Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Аллатостатины: структура, представительство, функциональные свойства... 9
1.1 Характеристика пептидного семейства аллатостатинов 9
1.2 Доменная организация молекул аллатостатинов 10
1.3 Аллатостатины у насекомых и других беспозвоночных 11
1.4 Локализация и функциональные свойства аллатостатинов 13
1.4.1 Блокада синтеза ювенильного гормона 14
1.4.2 Торможение сокращения висцеральной мускулатуры 16
1.5 Возможность присутствия аллатостатинов у позвоночных 20
1.6 Ал латостатиновые рецепторы 21
2. Проктолин -структура, представительство, функциональные свойства 23
2.1 Структура молекулы проктолина 23
2.2 Локализация и функциональная активность
проктолина у членистоногих 24
2.2.1 Действие проктолина на активность нейронов членистоногих 25
2.2.2 Миостимулирующее действие проктолина на висцеральную мускулатуру членистоногих 26
2.2.3 Стимулирующее действие проктолина на сокращение
скелетной мускулатуры членистоногих 28
2.3 Проктолиновые рецепторы 31
2.4 Локализация и физиологическая активность проктолина
у млекопитающих 32
ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ 34
1. Скелетные мышечные волокна равноного морского рака Idotea baltica 34
1.1 Методика получения изолированных мышечных волокон baltica
1.2 Регистрация сократительных ответов изолированных мышечных волокон /. baltica 35
2. Нервно-мышечный синапс краба Eriphia spinifrons 37
2.1 Методика получения изолированного нервно-мышечного препарата Е. spinifrons 37
2.2 Внеклеточная регистрация вызванных постсинаптических токов в нервно-мышечном синапсе Е. spinifrons 38
3. Нервно-мышечный синапс диафрагмы мыши 41
3.1 Приготовление изолированного нервно-мышечного препарата диафрагмы мыши 41
3.2 Внутриклеточная регистрация спонтанных и вызванных потенциалов и токов концевой пластинки 42
4. Статистическая обработка экспериментальных данных 44
5. Используемые в работе вещества 45
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 46
1. Действие аллатостатина и проктолина на сокращение изолированных мышечных волокон рака Idotea baltica 46
1.1 Воздействие аллатостатина на сократительную активность скелетных мышечных волокон рака I. baltica 46
1.2 Воздействие проктолина на сократительную активность мышечных волокон и его взаимодействие с аллатостатином 51
2. Воздействие аллатостатина и лроктолина на синаптическую активность нервно-мышечного препарата краба Eriphia spinifrons 58
2.1. Влияние аллатостатина на вызванные и спонтанные постсинаптические токи краба Е. spin ifrons 60
2.2. Влияние проктолина на вызванную активность моторных синапсов краба Е. spinifrons 64
2.3. Анализ взаимодействия эффектов аллатостатина и проктолина на
уровне моторных синапсов , spinifrons 66
3. Исследование роли пресинаптических Са -каналов в реализации облегчающих эффектов проктолина в моторных синапсах краба 71
3.1. Исследование роли Са2+-каналов L-типа в эффектах проктолина 72
3.2. Исследование роли Са2+-каналов N-типа в эффектах проктолина 74
3.3. Исследование роли Са2+-каналов P/Q-типа в эффектах проктолина 77
4. Анализ структурного сходства проктолина и аллатостатина с белками млекопитающих и данных биотестирования пептидов у млекопитающих 87
5. Анализ воздействий проктолина на работу моторных синапсов мыши 90
5.1. Влияние проктолина на спонтанную активность нервно-мышечных синапсов диафрагмы мыши 90
5.2 Влияние проктолина на частоту миниатюрных токов концевой пластинки в условиях калиевой деполяризации терминали с помощью 20 мМ [К+]нар. 94
5.3. Действие проктолина на вызванную активность нервно-мышечных синапсов мыши 98
6. Действие аллатостатина на спонтанную и вызванную активность активность нервно-мышечных синапсов мыши 105
6.1 Доза зависимое воздействие аллатостатина на амплитуду и временной ход миниатюрных потенциалов концевой пластинки мыши 105
6.2 Анализ возможных постсинаптических эффектов аллатостатина на примере миниатюрных токов концевой пластинки мыши 112
6.3. Действие аллатостатина на вызванную активность нервно-мышечных синапсов диафрагмы мыши 117
6.4 Анализ изменений амплитуды МПКП, вызываемых аллатостатином, на фоне предварительного введения везамикола (АН5183) 120
6.5 Влияние аллатостатина на амплитуду МТКП на фоне действия ингибитора протеинкиназы А (ПКА) - Н-89, , 121
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ 137
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
В современной физиологии большой интерес вызывают исследования новых регуляторных пептидов, выделяемых из нервной ткани разных групп беспозвоночных и позвоночных животных. К их числу относятся аллатостатины - семейство структурно сходных пептидов, экстрагированных из мозга таракана Diploptera punctata (Woodhead et al., 1989; Pratt et al., 1991). У двукрылых насекомых аллатостатины регулируют метаморфоз, тормозя синтез говенильного гормона в corpora allata (Stay et al., 1994). Однако у других групп членистоногих - насекомых и ракообразных - эти же пептиды выполняют иные функции, в частности, модулируют моторику кишечника (Skiebe, Schneider, 1994), активность ганглиев (Lange et al., 1993). Реальный спектр функциональной активности и представительства этой новой группы пептидов в животном царстве остается пока не изученным.
Аналогичная картина характерна и для проктолина - пентапептида, впервые выделенного как «кишечный фактор» у таракана Periplaneta americana (Brown, 1967). Впоследствии удалось установить, что проктолин присутствует и у других членистоногих, в частности, в составе мотонейронов ракообразных, и способен усиливать тонус висцеральной и скелетной мускулатуры ракообразных (Schwarz 1980; Pastzor, Golas, 1993).
Несмотря на данные о миотропных эффектах проктолина и аллатостатинов, систематический анализ особенностей их действия на мускулатуру и моторные синапсы членистоногих до сих пор не проводился. Не ясны и пути дальнейшей эволюции этих пептидов - в частности, возможность сохранения самих пептидов либо их рецепторов в составе нервной системы позвоночных. Имеются данные о способности проктолина и аллатостатина потенциировать сокращение желудка и кишечника у млекопитающих (Schulz et al., 1981; Gaydukov et al., 1998). Возможность же модулирующих воздействий этих пептидов на моторные синапсы млекопитающих остается не изученной. Подобные сравнительные исследования представляются весьма актуальными в связи с ростом случаев обнаружения нейропептидов беспозвоночных и в нервной системе высших позвоночных, где они могут иметь физиологическую активность, сходную либо отличную от таковой у низших животных (Ашмарин, Каменская, 1988; Schoofs et al., 1993; Гомазков, 1995).
Цели и задачи исследования. Целью данной работы был сравнительный анализ действия аллатостатина и проктолина на мускулатуру и моторные синапсы ракообразных и млекопитающих. Для этого в работе решались следующие конкретные задачи:
1. исследовать эффекты аллатостатина и проктолина как модуляторов сократительной активности скелетных мышечных волокон ракообразных (морского рака Idotea baltica).
2. сопоставить характер воздействия аллатостатина и проктолина на моторные синапсы ракообразных и механизмы противоположно направленных синаптических эффектов пептидов.
3. выявить влияния аллатостатина и проктолина на моторные синапсы млекопитающих - на примере спонтанной и вызванной активности синапсов диафрагмы мыши.
4. изучить механизмы облегчающего действия проктолина на частоту спонтанных и амплитуду вызванных сигналов моторных синапсов диафрагмы мыши.
5. понять: пре- или постсинаптические структуры ответственны за прирост амплитуды миниатюрных потенциалов концевой пластинки мыши, вызываемый действием аллатостатина?
6. рассмотреть вклад пресиналтических внутриклеточных каскадов (с участием протеинкиназы А и других факторов) в увеличение размера кванта медиатора, вызываемое аллатостатином.
