Введение к работе
Актуальность проблемы.
Вся совокупность генов и транскрибируемых областей генома многоклеточных организмов связана в сложнейшую регулируемую сеть, определяющую существование многочисленных типов специализированных клеток. Первостепенную роль в существовании этой регулируемой сети играют различные классы цис-регуляторных элементов генома. После определения полной нуклеотидной последовательности геномов ряда организмов одной из главных задач современной геномики стало изучение функциональных некодирующих элементов генома, таких как промоторы, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, S/MAR-элементы и др.
Известно, что функциональная активность регуляторного элемента генома зависит не только от его нуклеотидной последовательности, но и от специфического набора связывающихся с ними белковых факторов транскрипции, модификации ДНК этого элемента, положения данной последовательности на хромосоме, структурной компартментализации ядра и др. По этим причинам, несмотря на стремительное развитие методов биоинформатики, использование компьютерных подходов для предсказания положения в геноме цис-регуляторных элементов крайне затруднительно.
Согласно теоретическим предсказаниям в геномах эукариотических организмов содержатся сотни тысяч цис-регуляторных последовательностей (Pennisi, 2004). Поэтому создание подходов, позволяющих осуществить как масштабный поиск этих элементов в геноме, так и их функциональный анализ, является одним из приоритетных направлений современной функциональной геномики.
В последнее время было предложено большое число различных экспериментальных подходов для идентификации регуляторных последовательностей внутри генома. Во всех этих подходах используется один и тот же ключевой этап - получение высокообогащенных клонотек фрагментов ДНК, содержащих соответствующие регуляторные элементы. После конструирования таких клонотек нахождение их места в геноме становится чисто технической задачей и может быть осуществлено при помощи различных технологий, таких как гибридизация с геномными микрочипами, массированное секвенирование, технологии, сходные с SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) и др. Эти подходы можно разделить на две группы. В первую входят методы, которые можно назвать структурными, т.е. методы, основанные на взаимодействии ДНК с белками или субклеточными структурами, а также на структурных особенностях ДНК. В данной работе были задействованы функциональные подходы, относящиеся ко второй группе методов, обычно использующих “метод репортерного гена”.
К сожалению, на сегодняшний день картирование всех функциональных областей на уровне целого генома с учетом всевозможных типов клеток многоклеточных организмов выходит за пределы наших возможностей. Поэтому, альтернативой данного рода исследованиям служит полный функциональный анализ отдельных протяженных сегментов генома с последующей интеграцией полученных данных и созданием полной геномной карты регуляторных элементов.
В нашей лаборатории проводится работа по построению полной функциональной карты регуляторных последовательностей, расположенных в полигенном сегменте длиной 1 млн. п.о. хромосомы 19 человека. Ранее в этом локусе нами были идентифицированы и нанесены на карту около сотни последовательностей, относящихся к различным классам функциональных элементов генома, что делает исследуемый нами локус одним из наиболее охарактеризованных участков генома человека.
Данная диссертационная работа состоит из трех частей. В первой части описан подход, позволяющий проводить скрининг геномных фрагментов по их способности усиливать экспрессию репортерного гена (потенциальные энхансеры) и определять их местоположение в геноме. С помощью этого метода нами были обнаружены и картированы 15 потенциальных энхансеров в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека. Во второй части работы с помощью ранее разработанной методики (Akopov et al., 2006) произведено картирование в том же локусе десяти новых последовательностей, проявляющих инсуляторную активность. Третья часть посвящена анализу энхансер-блокирующей активности десяти обнаруженных ранее в исследуемом локусе CTCF-связывающих последовательностей (Vetchinova et al., 2006). Было показано, что все десять проверенных CTCF-связывающих последовательностей проявляют энхансер-блокирующую активность в системе позитивно-негативной селекции.
Цели и задачи работы.
Целью диссертационной работы являлось выявление и картирование цис-регуляторных элементов (энхансеры, инсуляторы) в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека, а также выявление энхансер-блокирующей функции десяти ранее обнаруженных в исследуемом локусе CTCF-связывающих фрагментов (Vetchinova et al., 2006) с помощью позитивно-негативной селекции.
В ходе работы были поставлены следующие задачи:
1. С помощью предложенного нами подхода выявить и картировать в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека последовательности, проявляющие свойства энхансеров.
2. Провести анализ обнаруженных фрагментов методом сдвига электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле (EMSA), а также определить активность обнаруженных фрагментов с помощью системы двойной люциферазной детекции.
3. Выявить с помощью ранее разработанной в лаборатории системы позитивно-негативной селекции энхансер-блокирующих элементов все, или почти все, потенциальные инсуляторы, расположенные в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека.
4. Проверить на наличие энхансер-блокирующей активности десять ранее выявленных CTCF-связывающих последовательностей, расположенных в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В работе разработан оригинальный метод функционального картирования энхансер-подобных элементов в протяженных участках генома, основанный на отборе геномных фрагментов по их способности усиливать транскрипцию репортерного гена. С помощью предложенного подхода впервые идентифицированы в клетках культуры HeLa 15 потенциальных энхансеров в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека. Было показано, что идентифицированные последовательности взаимодействуют in vitro с белками ядерного экстракта HeLa. Для 13 обнаруженных последовательностей была показана способность активировать сильный промотор SV40 при транзиентной трансфекции клеток HeLa с использованием системы двойной люциферазной детекции. Была построена карта распределения обнаруженных в работе потенциальных энхансеров в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека.
С помощью ранее разработанной методики идентификации потенциальных инсуляторов (Akopov et al., 2006) выявлены и картированы 10 новых последовательностей в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека. Был проведен исчерпывающий анализ полученной в работе библиотеки потенциальных инсуляторов, позволивший обнаружить в исследуемом локусе большую часть последовательностей, проявляющих свойства инсуляторов.
В работе с помощью системы позитивно-негативной селекции был проведен анализ энхансер-блокирующей активности десяти CTCF-связывающих последовательностей, картированных ранее в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека.
Данная диссертационная работа является частью масштабной работы, направленной на создание полной функциональной карты области хромосомы 19 человека длиной 1 млн. п.о.
Публикации и апробация работы.
По теме диссертационной работы опубликованы 3 статьи в отечественных и зарубежных научных журналах. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов–2008” (Москва, 2008); IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); 3rd ESF Functional Genomics Conference “Functional genomics and Disease” (Инсбрук, 2008); XXI Зимняя международная молодежная научная школа “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва-Пущино, 2009).
Структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на … страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка цитируемой литературы, включающего … ссылки. Диссертация содержит … таблиц и … рисунков.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КАРТИРОВАНИЕ ЭНХАНСЕР-ПОДОБНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ЛОКУСЕ FXYD5-COX7A1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА.
Энхансеры – тип регуляторных элементов генома, способных усиливать транскрипцию с промоторов, находясь на значительных расстояниях от них. Для многих энхансеров показана их способность активировать гетерологичные промоторы. Основываясь на этих свойствах энхансеров, нами предложен метод, позволяющий идентифицировать энхансеры в протяженных участках генома по способности этих элементов активировать транскрипцию гена неомицинфосфотрансферазы II (NPTII), находящегося под контролем минимального промотора цитомегаловируса (CMV). Схема метода изображена на рис. 1-Б.Энхансеры – тип регуляторных элементов генома, способных усиливать транскрипцию с промоторов, находясь на значительных расстояниях от них. Для многих энхансеров показана их способность активировать гетерологичные промоторы. Основываясь на этих свойствах энхансеров, нами предложен метод, позволяющий идентифицировать энхансеры в протяженных участках генома по способности этих элементов активировать транскрипцию гена неомицинфосфотрансферазы II (NPTII), находящегося под контролем минимального промотора цитомегаловируса (CMV). Схема метода изображена на рис. 1-Б (стр. 5).
На первом этапе работы нами был получен вектор pQCXIX-Enh, предназначенный для отбора геномных фрагментов, обладающих энхансерной активностью (Рис. 1-А). Вектор был сконструирован на основе самоинактивирующегося ретровирусного вектора pQCXIX (Clontech), и содержал ген составного белка GTN, в состав которого входила неомицинфосфотрансфераза II. Были получены контрольные векторные конструкции: положительный pQCXIX-Enh(+), содержащий ген GTN под контролем минимального промотора и энхансера CMV, и отрицательный pQCXIX-Enh(-), из которого был удален минимальный промотор CMV.
Подготовка и клонирование библиотеки геномных фрагментов в ретровирусный вектор pQCXIX-Enh.
Отбор фрагментов, обладающих энхансерными свойствами, проводили из фрагментов геномной библиотеки локуса FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека, любезно предоставленной И.П. Черновым. При конструировании библиотеки 30 космид, содержащих перекрывающиеся фрагменты исследуемого локуса длиной 1 млн. п.о., были обработаны ферментами рестрикции Sau3A и Csp6I, позволяющими получить фрагменты длиной от 200 до 700 п.о. Два фермента было использовано для того, чтобы исключить потери функциональных элементов из-за присутствия сайта расщепления внутри функциональной области фрагмента. К выступающим концам рестриктных фрагментов посредством специфических олигонуклеотидных адапторов был присоединен праймер LP, содержащий сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции SalI. Итоговая библиотека содержала около 4 тыс. уникальных фрагментов.
Фрагменты библиотеки клонировали по сайту XhoI в вектор pQCXIX-Enh. Было получено около 16 тыс. колоний E. coli, из которых была выделена плазмидная ДНК и получен пул плазмид pQCXIX-Enh(L), представляющий собой набор ретровирусных векторов pQCXIX-Enh(L), содержащих фрагменты библиотеки локуса FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека.
Отбор последовательностей ДНК, обладающих энхансерной активностью.
Набором плазмид pQCXIX-Enh(L), а также контрольными конструкциями, проводили трансфекцию клеток пакующей линии Phoenix-AMPHO (Kinsella and Nolan, 1996). Клетки линии Phoenix-AMPHO способны экспрессировать вирусные белки, необходимые для образования амфотропных вирусных частиц.
Были получены четыре популяции вирусных частиц: pQCXIX-Enh, pQCXIX-Enh(L), pQCXIX-Enh(+) и pQCXIX-Enh(-). Определение титра вирусных частиц проводили по экспресс-методу, предложенному в работе Byun et al. (Byun et al., 1996). Для каждой популяции титр составил не менее 5103 частиц/мл.
Полученными вирусными частицами инфицировали клетки линии HeLa. Выбор клеточной культуры был обусловлен тем, что ранее в нашей лаборатории были картированы в исследуемом локусе S/MAR-элементы (Chernov et al., 2002),а также участки связывания белка CTCF (Vetchinova et al., 2006) с использованием этой клеточной линии. Инфицированные клетки HeLa культивировали в среде с генетицином (800 мкг/мл) в течение двух недель.
В результате инфекции происходит интеграция кДНК-копии вирусной мРНК в геном хозяйской клетки. Если интегрированная кассета содержит фрагмент библиотеки, усиливающий активность гена селективного маркера (NPTII в составе белка GTN), т.е. проявляющий энхансерную активность, то содержащие такую конструкцию клетки выживают в среде с генетицином. После селекции клеток из них была выделена геномная ДНК и проанализирована с помощью двустадийной ПЦР (nested-PCR) с использованием внешних плазмидных праймеров (1L и 1R), а затем с помощью библиотечного праймера LP (Раунд 1, Рис. 2-А).
Известно, что интеграция ретровирусной ДНК происходит в основном в активно транскрибируемые области генома (Scherdin et al., 1990), поэтому гены, находящиеся в составе ретровирусного вектора, после интеграции в геном могут быть подвержены регуляции со стороны эндогенных цис-регуляторных элементов. Если таким элементом окажется энхансер, то в результате селекции отберутся фрагменты библиотеки, не обладающие энхансерной активностью (ложные энхансеры).
Чтобы снизить вероятность отбора ложных энхансеров мы проводили два раунда селекции. Для этого фрагменты библиотеки, амплифицированные с геномной ДНК популяции pQCXIX-Enh(L) после первого раунда селекции, снова клонировали в вектор pQCXIX-Enh. Количество выросших на этом этапе трансформантов составило около 10 тысяч. Из выросших клонов была выделена плазмидная ДНК, представляющая собой набор ретровирусных векторов с фрагментами библиотеки, прошедшими отбор в первом раунде селекции. Полученным набором векторов, а также контрольными векторами, снова трансфицировали клетки Phoenix-AMPHO и получали вирусные частицы. Полученными вирусными частицами инфицировали клетки HeLa для проведения второго раунда селекции.
После селекции из выживших клеток выделяли геномную ДНК и анализировали с помощью двухстадийной ПЦР (Раунд 2, Рис. 2-Б, стр. 8). На рисунке 2-Б видно, что на дорожке 4 (раунд 2) содержится меньше фрагментов ДНК, чем в исходной библиотеке (дорожка 2) и в библиотеке после первого раунда (дорожка 3), что свидетельствует об отборе последовательностей, обладающих энхансерной активностью.
Клонирование энхансер-подобных элементов и анализ выросших клонов E.coli.
Амплифицированные после второго раунда селекции фрагменты библиотеки клонировали в плазмидный вектор pGEM-T Easy (Promega), которым трансформировали клетки E. coli. Выросшие клоны ранжировали в двух 96-луночных планшетах. Таким образом, была получена библиотека (клонотека) потенциальных энхансеров.
Для исключения случайных (background) последовательностей, доля которых среди фрагментов незначительна, проводили анализ ранжированных клонов с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Для этого проводили ПЦР-амплификацию ДНК индивидуальных клонов с использованием праймера LP. Продукты ПЦР разделяли в 1% агарозном геле (Рис. 2-Б, верхняя панель), переносили на нейлоновую мембрану и проводили гибридизацию с меченой фракцией тотальной ДНК, содержащей фрагменты библиотеки после двух раундов селекции (Рис. 2-В, нижняя панель). В результате гибридизации были выделены клоны, дающие сильный гибридизационный сигнал. Такие клоны содержали последовательности библиотеки, в существенном количестве представленные во фракции ДНК, полученной после двух раундов селекции. Клоны, давшие слабый гибридизационный сигнал, были исключены из дальнейшего анализа.
Секвенирование библиотеки потенциальных энхансеров.
В результате секвенирования 50 клонов полученной библиотеки было обнаружено 15 различных последовательностей, 6 из которых встретились при анализе полученных данных один раз, 2 последовательности - два раза, 4 последовательности – три раза, 2 последовательности – четыре раза и одна последовательность двенадцать раз. Как видно из графика (Рис. 2-В), число обнаруженных уникальных последовательностей перестает увеличиваться с увеличением числа секвенированных клонов, поэтому появление новых энхансеров при дальнейшем секвенировании библиотеки маловероятно.
Свойства обнаруженных последовательностей представлены в таблице 1 (стр. 10).
Проверка способности обнаруженных последовательностей взаимодействовать с ядерными белками in vitro.
Активность регуляторного элемента зависит от специфического набора взаимодействующих ним белков. Поэтому способность формировать ДНК-белковые взаимодействия с ядерными белками является одним из критериев, по которому последовательность ДНК можно считать функциональным элементом. С помощью метода сдвига электрофоретической подвижности (EMSA), позволяющего выявить ДНК-белковые взаимодействия, нами была проверена способность идентифицированных фрагментов взаимодействовать с ядерными белками. Поскольку отбор энхансеров проводили с использованием клеточной линии HeLa, для EMSA-анализа нами был выбран ядерный экстракт, выделенный из клеток этой культуры по методу, предложенному в работе Дигнам (Dignam et al., 1983).
Таблица 1. Расположение потенциальных энхансеров в области FXYD4-COX7A1 хромосомы 19 человека.
*Данные по транзиентным трансфекциям в системе двойной люциферазной детекции (Рис. 3-Б).
**Согласно Human Genome Browser (сборка от марта 2006 г.).
***На расстоянии > 103 п.о. от ближайших генов.
Способность взаимодействовать с ядерными белками была проверена для нескольких идентифицированных фрагментов (фрагмент 7, 8, 10, 11 и 12). В качестве положительного контроля использовали последовательность энхансера цитомегаловируса, который активен в клетках HeLa, а значит, способен связывать ядерные белки этой клеточной линии.
Для того чтобы показать специфичность обнаруженных ДНК-белковых взаимодействий, в реакционные смеси с мечеными фрагментами ДНК добавляли в качестве конкурирующих те же немеченые фрагменты в трех- и шести- кратном избытке (Рис. 3-А, стр. 11). О специфичности судили по ослаблению зон торможения ДНК-белковых комплексов в результате конкуренции немеченных фрагментов с мечеными за связывание с белками. Все проверенные последовательности с высокой специфичностью образуют комплексы с белками ядерного экстракта HeLa. В то же время, добавление в реакционные смеси немеченого неспецифического конкурента (фрагмент промоторной области гена c-myc человека), взаимодействующего с ядерным белком CTCF (Filippova et al., 1996), не влияет на способность анализируемых фрагментов образовывать комплексы ДНК-белок (данные не представлены).
Как видно на рисунке 3-А, почти все из исследованных фрагментов образуют одну или более ярко выраженных зон торможения, что указывает на способность этих фрагментов взаимодействовать с белками ядерных экстрактов. ДНК-белковые комплексы некоторых фрагментов заметно отличаются по электрофоретической подвижности (например, фрагменты 7 и 8, 7 и 10), что указывает на то, что эти фрагменты связывают белки с разной молекулярной массой.
Проверка энхансерной активности обнаруженных фрагментов в системе двойной люциферазной детекции.
Энхансерная активность обнаруженных 15 последовательностей была проверена в системе двойной люциферазной детекции (Promega). Обнаруженные фрагменты клонировали по сайту Sal I в вектор pGL3-promoter (Promega). Полученными конструкциями проводили котрансфекцию клеток HeLa с нормирующей плазмидой pRL-TK c использованием реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Тринадцать из пятнадцати обнаруженных потенциальных энхансеров проявляют энхансерную активность в данной системе, усиливая активность гена люциферазы в 2-5 раз, что соответствует 15-30% от активности сильного энхансера SV40 (CV, Рис. 3-Б). Стоит подчеркнуть, что полученные значения активностей обнаруженных фрагментов могут не соответствовать активностям, которые проявляют эти фрагменты, располагаясь в геноме в своем нативном окружении. Кроме того, существуют указания на то, что промотор SV40 сам по себе обладает сильной активностью в клетках HeLa, обусловленной взаимодействием промотора с транскрипционным фактором Sp1 (Dynan and Tjian, 1983). Вероятно поэтому способность промотора SV40 быть подверженным модуляции со стороны гетерологичных энхансеров в этих клетках сильно снижена (Scheef et al., 2001), либо вовсе отсутствует, как, например, для обнаруженных последовательностей 7 и 8, несмотря на их способность взаимодействовать с белками ядерного экстракта (Рис. 3-А).
Согласно полученному результату около 85 % (13 из 15) прошедших отбор фрагментов библиотеки проявляют энхансерную активность, что указывает на высокую эффективность предложенного подхода.
Анализ расположения потенциальных энхансеров в геноме.
Положение предполагаемых энхансеров в исследуемом локусе показано на рисунке 6. Шесть фрагментов были идентифицированы внутри генов (в интронах), пять фрагментов локализуются со стороны промоторов генов, один предполагаемый энхансер расположен с 3-стороны от гена и три фрагмента в межгенных областях (ближайшие гены находятся на расстоянии более 10 тыс. п.о.). Учитывая то, что гены локуса (включая интроны) составляют не более 50 % всей длины локуса, можно заключить, что обнаруженные потенциальные энхансеры преимущественно располагаются внутри, либо вблизи генов локуса.
Некоторые из обнаруженных последовательностей (фрагмент 3, 9, 11 и 15) перекрываются с ретроэлементами, в частности Alu-элементами и длинным концевым повтором (LTR) семейства HERV-K (фрагмент 7) (таблица 1). Энхансерная активность LTR HERV-K хорошо изучена (Domanskii et al., 2002, Illarionova et al., 2007, Ruda et al., 2004), поэтому обнаружение среди потенциальных энхансеров фрагмента, расположенного в этом классе повторяющихся элементов генома, подтверждает достоверность предложенного метода. Гораздо меньше данных о проявлении энхансерной активности у Alu-элементов. Тем не менее, известно, что некоторые энхансеры, например, энхансер гена BRCA1, представляет собой Alu-элемент со свойствами эстроген-зависимого энхансера.
Два энхансера было идентифицировано непосредственно рядом с ранее обнаруженными активными промоторами (Kim et al., 2005). Однако это не означает, что энхансеры участвуют в регуляции именно этих промоторов, так как действие энхансера может распространяться на значительные расстояния.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КАРТИРОВАНИЕ ДЕСЯТИ НОВЫХ ИНСУЛЯТОРОВ В ЛОКУСЕ FXYD5-COX7A1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА.
Инсуляторы – это последовательности ДНК, способные предотвращать нежелательные взаимодействия между регуляторными элементами генома, например между промотором и энхансером, а также, будучи помещенными по краям генетической конструкции (трансгена), вводимой генно-инженерными способами в клетки, образовывать независимые домены и тем самым защищать экспрессию трансгена от эффекта положения (Gaszner and Felsenfeld, 2006, Valenzuela and Kamakaka, 2006, West and Fraser, 2005). В частности, одним из основных свойств инсуляторов является их способность блокировать действие энхансера на промотор только в том случае, если инсулятор располагается между этими элементами. На основе этого свойства ранее в нашей лаборатории была разработана система для поиска инсуляторов в длинных геномных последовательностях, позволившая обнаружить в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека восемь потенциальных инсуляторов. В данной работе мы попытались с помощью уже испытанной системы поиска инсуляторов идентифицировать и картировать все или подавляющую часть потенциальных инсуляторов исследуемой области генома.
Стратегия отбора предполагаемых инсуляторов.
Принцип отбора предполагаемых инсуляторов основан на защите промотора репортерного гена от влияния энхансера и позитивно-негативной селекции. Общая схема метода представлена на рисунке 4-Б.
Для отбора инсуляторных последовательностей был сконструирован вектор, названный pPNT/EmP, схема которого представлена на рисунке 4-А. Вектор содержит маркер устойчивости к генетицину, позволяющий проводить позитивную селекцию клеток с интегрированной плазмидой, а также негативный маркер селекции – ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk), экспрессия которого придает клеткам с интегрированным вектором чувствительность к ганцикловиру. Исходный вектор эффективно экспрессирует ген HSV-tk, однако, если поместить между промотором и энхансером этого гена последовательность ДНК, способную блокировать действие энхансера (инсулятор), экспрессия гена HSV-tk в стабильно трансфицированных таким вектором клетках прекращается или же существенно снижается, и содержащие эту последовательность клетки становятся устойчивыми к ганцикловиру.
В качестве положительного контроля был сконструирован вектор pPNT/mP, содержащий в регуляторной области гена HSV-tk минимальный промотор цитомегаловируса. Клетки, в геном которых интегрирует такая конструкция, не чувствительны к ганцикловиру.
Получение библиотеки фрагментов, предназначенной для отбора инсуляторов.
Поиск последовательностей (потенциальных инсуляторов), способных нарушать взаимодействие между промотором и энхансером, проводили в пределах участка хромосомы 19 человека длиной 1 млн. п.о., расположенного между генами FXYD5 и COX7A1. При получении библиотеки фрагментов, предназначенной для отбора потенциальных инсуляторов, ДНК 30 космид, перекрывающих область FXYD5–COX7A1, расщепляли по отдельности рестриктазами Sau3A и Csp6I. К полученным фрагментам (длиной 200–700 п.о.) посредством синтетических адапторов был присоединен праймер 27Pr, позволяющий проводить ПЦР-амплификацию фрагментов библиотеки. Праймер 27Pr содержит сайт расщепления XhoI. Обе библиотеки объединяли. Полученная библиотека была ПЦР-амплифицирована с использованием праймера 27Pr и обработана рестриктазой XhoI. Обработанные рестриктазой фрагменты клонировали в плазмиду pPNT/EmP по сайту SalI. Для сохранения репрезентативности библиотеки было получено 12 000 колоний, что примерно соответствует 4-кратному перекрыванию области FXYD5–COX7A1. Из выросших клонов была выделена плазмидная ДНК.
Отбор предполагаемых инсуляторов.
Полученный набор плазмид линеаризовали обработкой эндонуклезой рестрикции Ssp I и трансфицировали электропорацией в клетки линии СНО. Условия электропорации (20 мс, 360 В, 800 мкФ) для клеток культуры CHO были отработаны в нашей лаборатории ранее, и обеспечивают интеграцию одной копии линеаризованной плазмиды в геном. Параллельно проводили контрольные трансфекции плазмидами pPNT/mP и pPNT/EmP. На стадии позитивной селекции клетки, в геном которых интегрировал вектор, были отобраны по их устойчивости к генетицину (G418). Генетицин-устойчивые клетки затем подвергали негативной селекции ганцикловиром (GCV). Доказательством успешно проведенной селекции служила 100%-ная гибель клеток, содержавших вектор pPNT/EmP, обусловливающий чувствительность клеток к ганцикловиру. В то же время большая часть клеток, трансфицированных контрольной плазмидой pPNT/mP, была устойчива к ганцикловиру. Незначительная гибель клеток может объясняться тем, что в этих клетках интеграция pPNT/mP произошла в участки генома, находящиеся под контролем эндогенных энхансеров.
Следует отметить, что клетки могут стать чувствительными к ганцикловиру и в том случае, если клонированный фрагмент ДНК обладает свойствами сайленсера. Однако последовательность со свойствами сайленсера не обладает направленностью и будет подавлять также и транскрипцию гена устойчивости к неомицину, что приведет к гибели таких клеток на этапе позитивной селекции.
После негативной селекции из клеток, устойчивых к ганцикловиру, была выделена геномная ДНК. На этой матрице была проведена ПЦР-амплификация участка между энхансером и промотором CMV с помощью праймеров 2L и 2R (Рис. 4-Б). Продукты амплификации повторно клонировали в вектор pPNT/EmP для проведения второго раунда селекции.
На рисунке 5-А показаны результаты ПЦР с праймерами 2L и 2R пула плазмид перед трансфекцией (дорожка 1) и ПЦР с теми же праймерами на матрице геномной ДНК из клеток, трансфицированных библиотекой в плазмиде pPNT/EmP и прошедших позитивную и негативную селекции (дорожка 2). На рисунке видно, что в результате селекции исходная библиотека, содержащая набор большого числа фрагментов разной длины (дорожка 1), превращается в «лесенку» (дорожка 2) из ограниченного числа фрагментов. Ранее в лаборатории была проанализирована небольшая часть полученных фрагментов. В данной работе мы попытались клонировать все или подавляющую часть потенциальных инсуляторов исследуемой области. Для этого отобранные фрагменты ДНК (дорожка 2, рисунок 5-А) были клонированы в вектор pGEM-T (Promega), и полученные клоны были проверены на наличие и длину вставок ПЦР с теми же праймерами (Рис. 5-Б). Видно, что вставка наблюдалась во всех 12 проверенных клонах, и длины вставок в основном различались для разных клонов. 20 клонов были секвенированы, четыре идентифицированные последовательности не принадлежали к исследуемой области (содержали фрагменты ДНК E. coli и человеческую ДНК других хромосом). Анализ остальных выявил 10 новых последовательностей. Далее для полученных в этой работе последовательностей вместе с ранее обнаруженными последовательностями была построена зависимость между числом секвенированных клонов и числом новых (уникальных) последовательностей (Рис. 5-В). На рисунке видно, что идентификация новых инсуляторов при дальнейшем секвенировании библиотеки маловероятна. В результате секвенирования было получено 10 новых последовательностей. Эти последовательности были нанесены на карту исследуемой хромосомы 19 между генами FXYD5 и COX7A1 (Рис. 6, инсуляторы 9-18, стр. 18), а их свойства представлены в таблице 2 (стр. 17).
Анализ расположения инсуляторов в геноме.
Предполагается, что одна из основных функций инсуляторов – образование функциональных доменов генома. Нужно отметить, что термин «инсулятор» применяется для обозначения как энхансерблокирующих элементов, так и пограничных элементов генома, отделяющих участки хроматина с различной структурой или активностью. Так как инсуляторы в данной работе были идентифицированы только по энхансерблокирующей активности, то, в принципе, они могут не проявлять «барьерной» активности, хотя она и располагается, скорее всего, вблизи этих элементов. Тем не менее, в ряде случаев можно выделить гипотетические домены, заключенные между инсуляторами.
Область FXYD5–COX7A1 содержит кластер генов, кодирующих рецепторы, ассоциированные с G-белком, – FFAR1, FFAR2, FFAR3 и GPR42P. Ранее было обнаружено, что гены FFAR3 и FFAR2 имеют различные профили экспрессии (Brown et al., 2003). Расположение инсулятора 6, находящегося между генами FFAR3 и FFAR2, и инсулятора 2, отделяющего FFAR2 от гена KRTDAP, экспрессирующегося преимущественно в эпидермальных кератиноцитах (Bazzi et al., 2007), согласуется с независимой экспрессией этих генов. Гены ATP4A и KIAA0841 находятся каждый в своем гипотетическом домене (между инсуляторами 5 и 1, а также 1 и 18 соответственно). Ген ATP4A транскрибируется преимущественно в тканях желудка (Chalaya et al., 2006, Herrmann et al., 2007) и резко отличается в этом отношении от окружающих генов.
Таблица 2. Расположение потенциальных инсуляторов в области FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека.
1Согласно Human Genome Browser (Kuhn et al., 2007), сборка от марта 2006 г.
2На расстоянии более 10 т.п.о. от ближайших генов.
Гены HCST и TYROBP расположены между инсуляторами 14 и 15 и характеризуются выской тканеспецифичностью экспрессии, отличной от специфичности окружающих их генов. Так, эти гены экспрессируются на высоком уровне в миелоидных клетках (Takaki et al., 2006, Wu et al., 1999), тогда как отделенный от них инсулятором 14 ген APLP1 экспрессируется преимущественно в коре головного мозга (Kim et al., 1995), а отделенный инсулятором 15 ген LRFN3 – в нейрональных клетках (Morimura et al., 2006). Эти данные согласуются с представлением о том, что последовательности, обладающие инсуляторной активностью, разделяют цепь ДНК на независимые домены, в каждом из которых находятся гены, характеризующиеся специфичным для них профилем экспрессии.
Нужно отметить, что изученная область может содержать инсуляторы, которые не были идентифицированы из-за ограниченных возможностей использованного подхода. Идентифицируемые при данном подходе инсуляторы должны быть активны в клетках CHO и по отношению к промоторно-энхансерной паре цитомегаловируса. Таким образом некоторые ткане- или энхансерспецифичные инсуляторы могли быть пропущены. Эти недостатки, однако, могут быть преодолены путем использования других клеточных линий и промоторно-энхансерных конструкций.
ЭНХАНСЕР-БЛОКИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ CTCF-СВЯЗЫВАЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, КАРТИРОВАННЫХ В ЛОКУСЕ FXYD5-COX7A1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА.
Ранее с помощью разработанного нами метода двумерного сдвига электрофоретической подвижности в нашей лаборатории были выявлены и картированы в локусе хромосомы 19 человека длиной 1 млн п.о., расположенном между генами FXYD5 и COX7A1, десять фрагментов ДНК, содержащие участки связывания транскрипционного фактора CTCF (Vetchinova et al., 2006). В данной работе мы предприняли попытку определить, обладают ли эти фрагменты инсуляторной (энхансер-блокирующей) активностью в системе позитивно-негативной селекции. Для этого были приготовлены плазмиды представленные на рис. 7 (стр. 20).
Инсуляторная активность CTCF-связывающих фрагментов.
Для проверки энхансер-блокирующих свойств десяти CTCF-связывающих фрагментов в системе позитивно-негативной селекции, их клонировали в плазмиду pPNT/EmP между энхансером и минимальным промотором цитомегаловируса. Было приготовлено 20 плазмид, каждая содержала один из фрагментов, связывающих CTCF, клонированный в прямой или обратной ориентации.
Для интеграции в геном клеток плазмиды pPNT/EmP со вставками были линеаризованы, и все 20 плазмид объединены в общую смесь в равных количествах. В качестве вложенного контроля в смесь были добавлены в эквивалентном количестве линеаризованные плазмиды pPNT/E-sns-mP (положительный контроль) (рис. 7), содержащие инсулятор sns в обеих ориентациях.
Полученным пулом плазмид, были трансфицированы клетки линии СНО в отработанных ранее условиях электропорации, приводящих к интеграции единственной копии плазмиды в геном (Baer et al., 2000). После позитивно-негативной селекции, которую проводили как описано в предыдущей главе, из выживших клеток была выделена геномная ДНК.
Анализ полученных образцов геномной ДНК проводили при помощи двухстадийной ПЦР. На первом этапе на матрице геномной ДНК с праймерами 2L и 2R амплифицировали фрагменты, заключенные между энхансером и промотором CMV. Для каждого CTCF-связывающего фрагмента из локуса FXYD5-COX7A1, а также для инсулятора морского ежа sns были подобраны внутренние праймеры, которые в комбинации с плазмидными праймерами 2L или 2R позволяли определять как наличие в смеси каждой из вставок, так и их ориентацию. Результаты ПЦР приведены на рисунке 8 (стр. 21).
Как видно на рисунке 8 (верхние панели, рис. 8-А и 8-Б) все 10 CTCF-связывающих фрагментов и контрольный инсулятор sns присутствуют в геномной ДНК клеток после селекции G-418, то есть содержащие их конструкции интегрированы в геном клеток. Те же фрагменты присутствуют и в нижних панелях (рис. 8) после селекции с 10 мкМ GCV. Аналогичные результаты были получены при селекции с 4 мкМ GCV в ростовой среде (не показано). Таким образом, можно заключить, что все 10 клонированных нами CTCF-связывающих фрагментов придают клеткам устойчивость к ганцикловиру, будучи помещенными между промотором и энхансером.
Кроме инсуляторов, устойчивость к ганцикловиру трансфицированным клеткам могут придавать последовательности с активностью сайленсеров, которые, в отличие от инсуляторов, способны подавлять активность промотора независимо от их положения относительно последнего (Ogbourne and Antalis, 1998). Таким образом, активность сайленсера должна распространяться и на промотор гена неомицинфосфотрансферазы, и клетки, несущие такой вектор должны погибать на стадии позитивной селекции (Akopov et al., 2006). Тем не менее, для проверки возможного присутствия сайленсерной активности у CTCF-связывающих фрагментов мы клонировали три из них (3, 7 и 8) в плазмиду pPNT/EmPS с 3-стороны от гена HSV-tk (Рис. 7). Клетки, трансфицированные этими плазмидами, погибали на стадии негативной селекции с GCV, т.е. не оказывали ослабляющего действия на энхансер CMV и не являлись сайленсерами.
Таким образом, анализ инсуляторной активности сайтов связывания транскрипционного фактора CTCF, картированных в локусе FXYD5-COX7A1, с помощью системы позитивно-негативной селекции показал, что все эти фрагменты обладают энхансер-блокирующими свойствами, причем эта их способность наблюдается в обеих ориентациях относительно промотора. Способность инсулятора морского ежа sns блокировать действие энхансера на промотор в системе позитивно-негативной селекции также не зависит от ориентации.
ВЫВОДЫ
-
Предложен подход к идентификации и картированию потенциальных энхансеров в протяженных областях генома.
-
С помощью предложенного подхода с использованием культуры клеток HeLa идентифицировано 15 потенциальных энхансеров в локусе, расположенном на хромосоме 19 человека между генами FXYD5 и COX7A1.
-
Обнаруженные потенциальные энхансеры специфически взаимодействуют с белками ядерных экстрактов из клеток культуры HeLa. 13 из 15 обнаруженных последовательностей проявляют энхансерную активность в системе двойной люциферазной детекции в экспериментах по транзиентным трансфекциям линии клеток HeLa.
-
С помощью ранее разработанного метода позитивно-негативной селекции энхансер-блокирующих элементов генома идентифицировано 10 новых потенциальных инсуляторов в локусе, расположенном на хромосоме 19 человека между генами FXYD5 и COX7A1.
-
С помощью системы позитивно-негативной селекции проведен анализ энхансер-блокирующей активности ранее обнаруженных 10 CTCF-связывающих фрагментов ДНК, расположенных в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека. Все исследованные CTCF-связывающие последовательности проявляют энхансер-блокирующую активность в данной системе.
