Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Структурные и функциональные аспекты внутри- и межклеточно го перераспределения и транспорта Са2+ 9
1.1.1. Общие сведения о клеточном перераспределении Са2+ 9
1.1.2. Экспериментальные данные о межклеточном перераспределении и транспорте Са2+ 13
1.1.3. Экспериментальные данные о внутриклеточном перераспределении Са2+ 18
1.2. Основные подходы к моделированию внутри- и межклеточного перераспределения и транспорта Са2+ 24
1.2.1. Модели отдельных процессов, участвующих в перераспределении Са2+ 24
1.2.2. Одноточечные модели - «хорошо перемешанная» клетка 27
1.2.3. Одномерные модели с диффузией на отрезке 33
1.2.4. Двумерные модели с диффузией на плоскости 34
1.2.5. Трехмерные модели с диффузией в пространстве 38
ГЛАВА 2. Межклеточное перераспределение ионов кальция (большое число клеток) 40
2.1. Исследуемое явление 40
2.2. Модель внутриклеточного перераспределения Са2+, используемая в представленной работе 40
2.3. Структурный подход к моделированию распространения межклеточной волны в культуре клеток 44
2.4. Результаты моделирования и их анализ 50
2.5. Заключение (по Главе 2) 52
ГЛАВА 3. Межклеточное перераспределение ионов кальция (2-4 клетки) 54
3.1. Исследуемое явление 54
3.2. Описание модели 54
3.3. Результаты моделирования 59
3.4. Заключение (по Главе 3) 67
ГЛАВА 4. Внутриклеточное перераспределение ионов кальция (одноточечная модель) 68
4.1. Исследуемое явление 68
4.2. Описание модели 70
4.3. Результаты моделирования 73
4.4. Заключение (по Главе 4) 79
ГЛАВА 5. Внутриклеточное перераспределение ионов кальция (многоточечная модель) 82
5.1. Исследуемое явление 82
5.2. Многоточечный сетевой метод 85
5.3. Простейший трехточечный граф 88
5.3.1. Схематическое описание 88
5.3.2. Математическая постановка задачи 89
5.3.3. Описание особенностей модели 93
5.3.4. Результаты моделирования 94
5.4. Треугольный граф 101
5.5. Граф с переносом и диффузией 102
5.5.1. Схематическое описание 102
5.5.2. Математическая постановка задачи 104
5.5.3. Результаты моделирования 106
5.6. Применение многоточечного сетевого метода к другим задачам 109
5.7. Заключение (по Главе 5) НО
Заключение 112
Литература
- Экспериментальные данные о межклеточном перераспределении и транспорте Са2+
- Модель внутриклеточного перераспределения Са2+, используемая в представленной работе
- Результаты моделирования
- Простейший трехточечный граф
Введение к работе
Ионы кальция (Са2+) являются одним из универсальных регуляторов ряда процессов жизнедеятельности клетки [1]. Это, например, движение и деление клетки, сокращение мышечных клеток, дифференциация зародышевых клеток и т.д. Процессы перераспределения и транспорта Са2+ сложны и многообразны. В зависимости от типа клетки, способа и интенсивности стимуляции в клетке могут наблюдаться как длительное повышение цитозольной концентрации Са2+, так и осцилляции Са2+, обладающие различной амплитудой, частотой, шириной пика и другими характеристиками [2] - [4].
Достижение понимания процессов, лежащих в основе перераспределения и транспорта Са2+, осложняется несколькими факторами:
Са2+ присутствует во множественных отделенных друг от друга мембранами внутриклеточных компартментах, каждый из которых использует особую систему транспорта Са2+;
Са2+ распределен в этих компартментах неравномерно;
скорость транспорта Са2+ между компартментами сложным нелинейным образом зависит от свободной концентрации Са2+ в цитозоле.
Согласно экспериментальным данным [5] при механической стимуляции клетки в культуре дыхательного эпителия наблюдается распространение межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, и фронт которой неоднороден в различных направлениях, так что можно наблюдать разного рода «ответвления», «лапы» и т.д., а также вытянутость фронта в целом в каком-то определенном направлении. При стимуляции клеток агонистом АТФ в культуре дыхательного эпителия наблюдаются нерегулярные осцилляции Са2+ [6].
Причинами такой неоднородности межклеточного транспорта Са2+ могут быть три фактора, а именно (1) неоднородность структуры ткани, которая характеризуется различным числом щелевых контактов на границах между смежными клетками, (2) неоднородность структуры ткани, которая характеризуется различным числом соседей у каждой клетки, и (3) неоднородность внутреннего строения клетки. На роль неоднородности внутреннего строения клетки в процессах перераспределения Са2+ указывают появившиеся в последнее время экспериментальные данные о фактах близкого (< 100 нм) взаимного расположения эндоплазматического ретикулума и митохондрий, имеющих место во многих типах живых клеток [7].
В большинстве существующих моделей клетка описывается точкой, отрезком или двумерной областью, в которых все содержимое клетки, включая
плазматическую мембрану, «хорошо перемешано» и представляет собой однородную массу, что не соответствует гетерогенности внутреннего строения клетки [8] - [10].
Существует также ряд моделей внутри- и межклеточного перераспределения и транспорта Са2+, в которых учитывается внутренняя структура клетки [11] - [14]. Однако в них рассматриваются особенности строения даже не конкретного типа клеток, а конкретной единичной клетки или отдельно взятой культуры клеток, так что результаты моделирования, полученные для такого частного случая, не могут быть обобщены даже на исследуемый класс клеток, не говоря уже об отдельных клетках и культурах клеток другого типа.
В рамках представленной работы осуществляется попытка учесть все три упомянутых фактора неоднородности, опираясь на особенности клеточного строения в целом, а также исследуется влияние каждой из трех структурных характеристик по отдельности на процессы внутри- и межклеточного перераспределения Са2+. Учет неоднородности клеточного строения позволяет впервые объяснить многие особенности перераспределения и транспорта Са2+, описанные в экспериментальной литературе для различных типов клеток [5], [6], [15] - [17].
Цель и задачи работы
Целью работы является исследование с помощью математического моделирования роли пространственной неоднородности строения клетки и культуры клеток в перераспределении и транспорте Са2+ на клеточных структурах различных уровней организации (одна клетка, 3-4 клетки, значительная часть культуры клеток).
Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:
разработать метод моделирования кинетики перераспределения веществ в объектах сложной пространственной структуры;
изучить влияние пространственной неоднородности клетки на кинетические характеристики осцилляции Са2+;
разработать метод моделирования структуры соединений группы клеток в культуре;
изучить влияние структуры соединений группы клеток в культуре на неоднородность распространения межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток.
Научная новизна работы
Впервые построена модель, позволяющая исследовать влияние структуры межклеточных соединений на неоднородность распространения межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества цитозольного Са2+, как для малого, так и для большого числа клеток.
Разработан многоточечный сетевой метод математического моделирования кинетических процессов, протекающих на сложных пространственных структурах. Впервые исследовано влияние взаимного расположения ключевых органелл на внутриклеточное перераспределение и транспорт Са2+.
Показано, что гетерогенность Са2+-откликов клеток одного типа на одинаковую стимуляцию может быть результатом малых отклонений во взаимном пространственном расположении клеточных органелл.
Научно-практическая значимость работы
Разработанный в данной работе применительно к моделированию клеточных процессов перераспределения и транспорта Са2+ подход, учитывающий пространственную неоднородность клеточного строения, может быть использован при решении ряда других задач исследования биофизики клетки и клеточных структур. Данные, полученные при исследовании перераспределения и транспорта Са2+ в рамках предложенного подхода, вносят существенный вклад в понимание процессов регуляции клеточного гомеостаза на уровне как одной клетки, так и культуры клеток.
Структура диссертации
Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, списка литературы.
ПЕРВАЯ ГЛАВА представляет собой литературный обзор публикаций, посвященных экспериментальным и теоретическим исследованиям внутри- и межклеточного перераспределения Са2+. Особое внимание уделяется экспериментальным работам, результаты которых еще не получили теоретического обоснования, а также работам, в которых наблюдается различный характер изменений количества Са2+ в ответ на внешнюю стимуляцию при прочих одинаковых условиях. Также в обзоре рассматриваются существующие подходы к математическому моделированию перераспределения Са2+, их преимущества и недостатки.
Во ВТОРОЙ ГЛАВЕ рассматривается структурный подход к моделированию распространения межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества цитозольного Са2+ в клетках культуры дыхательного эпителия. Предлагаемый подход заключается в учете числа соседей у клетки, длины общей границы у смежных пар клеток и топология графа межклеточных соединений в составе культуры посредством диаграммы Вороного и двойственной ей триангуляции Делоне. Предлагаемый подход позволяет сделать вывод, что причиной гетерогенности фронта распространения волны, которая проявляется в увеличении количества цитозольного Са2+ в клетках, является сложная неоднородная структура культуры клеток.
В ТРЕТЬЕЙ ГЛАВЕ проводится исследование влияния различного числа соседей у каждой клетки на межклеточное перераспределение Са2+ для малого числа клеток (2-4 клетки). Результаты исследования позволяют сделать вывод о наличии глубокой связи между структурой графа и важнейшими характеристиками перераспределения Са2+ в клетках различных топологических конфигураций межклеточных соединений.
В ЧЕТВЕРТОЙ ГЛАВЕ рассматривается одноточечная кинетическая модель внутриклеточных осцилляции Са2+ с целью выявления тех характеристик процесса перераспределения Са2+, которые нельзя описать с помощью системы обыкновенных дифференциальных уравнений. Проведенное исследование позволяет сделать вывод, что большая часть характеристик внутриклеточных осцилляции Са2+ может быть объяснена с помощью простой кинетической модели. Однако некоторые особенности процесса перераспределения Са2+ являются следствием пространственной протяженности клетки и ее органелл, а потому не могут быть описаны с помощью одноточечной модели.
В ПЯТОЙ ГЛАВЕ предлагается новый многоточечный сетевой метод математического моделирования, позволяющий исследовать нелинейные процессы, проходящие на объектах сложной пространственной структуры. С помощью этого метода моделируется процесс внутриклеточного перераспределения Са2+ с учетом различного взаимного расположения ключевых органелл внутри клетки. Исследование трех таких моделей позволяет сделать вывод, что причиной различного характера изменений количества цитозольного Са2+ в клетках одного и того же типа при одинаковых условиях внешней стимуляции могут быть малые отклонения во внутренней структуре клетки.
В ЗАКЛЮЧЕНИИ сформулированы основные результаты работы.
Экспериментальные данные о межклеточном перераспределении и транспорте Са2+
Общие данные. Межклеточные волны, которые проявляются в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, могут быть инициированы точечным механическим, электрическим или гормональным стимулом, и, распространяясь в смежные клетки, могут координировать глобальный отклик ткани на внешнюю стимуляцию. Хотя явление распространения межклеточных волн, которые проявляются в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток наблюдается в различных типах тканей, механизм, обеспечивающий распространение волны, может быть специфичным для каждого типа ткани.
Часто осцилляции Са2+ распространяются от клетки к клетке, формируя периодические межклеточные волны [6], [25]. Механизмы, лежащие в основе таких периодических межклеточных волн до конца не изучены и до сих пор остаются предметом обсуждения (см. ниже).
Межклеточные волны, которые проявляются в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, могут также распространяться между клетками различных типов. Например, волны между клетками дыхательного эпителия и гладкомышечными клетками могут регулировать размеры бронхов, тогда как волны, распространяющиеся между глиальными и эндотелиальными клетками, могут влиять на функцию гематоэнцефалического барьера [26]. Межклеточные волны, которые проявляются в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток между глиальными клетками и нейронами играют определенную роль в передаче информации по нейронным сетям.
Основную роль в распространении межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, играют два типа межклеточных взаимодействий: паракринная сигнализация и щелевые контакты между клетками [27]. В зависимости от типа ткани распространение межклеточной волны может обеспечивать или какой-то один из этих механизмов, или сразу оба с различной степенью влияния. Роль паракринного мессенджера могут играть ионы Са2+, различные нуклеотиды (например, АТФ) и другие молекулы.
Через щелевые контакты между клетками могут диффундировать малые молекулы и ионы (молекулярный вес которых 1 кДа), например ионы Са2+ и 1Рз, которые также в различной степени обеспечивают распространение межклеточной волны. К тканям, клетки которых соединены друг с другом щелевыми контактами, относятся, например, печень, эпителий и стенки кровеносных сосудов.
Известно, что ионы Са2+ способны закрывать щелевые контакты [28], [29]. Это могло бы оказаться препятствием для распространения межклеточных волн, которые проявляются в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, однако, этот кажущийся парадокс можно разрешить, рассмотрев временные аспекты откликов щелевых контактов. Известно, что длительное внутриклеточное воздействие высоких концентраций Са2+ ( 10 мкМ) приводит к закрытию щелевых контактов [28], [29]. Также известно, что физиологические концентрации Са2+ внутри клетки ( 1 мкМ ) могут обратимо закрывать щелевые контакты, однако, этот отклик требует порядка 30 сек [30]. Таким образом, поскольку межклеточные волны, которые проявляются в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток распространяются быстрее, чем щелевые контакты успевают закрыться [5], два вероятных межклеточных мессенджера (Са2+ and IP3) [31], [32] могут диффундировать в соседние клетки, обеспечивая тем самым распространение волны до того, как щелевые контакты будут закрыты.
Функции межклеточного перераспределения и транспорта Са2+. Многие функции печени контролируются с помощью Са2+. Например, в продукции глюкозы печенью одним из важных промежуточных факторов является индуцированное гормонами повышение Са2+. Многие события, имеющие отношение к желчеотделению, такие как везикулярный перенос, канальцевый экзоцитоз, проницаемость плотных контактов или канальцевое сокращение. Механическая стимуляция клеток дыхательного эпителия повышает частоту биения ресничек клеток-мишеней; этот отклик затем распространяется 1Рз-зависимым способом в соседние клетки [33]. Также наблюдается распространение осцилляции Са2+ через щелевые контакты между панкреатическими клетками ацинуса, которое может координировать секреторный от 15 клик кластеров этих клеток [34]. Помимо координации локальных функций межклеточные волны, которые проявляются в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, распространяющиеся между астроцитами, могут действовать на больших расстояниях (дальнего действия) или даже формировать основу для «сети астроцитов», передающей информацию способом, аналогичным нейронным сетям [35], [36].
Межклеточное перераспределение и транспорт Са2+ в эпителиальных тканях. В случае клеток дыхательного эпителия тип внутриклеточного перераспределения Са2+ зависит от способа внешней стимуляции клетки. При механической стимуляции в клетке наблюдается продолжительное повышение цитозольной концентрации Са2+ без каких-либо осцилляции [37]. При внешнем воздействии АТФ в клетке возникают осцилляции цитозольной концентрации Са2+, амплитуда которых со временем уменьшается до полного затухания осцилляции [6]. Экспериментальные данные [38], [39] говорят о том, что паракринная сигнализация и взаимодействие посредством щелевых контактов при определенных условиях в эпителиальных тканях могут происходить одновременно.
Хотя Са2+-чувствительные функции клеток часто опосредуются осцил-ляторным изменением цитозольного Са2+, а не длительным стабильным повышением [40], осцилляции Са2+ в клетках дыхательного эпителия in vitro наблюдаются заметно реже, чем продолжительное повышение Са2+ [41] - [43].
Индуцированная механической стимуляцией межклеточная волна, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, распространяется в культуре дыхательного эпителия со скоростью около 19 мкм/сек [5], [44], тогда как внутриклеточная волна Са2+ в клетках этого типа распространяется со скоростью 25 мкм/сек. На границах между клетками волна временно останавливается и проходит в смежную клетку только после временной задержки около 0.5-1 сек. Этот процесс повторяется несколько раз в более отдаленных клетках, так что наблюдаемое повышение концентрации цитозольного Са2+ распространяется по радиусу по культуре эпителиальных клеток [5].
В цикле работ [5], [33], [45] - [48] экспериментально показано, что для повышения уровня цитозольного Са2+ в механически стимулируемой клетке необходимо наличие внеклеточного Са2+, однако для последующего распространения межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток ткани, это повышение не является необходимым поскольку повышение цитозольного Са2+ в соседних клетках происходит за счет высвобождения Са2+ из внутренних запасов клетки, а не за счет входа внеклеточного Са2+. Другими словами, в культуре дыхательного эпителия межклеточная волна, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, распространяется даже при полном отсутствии внеклеточного Са2+, который предварительно вымывается. Это говорит о том, что вход в цитозоль внеклеточного Са2+ при межклеточном перераспределении Са2+ в культуре клеток этого типа не играет большой роли. При этом основным механизмом генерации внутриклеточного сигнала Са2+ в каждой клетке при распространении межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, является высвобождение Са2+ из ЭР через каналы 1Рз-рецепторов [45].
Модель внутриклеточного перераспределения Са2+, используемая в представленной работе
Однако экспериментально показано, что в культуре дыхательного эпителия межклеточная волна, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, распространяется даже при полном отсутствии внеклеточного Са2+, который предварительно вымывается [45]. Это говорит о том, что вход внеклеточного Са2+ в клетку при межклеточном перераспределении Са2+ в культуре этого типа не играет большой роли, а основным механизмом генерации внутриклеточного сигнала Са2+ в каждой клетке при распространении межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, является высвобождение Са2+ из ЭР через каналы ІРз-рецепторов. Поскольку система уравнений (2.1)-(2.3) используется в представленной работе для моделирования распространения межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток именно в таких культурах (см. ниже), то дополнять ее еще одним уравнением баланса нет необходимости.
Тканевое перераспределение и транспорт Са2+ часто моделируют для случая эпителиальных клеток, так как эпителиальную ткань и культуру эпителиальных клеток можно считать плоской, что значительно упрощает моделирование [37]. При этом возникает необходимость учета диффузионных процессов между клетками. С этой целью записывается система дифференциальных уравнений в частных производных, которая, как правило [37], [253], решается на обычной квадратной сетке разностными методами с использованием того или иного типа граничных условий. При этом клетки культуры представляются как прямоугольные, а чаще квадратные, объединения ячеек расчетной сетки разностного метода [37], [253] (см. рис. 2.4). Фронт распространения межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, на квадратной сетке (рис. 2.5, [37]) имеет, фактически, форму окружности, тогда как из экспериментов [5], [260] известно, что распространение волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, носит далеко не изотропный характер. Отметим, что прямоугольная сетка плохо аппроксимирует области сложной формы с кривой границей даже при введении замены координат. Кроме того, размер ячейки регулярной сетки постоянен на всей области моделирования, хотя линейные размеры, площади и формы отдельных клеток культуры могут существенно различаться.
Чтобы избежать влияния искусственной регулярности клеточного строения в представленной работе моделирование культуры клеток производится с помощью триангуляции Делоне и двойственной ей диаграммы Вороного [261]. Термин «двойственность» здесь подразумевает, что соединив отрезками те исходные точки, чьи многоугольники Вороного соприкасаются хотя бы углами, можно получить триангуляцию Делоне [262]. В данном случае пространственный учет внутриклеточной динамики Са2+ привел бы, в сущности, только к наличию временных задержек при переходе сигнала к соседним клеткам. Для учета внутриклеточной диффузии Са2+ в модели на каждую ячейку диаграммы Вороного можно наложить обычную квадратную сетку (см. рис. 2.6), однако, при этом возникает проблема больших погрешностей при аппроксимации граничных условий. Также можно провести детализацию графа триангуляции Делоне (см. рис. 2.7), однако, достаточно сложно сделать эту детализацию также триангуляцией Делоне. Внутриклеточная и межклеточная волны - это процессы разных масштабов, поэтому при моделировании распространения волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток в культуре, детальное моделирование внутриклеточной диффузии Са2+ не имеет смысла. Каждую клетку культуры достаточно представить точкой без учета ее пространственной протяженности. Одновременно это позволяет избежать проблем с наложением сетки внутри ячейки диаграммы Вороного. В представленной модели в качестве механизма распространения межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, рассматривается диффузия 1Рз через щелевые контакты [45].
В ряде существующих моделей межклеточного перераспределения Са2+ посредством щелевых контактов [54], [199] не учитывается тот факт, что их проводимость существенным образом зависит от ряда факторов [29], и ее величина берется постоянной [54], [199].
В работе [30] для клеток гепатомы Новикова экспериментально показано, что при быстром повышении концентрации цитозольного Са2+ с 0.2 мкМ до 1 мкМ в каждой из двух смежных клеток проводимость щелевых контактов с той же скоростью понижается с 100% до 0%, а при последующем возвращении уровня цитозольного Са2+ к нормальному значению 0.2 мкМ проводимость щелевых контактов восстанавливается практически с такой же скоростью (см. рис. 2.8). Это означает, что во время каждой осцилляции цитозольного Са2+ в одной из двух смежных клеток щелевые контакты между ними кратковременно закрываются, однако, их закрытие происходит не мгновенно, а в течение примерно 30 с. На основании этих данных (см. рис. 2.8) быстрые изменения проводимости щелевых контактов между смежными клетками і и j можно моделировать как функцию цитозольного Са2+ в этих двух клетках: lij kgapkijaij Спп -Х- ]сп acytMax{ij) + KG (2.4) где CdcytMaxiij) максимальная концентрация цитозольного Са2+ в клетках і и j, a a ij - безразмерный коэффициент щелевой связи, определяющий зависимость проводимости от длины границы между клетками. Другие параметры см. табл. 2.3. Из рис. 2.8 видно, что поскольку проводимость щелевых контактов уменьшается очень быстро даже при небольшом повышении цитозольного Са2+, то, как показывает проведенная оценка (рис. 2.9), для описания этой зависимости целесообразно использовать в функции 7у (2-4) степень п — 5. Таким образом, с учетом модели внутриклеточного перераспределения Са2+ [158] (см. выше), система уравнений, описывающая межклеточную волну, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, между двумя клетками культуры дыхательного эпителия при механической
Результаты моделирования
В представленной работе подробно исследуются случаи 2 клеток, три различных топологических конфигурации соединений 3 клеток и десять различных плоских топологических конфигураций соединений 4 клеток (рис. 3.2). Всего можно выделить пять различных топологий графов соединений четырех клеток в плоскости, однако в рамках одной топологической конфигурации динамика межклеточного перераспределения Са2+ существенно зависит от того, к какой именно клетке конфигурации прикладывается стимуляция. При этом предполагается, что в конфигурации участвуют только одинаковые клетки. Это предположение обеспечивает возможность исследования зависимости перераспределения Са2+ только от топологии графа межклеточных соединений в рамках данной конфигурации.
Систему уравнений (3.2)-(3.4) можно легко обобщить на случай более трех клеток. Например, все двумерные конфигурации для четырех клеток представлены на рис. 3.2. Все они являются биологически реалистичными в плоскости (для плоских культур клеток). Примеры реальных клеточных конфигураций in vitro показаны на рис. 1 и 2 в [32] и рис. 9 и И в [6]. Система клеток 1, 2, 3, 7 на рис. 1а в [32] (если исключить остальные клетки) соответствует топологическим конфигурациям на рис. 3.2 А (нужно стимулировать клетку 3 или 7) и 3.2 В (нужно стимулировать клетку 1 или 2) в представленной работе. Система клеток 1, 2, 5, 7 на рис. 1а в [32] (если исключить остальные клетки) соответствует топологическим конфигурациям на рис. 3.2 С (нужно стимулировать клетку 5), рис. 3.2 D (нужно стимулировать клетку 2 или 7) и рис. 3.2 Е (нужно стимулировать клетку 1) в представленной работе. Система клеток 1, 3, 5, 7 на рис. 1а в [32] (если исключить остальные клетки) соответствует топологическим конфигурациям на рис. 3.2 F (нужно стимулировать клетку 1) и рис. 3.2 G (нужно стимулировать клетку 3, 5 или 7). Также система клеток на рис. 9 в [6] соответствует топологическим конфигурациям на рис. 3.2 F (нужно стимулировать клетку В) и рис. 3.2 G (нужно стимулировать клетку А, С или D) в представленной работе. Система клеток на рис. 1с и рис. 2 в [32] и на рис. 11 в [6] соответствует топологическим конфигурациям на рис. 3.2 I и рис. 3.2 J в представленной работе. Наконец, нет никаких сомнений в том, что возможно выделить конфигурацию, показанную на рис. 3.2 Н из всего множества существующих плоских культур клеток.
Рассмотрим сначала случай двух клеток (см. рис. 3.3). К первой клетке прикладывается трапециевидный импульс 1Рз с 0 сек по 14 сек с амплитудой 4 мкМ. Часть 1Рз из этого импульса распадается по закону Jdeg (3.1), а часть диффундирует во вторую клетку через щелевые контакты. Получившееся в результате действия всех этих процессов количество ІРз в первой клетке показано на рис. 3.3 {ІРці) с 0 сек по 14 сек). Количество ІРз, попавшего во вторую клетку в результате диффузии через щелевые контакты из первой клетки показано на рис. 3.3 {ІРщ с 0 сек п0 14 сек). В модели предполагается, что после окончания внешней стимуляции клетки агонистом концентрация ІРз в цитозоле быстро падает практически до нуля (см. 1Рщ\, t = 14 сек на рис. 3.3). Повышение количества ІРз в первой клетке после окончания действия импульса (см. ІРці), t 14 сек на рис. 3.3) происходит из-за наличия обратной связи между клетками. Изменение ІРз в обеих клетках происходит в этот период не плавно, а скачками. Это связано с тем, что проводимость щелевых контактов между клетками не остается все время постоянной, а меняется по закону 7zj (2-4) так, что при высоких концентрациях цитозольного Са2+ в любой из двух клеток щелевые контакты могут полностью закрываться и диффузия ІРз через них временно прекращается. При концентрации ІРз около 1 мкМ в клетке возникают осцилляции цитозольного Са2+. Поскольку концентрация ІРз достигает нужного уровня во второй клетке позже, чем в первой, то и осцилляции цитозольного Са2+ во второй клетке возникают после определенной временной задержки (см. рис. 3.4). В случае двух клеток имеет место обратная зависимость времени задержки между началом осцилляции Са2+ в двух смежных клетках от максимальной концентрации ІРз в первой клетке (см. рис. 3.4).
Для случая более двух связанных клеток результаты представленного исследования показывают, что распространение межклеточной волны, которая проявляется в увеличении количества Са2+ в цитозоле клеток, существенным образом зависит от топологической конфигурации межклеточных соедине-ний. Можно выделить три различных возможных пространственных конфигурации соединений трех клеток друг с другом (см. рис. 3.1). Если положение двух соседних клеток симметрично по отношению к первой клетке (рис. 3.1 В, С), то можно наблюдать одинаковые осцилляции в обеих второй и третьей клетках, которые возникают после определенной временнбй задержки около 2 сек после возникновения осцилляции в первой клетке. В случае линейной цепочки клеток (рис. 3.1 А) наблюдаются различия в осцилляциях Са2+ во второй и третьей клетках. Имеет место временная задержка не только между началом осцилляции Са2+ в первой и второй клетках, но и между второй и третьей клетками (обе временные задержки около 2.5 сек).
Рассмотрим теперь случай четырех связанных клеток. Результаты моделирования для всех конфигураций четырех клеток собраны в табл. 3.2 - 3.4. Заметим, что в представленной работе рассматривались только плоские (двумерные) конфигурации межклеточных соединений (см. рис. 3.2).
Простейший трехточечный граф
Из-за наличия потоков Са2+ через плазматическую мембрану клетки моделируемая система является открытой, и полное количество Са2+ в клетке не сохраняется.
В модели предполагается, что продукция 1Рз происходит мгновенно в точке приложения внешней стимуляции плазматической мембраны клетки, после чего 1Рз диффундирует через цитозоль и распадается со временем. Мгновенная продукция ІРз у плазматической мембраны (РМ) моделируется граничными условиями 1Рз(х = 0,t = 0) = 6.5 мкМ в граничной точке 1. Во всех остальных точках IPs(s, t = 0) = 0.
В качестве основы для описания функции ЭР и 1Рз-рецепторов, а также скорости распада ІРз используется модель [156]. Из-за пространственного разделения потоков Са2+ через плазматическую мембрану клетки и мембрану ЭР модель [156] переписывается в переменных CUER, Ca t и h вместо со (в [156] CQ означает полный свободный Са2+ в клетке на объем цитозоля), Cacyt ([Са2+]і в [156]), и h путем подстановки закона сохранения для с$: со = ciCaER + Cacyt (5.21) в дифференциальное уравнение для со из [156] — = e{Jin — Jout)- (5.22)
В представленной модели учитываются подвижные цитозольные Са2+-связывающие белки. Поэтому пространственно-временные зависимости количества свободных и занятых Са2+-связывающих мест на буферных белках описываются в терминах дифференциальных уравнений в явном виде. В качестве основы для описания поведения цитозольных буферных белков используется модель [160]. Однако в модели [160] имеет место закон сохранения полного количества буферных белков. В представленной модели буферные белки являются подвижными в цитозоле, а потому их полное количество в каждой точке уже не сохраняется. Однако полное количество буферных белков в клетке в целом продолжает сохраняться, поскольку в модели отсутствует обмен буферными белками с внеклеточной средой. В качестве основы для описания митохондриальной функции в представленной работе используется модель [160]. В качестве основы для описания потоков Са2+ через плазматическую мембрану клетки в представленной работе используется модель [156]. Концентрация цитозольного Са (мкМ)
Результаты моделирования. Результаты моделирования удобнее представлять на плоскости (s,t), используя шкалу уровней яркости цвета для отображения значений Са и СаРг. Для демонстрации типичных результатов используются следующие длины ребер графа хтах — 0.8 мкм, Утах — 0-9 мкм, zmax = 1.1 мкм. Концентрации всех пространственных переменных нормируются на «размер» клетки в представленной модели, то есть на сумму длин отрезков.
ГРз мгновенно продуцируется в точке х = 0 (граничная точка 1 на рис. 5.5) и диффундирует через цитозоль к ЭР (у — 0, граничная точка 2 на рис. 5.5) и митохондриям [z — 0, граничная точка 3 на рис. 5.5). Уровень 1Рз быстро уравновешивается по всему цитозолю в течение 2 сек после начальной стимуляции, после чего медленно уменьшается со временем.
Осциллирующее высвобождение Са2+ из ЭР (у — 0, граничная точка 2) начинается в течение 4 сек после стимуляции (рис. 5.6). Высвобожденный Са2+ диффундирует через цитозоль к плазматической мембране (х = 0, граничная точка 1), где выводится во внеклеточное пространство, и к митохон ( Связанный цитозольными белками Са ) 0.5 1 1.5 2 (мкМ)2.5 дриям (z = 0, граничная точка 3), где поглощается митохондриями через уни-порты. В то же время, цитозольный Са2+ активно связывается подвижными цитозольными Са2+-связывающими белками (рис. 5.7). Для такой внутриклеточной конфигурации {хтах = 0.8 мкм, утах = 0.9 мкм, zmax = 1.1 мкм) всего генерируется четыре спайка полной концентрации цитозольного Са2+ в клетке (которая вычисляется путем суммирования значений Са во всех точках сетки на всех сегментах, а после чего нормируется на «размер» клетки) в период с 0 по 50 сек (рис. 5.8).
При других внутриклеточных конфигурациях генерируется два (см. рис. 5.9, хтах = 0.8 мкм, утах = 2.1 мкм, zmax = 0.5 мкм) и одиннадцать (см. рис. 5.10, сплошная линия, хтах = 1.1 мкм, утах = 1.1 мкм, zmax = 0.5 мкм) спайков цитозольной концентрации Са2+. Отсюда можно сделать вывод, что не только расстояние между ЭР и митохондриями (как предполагалось в работе [7]) оказывает влияние на перераспределение Са2+, но и взаимное расположение между всеми наиболее значимыми внутриклеточными объектами, такими как плазматическая мембрана, ЭР и митохондрии, также играет важную роль. Таким образом, различная 1Р3-чувствительность клеток одного и того же типа [6] (см. рис. 5.1), [98], [99], может быть результатом различий во внутриклеточной пространственной структуре.
С помощью предложенной модели также можно исследовать влияние деполяризации митохондриальной мембраны протонофором СССР (carbonyl 50 100 Время (сек) 150 Рис. 5.9. Полная концентрация цитозольного Са2+. Параметры графа: Хтах = 0.8 мкм, утах = 2.1 мкм, zmax = 0.5 мкм (результаты моделирования). cyanide m-chlorophenylhydrazone) на внутриклеточные осцилляции Са2+ [16]. Влияние деполяризации мембраны митохондрий учитывается в модели путем исключения митохондрий из графа (см. рис. 5.5). Обсуждение правомерности такого предположения модели см. ниже. Фактически, исключение митохондрий соответствует рассмотрению такого графа, в котором имеют место три пересекающихся отрезка и только две точки реакции ЭР и плазматическая мембрана (в отличие от графа на рис. 5.5). Третий отрезок заканчивается «тупиком», и, тем самым, моделирует своеобразную буферную область в цитозоле. «Тупиковые» граничные условия в представленной модели имеют
Осцилляции цитозольного Са2+ в модели происходят как при наличии, так и в отсутствие влияния митохондрий (рис. 5.10). Однако в отсутствие влияния митохондрий амплитуда осцилляции Са2+ повышается и поднимается также базовый уровень Са2+.
В эксперименте [16] исследовалось влияние деполяризации митохондри-альной мембраны протонофором СССР на осцилляции цитозольного Са2+. Показано, что при деполяризации мембраны митохондрий амплитуда и ширина пика осцилляции Са2+ росли, базовый уровень цитозольного Са2+ повышался, а частота осцилляции сокращалась. Часть этих результатов (увели без митохондрий с митохондриями 50 100 Время (сек) Рис. 5.10. Полная концентрация цитозольного Са2+ с участием митохондрий (сплошная линия) и без него (пунктирная линия) в модели. Параметры графа: хтах = 1.1 мкм, утах = 1.1 мкм, zmax = 0.5 мкм (результаты моделирования). чение амплитуды и уширение пика осцилляции цитозольного Са2+) удается воспроизвести в одноточечной модели без учета пространственной структуры клетки (см. Глава 4). Однако повышение базового уровня цитозольного Са2+ и сокращение частоты осцилляции не могут быть воспроизведены в одноточечной модели, по всей видимости, по причине того, что эти изменения возникают из-за гетерогенного внутреннего пространственного строения клетки.
С помощью МСМ в данной работе получены повышение базового уровня цитозольного Са2+ и увеличение амплитуды осцилляции Са2+ в отсутствие влияния митохондрий на процесс перераспределения (рис. 5.11). Повышение базового уровня цитозольного Са2+ происходит из-за того, что избыточный цитозольный Са2+, который должен был бы быть поглощенным митохондриями, вынужден диффундировать к ЭР и плазматической мембране клетки, чтобы быть вытесненным из цитозоля (рис. 5.12). Амплитуда осцилляции цитозольного Са2+ увеличивается по той же причине.
