vyskocil, 1967; Chang et al., 1967; Bowen, Merry, 1969; Auerhach, Betz, 1971; Bauer, 1971 ). К настоящему времени в литературе накопилось большое количество работ как в пользу, так и против пресинаптического действия тубокурарина.
В результате знакомства с литературой, а также в ходе собственных исследований, у нас сложилось представление, что противоречия между работами, где утверждается пресинаптичес-кое действие тубокурарина, и работами, где оно отрицается,
нет. Все дело сводится к различным условиям проведения экспериментов. Самым важным фактором, определяющим проявление пресинаптического действия тубокурарина, на наш взгляд, является частота стимуляции нерва. В тех работах, где частота стимуляции нерва была небольшой (1-5 имп/с и меньше ) пре-синаптическое действие тубокурарина не наблюдалось. При большой частоте стимуляции нерва ( десятки имп/с ) тубокурарин, как правило, уменьшал выделение ацетилхолина. Эта идея была основной при проведении данной работы. Предстояло выяснить, действительно ли проявление пресинаптического действия тубокурарина связано с частотой раздражения нерва.
Другим важным вопросом механизма действия тубокурарина является вопрос о количественных закономерностях его постси-наптического действия. Этот вопрос рассматривался неоднократно, и итог этим исследованиям был подведен в работе Jennkinson (I960). Однако во всех этих работах исследовались закономерности действия тубокурарина при блокировании действия медиатора, добавляемого в ванночку. В физиологических условиях выделение ацетилхолина и его взаимодействие с холинорецепто-рами происходит квантами. Условия взаимодействия ацетилхолина с холинорецепторами при этом будут отличаться от условий взаимодействия экзогенного медиатора с холинорецепторами. Отличие состоит в том, что в составе кванта вместе с ацетил-холином выделяются другие вещества (полипептиды, АТФ и пр.), которые, возможно, вмешиваются в процесс взаимодействия ацетилхолина с холинорецепторами. Кроме того, действие кванта является событием кратковременным. Возможно, что в неравновесных условиях взаимоотношения между ацетилхолином, тубо-курарином и холинорецепторами будут отличаться от взаимоот-
ношении, установленных для равновесных условий.
Тубокурарин, так же как и другие используемые в настоящее время миорелаксанты, не обладает всеми качествами, необходимыми для "идеального" миорелаксанта. Поэтому химиками и фармакологами непрерывно ведется поиск новых миорелаксантов, обладающих лучшими характеристиками. Нашей лабораторией совместно с лабораторией синтеза лекарственных веществ (зав. -чл.-корр. MSB. СССР Н.В.Хромов-Борисов) Института экспериментальной медицины .АМН СССР недавно был предложен для клинического применения новый высокоактивный миорелаксант ТЕРКУ-РОНИЙ. По ряду свойств теркуроний превосходит тубокурарин и панкуроний. В настоящей работе впервые было проведено исследование механизма действия теркурония на нервно-мышечную передачу электрофизиологическими методами с применением микроэлектродов.
Основная цель работы. Исследовать закономерности преси-наптического и постсинаптического действия тубокурарина при различных условиях квантового выделения ацетилхолина.
Задачи исследования.
Исследовать влияние тубокурарина на частоту миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПШІ).
Исследовать закономерности изменения амплитуды ШШ1 в зависимости от концентрации тубокурарина в растворе.
Исследовать закономерности изменения амплитуды потенциалов концевой пластинки (ПШІ) в зависимости от концентрации тубокурарина в растворе в условиях редкой стимуляции нерва.
Исследовать влияние тубокурарина на квантовое выделение
ацетилхолина при частой стимуляции нерва. 5. Провести сравнительное исследование действия тубокурарина и нового миорелаксанта теркурония при квантовом выделении ацетилхолина.
Вся работа выполнена на нервно-мышечных препаратах кож-но-грудинной мышцы лягушки.
Результаты проведенного исследования.
Показано, что тубокурарин в концентрациях от 5.І0""8 до 2.10 М не влияет на спонтанное квантовое выделение ацетилхолина.
Исследована зависимость изменения амплитуды МШШ от концентрации тубокурарина в растворе в диапазоне концентраций от 5.І0""8 до 2.ІСГ6 М.
При частоте стщуляции нерва 0,5-1 имп/с исследована зависимость изменения амплитуды ПКП от концентрации тубокура-
рина в растворе в диапазоне концентраций от I.10 М до 5.ЛГ6 М.
4. Показано, что при небольшой частоте стшуляции нерва,
0,5 - II имп/с, тубокурарин не влияет на квантовое выделение ацетилхолина.
Показано, что при частотах стимуляции нерва 25, 20 и 10 имп/с тубокурарин уменьшает квантовое выделение ацетилхолина.
Исследовано влияние теркурония в концентрациях от 5.10 М до 2.10""' М на частоту и амплитуду ЗШКП, а также на амплитуду и квантовый состав ПШІ при редкой стимуляции нерва.
Научная новизна. Впервые проведено систематическое иссле-
дование количественных закономерностей постсинаптического действия тубокурарина при квантовом выделении ацетилхолина из нервного окончания. Показано, что при концентрациях тубо-курарина, не превышающих 5.10 М, уменьшение амплитуды ШЖП и ГШП в его присутствии обусловлено конкурентным действием
_7 тубокурарина. При концентрациях тубокурарина больше 5.10 М
амплитуда МПКП и ПКП уменьшается значительно сильнее, чем это следовало бы ожидать, исходя из представления о конкурентном механизме действия тубокурарина. Предложен способ определения константы сродства миорелаксантов по изменению амплитуды МПКП в их присутствии. Предложен способ изучения действия больших концентраций миорелаксантов на амплитуду ПКП. Показано, что пресинаптическое действие тубокурарина имеет место только при большой частоте раздражения нерва. Впервые было проведено микроэлектрофизиологическое исследование фармакологических свойств нового миорелаксанта терку-рония. Показано, что теркуроний является миорелаксантом не-деполяризующего типа действия. В опытах на нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы лягушки его активность в 2,5 раза превосходит активность тубокурарина.
Теоретическое и практическое значение. Получены новые данные, которые расширяют существующие представления о механизме действия миорелаксантов. В физиологических условиях блок нервно-мышечной передачи, вызванный тубокурарином, обусловлен его одновременным действием на постсинаптические и пресинаптические структуры. Постсинаптическое действие является преобладающим в общем механизме действия тубокурарина. Однако факт пресинаптического действия также необходимо учитывать при использовании тубокурарина в физиологических и
- II -
фармакологических исследованиях, а также при использовании тубокурарина в медицинской практике.
Положения, выдвигаемые на защиту.
При концентрациях тубокурарина,не превышающих 5.10 М, уменьшение амплитуды МПШ в его присутствии определяется конкурентным действием тубокурарина.
При концентрациях тубокурарина выше 5.10 М уменьшение амплитуды МПШ в его присутствии определяется не только конкурентным действием тубокурарина, но также дополнитель-
,_анш факторами.
Тубокурарин не влияет на квантовое выделение ацетилхолина при низкой частоте стимуляции нерва.
При большой частоте стимуляции нерва тубокурарин уменьшает квантовое выделение ацетилхолина из нервного окончания.
Диссертация была выполнена в лаборатории фармакологии биологически активных веществ ( зав. - доктор медицинских наук, профессор А.Ф.Данилов ) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова АН СССР ( директор - член-корр. АН СССР, В.Л.Свидерский ).
Функциональная организация нервно-мышечного синапса
Нервное волокно при подходе к мышечному теряет миелино-вую оболочку и разветвляется на тонкие веточки диаметром I -3 мкм, которые располагаются в мелких бороздках на поверхности мышечного волокна. В нервно-мышечном синапсе лягушки длина нервных веточек может достигать 100 мкм, на всем этом протяжении нерв образует синаптическое соединение с мышечным волок ном ( см. Katz, 1968; Магазаник, 1979 ).
Мембраны нервного окончания и мышечного волокна разделены межклеточным пространством, получившим название первичной синаптической щели, ширина ее 20 - 50 нм. Пресинап-тическая и постсинаптическая мембраны прочно связаны между собой базальной мембраной, которая является производной мышечной клетки и располагается в первичной синаптической щели. На базальной мембране сосредоточена основная часть хо-линэстеразы - фермента, гидролизущего ацетилхолин.
Мембрана мышечного волокна образует множество мелких постсинаптических складок, которые идут перпендикулярно оси нервного окончания со средним интервалом 0,7 мкм и открываются в первичную синаптическую щель. Полости, образованные постсинаптическими складками, называют вторичной синаптической щелью ( магазаник, 1979; Peper et al., 1982 ).
Пресинаптическая мембрана имеет утолщения, возле которых отмечается скопление еинаптических пузырьков. Эти участки называются активными зонами выделения, они располагаются над устьями постсинаптических складок ( Hubbard, Kwanbunbumpen, 1968; Dreyer et al., 1973; Akert, 1975 ).
Снаружи нервная терминаль покрыта телами шванновских клеток. Отростки этих клеток периодически, со средним интервалом 1-3 мкм, проникают в пространство между нервным окончанием и мышечным волокном, разделяя первичную синаптическую щель на множество ячеек. В нервно-мышечном синапсе фазного мышечного волокна амфибий насчитывается от 300 до 1000 таких ячеек. Каждая ячейка содержит I, 2, реже 4 активные зоны. Общее число активных зон в одном синапсе может достигать 2000. Каждая активная зона ведет себя как само стоятельный синапс ( Wernig, 1976 ).
В общих чертах процесс передачи возбуждения с нервного волокна на мышечное состоит в следущем. Потенциал действия деполяризует мембрану нервного окончания. Это ведет к выделению ацетилхолина из терминали в синаптическую щель. Аце-тилхолин диффундирует в синаптической щели и достигает поверхности мышечного волокна. При взаимодействии ацетилхолина с холинорецепторами открываются ионные каналы постсинап-тической мембраны для ионов натрия и калия. Движение ионов в соответствии с их электрохимическими градиентами ведет к деполяризации постсинаптической мембраны. В том случае, если деполяризация превысит определенный уровень, происходит возбуждение участков мышечной мембраны, расположенных рядом с синапсом. Мышечный потенциал действия распространяется к концам мышечного волокна и вызывает его сокращение.
Ацетилхолин синтезируется в аксоплазме нервного окончания из ацетшгкоэнзима-А и холина. Катализируется эта реакция ферментом холин-ацетилтрансферазой ( ХАТ ). ХАТ образуется в теле нервных клеток и поставляется в нервные окончания током аксоплазми ( Tucek, 1975 ) ХАТ находится во всех частях холинергических нейронов (включая дендриты), но синтез ацетилхолина проходит с наибольшей скоростью в пре-синаптических нервных окончаниях, т.е. в непосредственной близости от мест освобождения ацетилхолина во время синаптической активности ( Kasa et al., 1970; Houser et al., 1983 ). ХАТ находится в нервных окончаниях главным образом в растворенном состоянии в аксоплазме, но возможно, что часть молекул фермента адсорбирована на внутренней стороне мембраны нервных окончаний и на мембранах внутри нервных окончаний ( Foniram, 1968; Fonnum, Malthe-Strenssen, 1972 ). Ацетил-КоА образуется непосредственно в нервных окончаниях. В мозге млекопитающих главным источником ацетил-КЬА для синтеза ацетилхолина являются глюкоза и пируват. Ацетил-КоА образуется в митохондриях нервных окончаний и затем транспортируется в аксоплазму ( Tucek, Cheng, 1970, 1974 ). В тканях холоднокровных митохондрии, вероятно, играют значительно меньшую роль в поставке ацетил-КоА для синтеза ацетилхолина, важным источником ацетильных групп здесь является ацетат ( Israel, Tucek, 1974 ).
Нервно-мышечный препарат и растворы
Регистрацию М0КЇЇ и ПКП производили внутриклеточно с помощью стеклянных микроэлектродов по стандартной методике (Patt, Katz, 1951 ) Использовали микро электроды с внутренними капиллярами ( Tasaki et al., 1968), заполненные 2,5 М хлористым калием. Сопротивление микроэлектродов было в пределах 15 - 40 МОм. Нерв раздражали через всасывающий электрод прямоугольными импульсами, подаваемыми от электростиму лятора ЭСЛ-2 через изолирующий трансформатор. Длительность импульсов была 0,1 мс, амплитуда импульсов превышала пороговую в 2 - 3 раза. Местонахождение концевой пластинки определяли по максимальной амплитуде и минимальной длительности регистрируемых потенциалов.
Для усиления потенциалов мышечного волокна использовали транзисторный усилитель с коэффициентом усиления 50 и полосой пропускания 0-2 000 гц. Для согласования восокоомно-го микро электрода со входом усилителя использовали истоковыи повторитель с компенсацией входной емкости. Визуально синап-тические потенциалы наблюдали на экране осциллографа CI-I8.
Для измерения амплитуды и частоты МШШ, амплитуды и временных параметров ШШ наблюдаемые потенциалы записывали с экрана осциллографа на фотопленку с помощью фоторегистратора Ф0Р-2. Одновременно с этигл производилось автоматическое измерение амплитуды и частоты потенциалов. Автоматическая система измерения амплитуды МИШ и ШШ состояла из цифрового вольтметра типа Ф-200, пересчетного прибора ПС02-08 и электронной схемы, представляющей собой пороговое устройство и устройство для запоминания пиковой амплитуды потенциалов. Частоту МШШ определяли с помощью пересчетного прибора ШІ-І5А, на который подавали импульсы от порогового устройства измерителя амплитуды. Приборы для регистрации и автоматического измерения амплитуды и частоты синаптических потенциалов были разработаны и изготовлены сотрудником нашей лаборатории А.И.Скляровым.
II. Пересчетный прибор ПП-І5А.
А - система автоматического измерения амплитуды потенциалов. Б - система автоматического измерения частоты потенциалов. литуду МПКП, необходимо учитывать, что в присутствии этих веществ МПКП, имеющие небольшую амплитуду, могут полностью исчезать в шумах. В этом случае при определении действия вещества на частоту и амплитуду МТШІ возможно появление ошибок. Исчезновение части МИШІ в шумах будет проявляться как уменьшение частоты МПКП. Измеренная средняя амплитуда МПКП при исчезновении части МПКП в шумах будет завышенной, а количественный эффект вещества будет оценен в этом случае слабее фактического.
Для того, чтобы избежать этой ошибки, в настоящей работе при исследовании действия миорелаксантов был принят ряд мер, направленных в основном на то, чтобы увеличить амплитуду МПКП и снизить уровень шумов.
1. Для опыта отбирались микроэлектроды, имеющие небольшой собственный шум. В большинстве опытов собственный шум мик роэлектродов суммарно с шумом мембраны не превышал 20 - 30 мкв.
2. Как известно, амплитуда МПШІ тем больше, чем меньше диа метр мышечного волокна. ( Katz, Thesleff, 1957а ). Для то го, чтобы исследования проводить на МПКП достаточно большой амплитуды ( стремились к тому, чтобы средняя амплитуда МПКП была около I мв ) микро электроды вводили в тонкие мышечные волокна ( диаметр 30 - 40 мкм ). У лягушек средних размеров, 30 - 40 г, таких волокон мало, поэтому для опытов отбирали мелких лягушек, весом примерно 15 г.
3. Выбирали мышечные волокна, в которых не было большого раз броса величины амплитуды МПКП, все регистрируемые МПКП име ли амплитуду, близкую по величине к средней амплитуде. Ес ли указанные условия соблюдались, то, даже при уменьшении амплитуды МПКП в 2 раза, ошибка вследствие исчезновения потенциалов в шумах практически сводилась к нулю.
В некоторых опытах при определении исходной амплитуды МПКП в расчет не принимались те МПКП, которые заведомо должны исчезнуть в шумах.
При определении эффекта миорелаксанта измеряли среднюю амплитуду МПКП в исходном растворе, затем в растворе с мио-релаксантом после полного развития эффекта и после отмывания. Если после отглывания средняя амплитуда МПКП отличалась от средней амплитуды МПКП в исходном растворе больше, чем на 15 % , то такой опыт в расчет не принимался. Если различие между исходной амплитудой МПКП и амплитудой МПКП после отмывания не превышало 15 % , то для дальнейших расчетов брали их среднюю величину. Характеристикой эффекта миорелаксанта служило отношение средней амплитуды МПКП в растворе, содержащим миорелаксант, к усредненной амплитуде МПКП в нормальном растворе. Одновременно с измерением амплитуды МПКП производилось измерение их частоты.
ПКП. При исследовании действия миорелаксантов на амплитуду и квантовый состав ПКП были использованы два способа блокирования мышечных сокращений. Первый - уменьшение в растворе концентрации ионов кальция до 0,5 мМ и добавление ионов магния до 2,0 мМ. Второй - поперечное рассечение мышечных волокон ( Barstad, 1962 ). Функция пресинаптического аппарата при этом не нарушается ( Волкова и др., 1975 ). Уменьшение амплитуды ПКП в присутствии миорелаксанта оценивали так же, как и в опытах с МПКП. Для определения средней амплитуды ПКП брали 200 - 300 потенциалов, раздражение нерва проводили с частотой 0,5-1 имп/с.
Скорость развития эффекта тубокурарина
Как уже было сказано в гл. 2, опыты проводили при непрерывном протоке раствора через ванночку. Скорость протока была 2 - 3 мл в минуту, рабочий объем ванночки был пржлерно I мл. В этих условиях эффект тубокурарина полностью развивался в течение 8 - 10 минут (Рис. 4). Отмывание нервно--мышечного препарата от .тубокурарина проходило примерно с такой же скоростью, как и развитие эффекта. 10-минутного интервала было достаточно для восстановления амплитуды МЛЕЛ до исходного уровня. Вероятно, это связано с тем, что грудная мышца лягушки имеет всего несколько слоев мышечных волокон, и диффузия из глубины мышцы незначительно удлиняет время отмывания нервно-мышечного препарата.
С момента выделения нервно-мышечного препарата до начала опыта проходило обычно 20 - 30 минут, необходимых для того, чтобы разместить и закрепить мышцу в ванночке и найти волокно, миниатюрные потенциалы которого удовлетворяли бы требуемым условиям. В начале опыта частота МПКЕІ обычно была невелика: 0,2 - 0,3 имп/с. Для того, чтобы набрать 100 -- 150 потенциалов, необходимых для определения средней частоты и амплитуды МПКП, требовалось 10 - 15 минут. Небольшая частота МЇЇКП, вероятно, связана с тем, что в тонких мышечных волокнах общая длина моторных нервных окончаний невелика, а значит, и число активных зон выделения также невелико.
В ходе опыта частота МЛЕЛ, как правило, возрастала Скорость развития эффекта тубокурарина ( отдельный опыт). По оси ординат слева отложена амплитуда МПШ, справа -частота МПШ. По оси абсцисс - время наблюдения в минутах. Вверху показано изменение амплитуды МПШ в ходе опыта, внизу - частоты МШШ.
Стрелкой отмечены момент подачи раствора с тубокураржном и начало отмывания. и через 3-4 часа после начала опыта частота МПКП составляла уже несколько импульсов в секунду. В дальнейшем нарастание частоты МПКП становилось лавинообразным. Как талько частота МПКП начинала превышать 2-3 имп/с опыт прекращали, считая, что функциональное состояние такого нервно-мышечного препарата уже нарушилось.
При замене нормального раствора на раствор, содержащий тубокурарин, частота МПКП, как правило, не изменялась. Однако в некоторых опытах наблюдалось уменьшение или увеличение частоты МПКП. В среднем оказалось, что в присутствии тубокурарина частота МПКП практически не меняется. Результаты этих опытов представлены в таблице I.
При замене нормального раствора на раствор, содержащий тубокурарин, амплитуда МПКП уменьшалась. Как уже было сказано, для полного развития эффекта было достаточно 10 минут. Зависимость эффекта тубокурарина от его концентрации показана на рисунке 5. диапазон исследованных концентра о с ций тубокурарина от 5.10"" М до 2.ІСГ М. Амплитуда МПКП в присутствии тубокурарина дана на графике как доля от амплитуды МПКП в исходном растворе. Шкала концентраций на этом графике логарифмическая. В этих координатах для кон-центраций тубокурарина больше 2.10""f М зависимость его эффекта от концентрации линейная, для концентраций тубокурарина меньше 2.10 М наблюдается отклонение от линейной зависимости. Результаты этих опытов представлены также в таблице 2.
"Прямой" и "поэтапный" методы определения эффекта тубокурарина
Необходимым условием исследования действия миорелаксантов на амплитуду ПКП является устранение мышечных спайков. Один из способов устранения глышечных спайков состоит в том, что уменьшается концентрация ионов кальция в растворе и добавляются ионы магния. В наших опытах добавление в раствор хлористого магния до концентрации 1,5 - 2,0 мМ при концентрации ионов кальция 0,5 мМ приводило к развитию нервно--мышечного блока.
При определении действия тубокурарина измеряли среднюю амплитуду ПКП в растворе Рингера, затем в растворе Рингера, содержащем тубокурарин, и затем вновь в растворе без тубокурарина (подробно об этом сказано в главе Методика). Ионный состав растворов был одинаковым. Таким методом исследовали действие тубокурарина в диапазоне концентраций от І.І0Г М до 2.10 М. Частота стимуляции нерва в этих опытах была 0,5-1 имп/с. Результаты опытов представлены в таблице 4.
Такой метод удобен при изучении действия небольших концентраций миорелаксантов, снижающих амплитуду ПКП не более, чем в два раза. В этом случае можно ограничиться небольшой исходной амплитудой ПКП, 2 - 4 мв, что позволяет при определении средней амплитуды ПКП обойтись без поправки на нелинейную суммацию квантов, величина которой сама по себе остается спорной (Martin, 1955; I966;Wernig , 1975; Quastel , I979;McLachlan , Martin , 1981). При исследовании же больших концентраций миорелаксантов такой метод оказался неудобным вследствие большого перепада амплитуд ШШ в исходном растворе и в растворе, содержащем миорелаксант. При этом снижается точность измерений как больших ПКП (увеличивается величина поправки на нелинейную суммацию), так и самых.маленьких (возрастает вклад в их величину мембранных шумов).
В наших опытах при изучении действия высоких концентра-ций тубокурарина (выше 5.10 М) был использован другой метод оценки эффекта миорелаксанта. Этот метод сводится к тому, что определяется изменение амплитуды ПКП в присутствии исследуемой концентрации тубокурарина относительно амплитуды ПКП в растворе, тоже содержащем тубокурарин, но в меньшей концентрации, эффект которой уже известен. Этот второй метод отчасти является дополнительным к первому методу.
Так, первым методом, который можно назвать "прямым" методом оценки эффекта миорелаксанта, было определено, что в концентрации 5.10 М тубокурарин уменьшает амплитуду ПКП до 0,49 от ее величины в нормальном растворе (Табл. 4).
Это значение служило точкой отсчета для второго метода. -7 В растворе, содержащем тубокурарин в концентрации 5.10 М, подбирали концентрации ионов кальция и магния так, чтобы амплитуда ПКП была в пределах I - 3 мв. Обычно такие условия создавались при концентрации ионов кальция в растворе 0,5 мМ и ионов магния 1,0 мМ. При исследовании действия тубокурарина в концентрации 1.10 М определяли среднюю амплитуду ПШІ в растворе, содержащем тубокурарин в концент 7 рации 5.10 М, затем этот раствор заменяли на раствор того же ионного состава, но содержащий тубокурарин в концентрации 1.10 М, определяли среднюю амплитуду ПКП и затем 7 вновь давали раствор с тубокурарином в концентрации 5.10 М. По результатам наших опытов оказалось, что тубокурарин в концентрации 1.10 М снижает амплитуду ПКЕІ до 0,58 от ее величины в растворе, содержащем тубокурарин в концентрации —7 5.10 М (Табл. 4). Для того, чтобы получить полный эффект тубокурарина в концентрации 1.10 М необходимо величину 0,58 умножить на 0,49 (эффект концентрации 5.10 М). Перемножение этих величин дает значение 0,28. Это означает, что тубокурарин в концентрации 1.10 М уменьшает амплитуду ПШІ до 0,28 от ее величины в растворе, не содержащем тубокурарин.
Действие тубокурарина в концентрации 2.10 М оценивали относительно раствора с концентрацией тубокурарина І.І0"6 М, действие тубокурарина в концентрациях 3.10 М и 5.10 М -относительно концентрации 2.I0"6 М. Результаты опытов представлены в таблице 4. Второй метод оценки действия миоре-лаксантов можно назвать "поэтапным".
