Введение к работе
Актуальность работы. Кальций принимает участие и в координации работы клеточных систем, являясь вторичным мессенджером при прохождении сигнала, и в функционировании секреторных органелл. При этом нарушение функционирования секреторного пути может приводить как к нарушению гомеостаза ионов кальция, так и вызывать определенные клеточные ответы, зависящие от кальция-мессенджера
Рис. 1. Схема взаимодействия внутриклеточных компартментов, участвующих в поддержании баланса Ca2+ у дрожжей. Черными стрелками показано направление прямого транспорта, осуществляемого с помощью везикул, розовыми стрелками — направление обратного транспорта. Белок а- COP участвует в транспорте из аппарата Гольджи в ЭР, и в транспорте из эндосом (направление транспорта не известно), Ypt6p участвует в транспорте из эндосом в аппарат Гольджи и из аппарата Гольджи в ЭР. Синие стрелки отражают транспорт Са2+через мембраны: канал Cchlp/Midlp переносит Ca2+ через плазматическую мембрану в цитоплазму, АТФ-аза Pmc1p — из цитоплазмы в вакуоль, а АТФ-аза Pmr1p — из цитоплазмы в полость аппарата Гольджи.
Ca2t
Дрожжи являются традиционным модельным объектом для изучения процессов, протекающих в эукариотической клетке. Однако поддержание гомеостаза кальция в клетках дрожжей имеет свои особенности. В частности, в отличие от животной клетки, в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) дрожжей нет помпы, осуществляющей транспорт Са в этот компартмент. Основным депо Ca2+ в дрожжевой клетке является вакуоль, куда кальций откачивается из цитоплазмы за счет функционирования АТФ-азы Pmclp (рис. 1). Мембраны аппарата Гольджи содержат другую АТФ-азу, Pmrlp, переносящую в люмен органеллы
кальций и марганец — два иона, необходимые для процессов гликозилирования и сортинга белков, протекающих в этой органелле. Считается, что аппарат Гольджи является основным источником ионов кальция для ЭР дрожжей, однако при нарушении гена PMR1 полностью блокируются Са2+-зависимые процессы в аппарате Гольджи, но концентрация Са2+ в ЭР
поддерживается на достаточном для жизни уровне. Это указывает на существование
2+
дополнительного источника Са для ЭР. Однако ни этот источник, ни путь, по которому кальций попадает в ЭР, до сих пор не известны. Настоящая работа направлена на изучение механизма доставки и определение источников ионов кальция для эндоплазматического ретикулума дрожжей. Некоторые функции ионов кальция являются тесно связанными с гомеостазом ионов марганца. В этой связи часть работы посвящена изучению пересечений функций этих ионов в клетках дрожжей.
Среди дрожжей наиболее традиционным объектом для изучения гомеостаза ионов кальция являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, однако для решения поставленных задач в качестве модели были выбраны дрожжи Ogataea polymorpha и O. parapolymorpha, что было связано с наличием выраженных проявлений мутаций, нарушающих гомеостаз ионов кальция у этих видов. В частности, мутация ret1-27, которая нарушает С-концевой домен белка a-COP (компонента окаймляющего комплекса COPI, участвующего в ретроградном везикулярном транспорте) приводит к нарушению гомеостаза Са , а инактивация гена PMR1 в штамме с делецией С-концевого домена a-СОР приводит к тому, что клетки способны расти только при
увеличенной концентрации Са2+ в среде. Это указывает на участие, по крайней мере, некоторых
2+
компонентов комплекса COPI в транспорте Са в ЭР из независимого от Pmrlp источника. И дрожжи рода Ogataea, и S. cerevisiae при нарушении гена вакуолярной кальциевой АТФ-азы PMC1 не способны расти на среде с высокой концентрации Ca , однако, в отличие от S. cerevisiae, мутанты pmclh дрожжей рода Ogataea чувствительны к присутствию в среде додецилсульфата натрия (SDS). О механизме действия SDS ничего не известно. Изученные в работе мутанты проявляли чувствительность к SDS в концентрации 0,001-0,008%, что намного ниже критической концентрации мицеллообразования (ККМ = 8,2 мМ = 0,24%), а значит причина чувствительности дрожжей к SDS не должна быть связана со свойствами этого вещества как детергента. Поэтому возникал вопрос, связана ли чувствительность мутанта pmclk к SDS с повышением концентрации Ca в цитозоле, или у Pmclp дрожжей рода Ogataea существует еще какая-то неизвестная функция?
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизма доставки ионов кальция в эндоплазматический ретикулум, а также роли кальция и марганца в жизненно важных процессах у дрожжей рода Ogataea. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
. Провести поиск генов, мутации которых супрессируют чувствительность штамма pmc1A к SDS.
-
. Изучить влияние мутаций, нарушающих гомеостаз кальция (pmrlA, ret1-27 и pmclA), на жизнеспособность дрожжей рода Ogataea в разных условиях.
-
. Исследовать взаимодействие мутаций, нарушающих гомеостаз Ca2+ у дрожжей рода Ogataea.
-
. Изучить влияние мутаций, вызывающих нарушения гомеостаза Ca , на чувствительность дрожжей рода Ogataea к высокой и низкой концентрации Mn .
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые были исследованы проявления нарушений генов PMC1 и PMR1 у дрожжей рода Ogataea. В частности, впервые было показано влияние нарушения гена PMR1 на жизнеспособность дрожжей в различных условиях, а также различие механизмов гибели клеток с нарушением генов PMR1, RET1 и PMC1. Были идентифицированы гены, нарушение которых приводит к супрессии чувствительности к SDS у мутанта pmclA O. polymorpha. Впервые было показано, что у O. polymorpha нарушение гена PMC1 приводит к нарушению регуляции клеточного цикла при переходе от фазы G2 к M.
В работе изучены совместные проявления различных мутаций, нарушающих гомеостаз Ca . При этом впервые было показано, что влияние мутации ypt6A на проявления pmrlA сходно с влиянием мутации ret1-27, и выражается в усилении зависимости мутанта от содержания ионов Ca2+ в среде. Также впервые показано, что нарушение гена CCH1 усиливает проявления мутаций pmr1A и ret1-27, а мутации pmc1A и ret1-27 проявляются независимо как в условиях нехватки, так и избытка Ca . При этом нарушение гена PMC1 усиливает влияние
мутации ret1-27 на процессирование гетерологичного белка uPA-Q , продуцируемого дрожжами O. polymorpha. Вместе эти результаты позволяют выдвинуть гипотезу, согласно которой везикулярный транспорт осуществляет доставку ионов кальция в эндоплазматический ретикулум дрожжей, а в качестве источника ионов кальция для ЭР, помимо аппарата Гольджи помимо аппарата Гольджи, могут выступать эндосомы.
В работе также изучено влияние содержания в среде ионов марганца на рост дрожжей с мутациями pmrlA, pmclA, ret1-27, ypt6A и cchlA, и впервые показано, что продукты генов RET1, YPT6, CCH1 и PMC1 вовлечены в гомеостаз Mn в клетке.
Дрожжи рода Ogataea используются в биотехнологии для получения штаммов- продуцентов рекомбинантных белков. Одним из ограничений такого применения часто
оказывается неспособность дрожжей эффективно секретировать некоторые чужеродные белки.
2+ 2+
Поскольку Са и Mn необходимы для нормального функционирования секреторного пути, полученные в работе результаты могут быть использованы при разработке подходов для оптимизации процесса секреции рекомбинантных белков.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на межлабораторных семинарах Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН (21.06.2012) и Института экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК» (27.09.2012), а также были представлены на 4-ой международной конференции "Hansenula polymorpha worldwide network conference" (2006, Харен, Голландия), 12-ом международном конгрессе "International Congress on Yeasts" (2008, Киев, Украина) и V Съезде ВОГиС (2009, Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 3 тезисных сообщений.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Ведение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 139 страницах и включает в себя 39 рисунков, 7 таблиц и список литературы, содержащий 298 ссылок.
