Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Особенности строения и электрофизиологии нервной системы пиявки
1.1.1. Строение нервной системы пиявки и клеточные механизмы поведенческих реакций 7
1.1.2. Структура и электрические свойства Retzius-нейронов ганглия пиявки 10
1.1.3. Нейромедиаторы нервной системы пиявки 11
1.1.4. Ионные каналы плазматической мембраны Retzius-нейрона 18
1.2. Процессы регуляции Са2+ в цитоплазме нейронов
1.2.1. Плазматическая мембрана как ионный обменник 23
1.2.2. Са2+-связывающие белки цитоплазмы 24
1.2.3. Внутриклеточные Са +-буферы: митохондрии и эндо плазматический ретикулум 25
Цели и задачи исследования 32
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Приготовление препаратов. Растворы и реактивы 33
2.2. Регистрация мембранного потенциала и ритмической активности нейронов 38
2.3. Микрофлуориметрические методы исследования 38
2.4. Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 44
2.5. Метод спектроскопии комбинационного рассеяния 47
2.6. Регистрация спектров поглощения нейронов 50
2.7. Метод лазерной интерференционной микроскопии 53
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Изменения свойств плазматической мембраны и внутриклеточных органелл нейронов при температурной, химической и механической стимуляции экстерорецепторов
3.1.1. Перераспределение связанного Са2+ плазматической мембраны и потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов при температурной стимуляции (изменении температуры кожи) 60
3.1.2. Перераспределение связанного Са плазматической мембраны и потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов при химической стимуляции (изменении содержания хлористого натрия в среде) 77
3.1.3. Перераспределение связанного Са плазматической мембраны и потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов при тактильной стимуляции 81
3.2. Изменения свойств плазматической мембраны и внутриклеточных органелл при действии нейромедиаторов
3.2.1. Изменения содержания связанного кальция плазматической мембраны нейронов при действии ацетилхолина и серотонина 83
3.2.2. Изменения потенциала внутренней митохондриальной мембраны и содержания окисленных флавопротеинов нейронов при действии ацетилхолина и серотонина 86
3.2.3. Изменения концентрации цитоплазматического кальция и потенциала внутренней мембраны митохондрий при действии серотонина и глутамата на нейроны мозжечка крысы 94
3.2.4. Изменения вязкости мембран цитосом нейронов при действии ацетилхолина и серотонина 99
3.2.5. Локальные изменения цитоплазматической концентрации Са и потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов при действии глутамата 102
3.3. Локальные изменения показателя преломления цитоплазмы нейронов в состоянии покоя и при действии нейромедиаторов
3.3.1. Оценка адекватности метода и работы программного обеспечения 107
3.3.2. Регулярные локальные флуктуации высоты фазового профиля
нейрона 109
3.3.3. Регулярные локальные изменения флуктуации высоты фазового профиля нейронов при действии нейромедиаторов 115
Заключение и выводы 118
Список литературы
- Строение нервной системы пиявки и клеточные механизмы поведенческих реакций
- Регистрация мембранного потенциала и ритмической активности нейронов
- Перераспределение связанного Са плазматической мембраны и потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов при химической стимуляции (изменении содержания хлористого натрия в среде)
- Изменения вязкости мембран цитосом нейронов при действии ацетилхолина и серотонина
Введение к работе
Функционирование нервной клетки проявляется в генерации и проведении потенциалов действия (ПД) и ритмического возбуждения (РВ). Известно, что существенную роль в регуляции РВ играют процессы ионного транспорта и клеточного гомеостаза Са2+. Возбудимость нейрона напрямую зависит от градиента Са2+, создаваемого за счет функционирования Са2+-каналов, Ыа7Са2+-обмена, активности Са2+-АТФаз эндоплазматического ретикулума и нейролеммы, а также аккумуляции иона в митохондриях и связывании белками цитоскелета цитоплазмы [Racay et al, 1996]. В нейронах Са + выступает как регулятор экзоцитоза, активации Са2+-зависимых К+-каналов и выброса Са + из внутриклеточных депо, а также модуляции активности генов и белков. Процессы, ответственные за вход и аккумуляцию Са2+, а также контролирующие пространственно-временные параметры перераспределения цитоплазматического Са +, являются важными условиями формирования РВ нейрона [Benham et al, 1992]. Важно, что нарушения процессов связывания и аккумуляции Са2+, приводящие к увеличению его цитоплазматической концентрации, вызывают гибель клеток [Randall and Thayer, 1992].
ЦНС некоторых беспозвоночных животных является уникальным объектом для комплексного изучения клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе регуляции РВ нейронов. Для пейсмекерных нейронов (Rz-клетка) пиявки характерно спонтанное РВ, параметры которого регулируются в том числе экстраклеточным Са2+ и нейромедиаторами (НМ). Однако в настоящее время практически не исследована роль плазматической мембраны и субклеточных органелл в перераспределении, связывании и аккумуляции Са при действии на Rz-клетки НМ.
В связи с этим в настоящей работе изучали изменения ряда Са2*-зависимых параметров, характеризующих состояние плазматической мембраны, субклеточных органелл и цитоплазмы пейсмекерного Rz-нейрона при действии НМ. Действие НМ на пейсмекерный нейрон исследовали при температурной, химической и механической стимуляции экстерорецепторов кожи, либо перфузии нейронов физиологическим раствором, содержащим ацетилхолин, серотонин или глутамат. В исследовании целенаправленно использовали препараты, в которых изменения вышеуказанных параметров регистрировали для нейронов, локализованных как в ганглии с сохраненной иннервацией от экстерорецепторов кожи животного, так и в ганглиях без иннервации, а также для изолированных нейронов.
, 6
Строение нервной системы пиявки и клеточные механизмы поведенческих реакций
Известно, что нервная система пиявки представляет собой цепочку ганглиев. Церебральные ганглии помещаются в шестом сегменте над глоткой. Далее следуют большая передняя ганглиозная масса брюшной нервной цепочки, 21 простой ганглий цепочки и большая задняя ганглиозная масса. На рисунке 1 представлен типичный ганглий ЦНС Hirudo medicinalis с вентральной стороны, принципиальные особенности которого заключаются в следующем:
1) Коннективы состоят из двух тяжей аксонов и соединяют между собой соседние ганглии. Каждый коннектив содержит несколько тысяч немиелинизированных аксонов, диаметр которых менее 4 мкм. Третье, более тонкое волокно, Файвровский нерв, лежит между коннективами [Coggeshall and Fawsett, 1964].
2) С каждой стороны ганглия располагаются передние и задние корешки. Аксоны, выходящие из корешков, иннервируют стенку тела и прилегающие внутренние органы. Большая часть нервов 5-го и 6-го ганглиев инпервирует репродуктивные органы.
3) Капсула соединительной ткани, содержащая рассеянные волокна гладкой мускулатуры, окружает всю ЦНС и покрыта слоем эндотелиальных клеток. In situ, ЦНС располагается в кровяном синусе, в котором обмен веществами и ионами между кровью и нейронами или глиальными клетками осуществляется путем диффузии через капсулу (в ЦНС пиявки капилляры отсутствуют).
4) Каждый ганглий содержит приблизительно 350 клеток [Kuffler and Potter, 1964]. Клетки объединены в шесть отдельных групп, или «пакетов», каждый из которых ассоциирован с одной большой глиальной клеткой. Расположение клеток в ганглии относительно постоянно, так что около 30 нейронов на вентральной поверхности ганглия могут быть безошибочно идентифицированы. Морфологически среди этих клеток отмечают две гигантские Retzius-клетки, Т, Р и N - нейроны. Нейроны в ганглии униполярные, а синаптические контакты образуются в области центрального нейропиля. Отметим, что синапсы на телах клеток не обнаружены.
5) Одиночная глиальная клетка занимает в ганглии пространство между нейронами. Две гигантские глиальные клетки ассоциированы с нейропилем и по одной с каждым коннективом. Пространство между нейрональной и глиальной мембранами составляет 150 А и служит для перемещения ионов и небольших молекул.
Сегментальный ганглий ЦНС медицинской пиявки (вентральная сторона). Т-, Р-, N- механочувствительные нейроны и их типичный ответ на действие адекватного стимула [Nicholls and Baylor, 1968].
Экстерорецепторы кожи медицинской пиявки представляют собой чувствительные сосочки, локализованные на поверхности туловищных сегментов. Каждый сосочек состоит из скопления веретеновидных чувствительных клеток, периферический отросток которых проходит через слой эпителиальных клеток и заканчивается короткими волосками, внедряющимися в кутикулу и выступающими над ее наружной поверхностью. Проксимальные отростки сенсорных клеток объединяются в пучок нервных волокон, идущий через соединительную ткань в центростремительном направлении. В состав чувствительного сосочка, кроме того, входят железистые клетки и прикрепляющиеся к кутикуле дугообразные мышечные волокна, при сокращении которых наблюдается выпячивание сосочка над поверхностью кутикулы. Структурная организация сосочка свидетельствует о том, что он предназначен для восприятия, в первую очередь, тактильных и химических раздражителей [Phillips and Friesen, 1982]. От сенсилл кожи нервные волокна в составе четырех пар цефалических нервов передают сигнал на передний мозг животного [Perraccio and Kleinhaus, 1996].
Если рассматривать значение той или другой системы рецепции в функциональном поведении животного, то доминантным в жизни пиявки, как правило, считается пищевой сигнал [Misell et al, 1998], Как и у большинства животных, пищевое поведение животного состоит из двух стадий: поиска пищи и ее потребления, В этом процессе оказываются задействованными несколько сенсорных систем. Так о присутствии потенциальной жертвы животное узнает по вибрациям воды, а дальнейшее поведение определяется суммой тактильных, температурных и химических стимулов [Lent et al, 1988, Elliott, 1986].
Механическая стимуляция рецептов кожи вызывает локомоторное и оборонительное поведение пиявки: один или несколько сегментов резко сокращаются, на поверхности появляется серия четко различимых складок, животное изгибается, разворачивается и уплывает [Kristan et al, 1982]. Каждый сегментальный ганглий содержит 14 нейронов, отвечающих на тактильное воздействие (рис. 1), которые по чувствительности к силе прикладываемого тактильного стимула могут быть разделены на 3 типа. Известны нейроны, которые избирательно отвечают на легкое прикосновение (touch, Т), давление (pressure, Р) или болевую (nociceptive, N) - механическую стимуляцию кожи. Существует и дифференцировка в характере РВ этих нейронов. Т-клетки на легкое прикосновение к поверхности кожи отвечают генерацией пачки ПД. Чувствительные окончания Т-клеток состоят из небольших утолщений, расположенных между эпителиальными клетками на поверхности кожи. Т-клетки быстро адаптируются к длительному давлению на кожу (порог 2 мН) и прекращают генерацию РВ уже через доли секунды. Как правило, Р-клетки генерируют РВ только при большей величине механического давления на кожу (20 мН) и формируют медленно затухающий ответ. Для генерации РВ в N-клетке необходимы высокоамплитудные стимулы (более 50 мН) [Nicholls and Baylor, 1968].
Установлено, что при короткой аппликации раствора, содержащего 150 мМ NaCl, на кожу губ животного (химический стимул) наблюдается увеличение частоты спонтанного РВ Rz-нейронов сегментальных ганглиев. Интенсивность РВ возрастает, если в растворе наряду с солью присутствует аргинин (1 мМ) [Elliott, 1986]. В связи с отмеченной дифференцировкой восприятия тактильного и химического стимулов рецепторами кожи пиявки отметим интеграционный характер анализа сигнала в ЦНС. Стимулы воспринимаются окончаниями сенсорных нейронов и распространяются по всей нервной цепочке животного. Исключительно важно, что серотопинэргические пеисмекерные Rz-клетки сегментных ганглиев сопоставляют входящее РВ с уровнем их собственного спонтанного РВ. Данный процесс является ключевым в регуляции поведения медицинской пиявки, но мало исследован в настоящее время. Стимулы, сопровождающие пищевое поведение животного, например нагревание кожи, как правило, приводят к увеличению частоты РВ этих нейронов и значительному выбросу серотонина [Groome et al, 1995], а терминирующие (растяжение стенки тела) -оказывают на них тормозное действие [Lent et al, 1987 and 1991].
Регистрация мембранного потенциала и ритмической активности нейронов
Одним из наиболее широко применяемых зондов на ионы Са , связанные с клеточными мембранами [Chandler, 1978; Smolen, 1982] является антибиотик хлортетрациклин (C22H23O8N2CI, ХТЦ, максимум поглощения 380-400 нм, максимум флуоресценции 520-530 нм). При рН 7 молекула ХТЦ, по-видимому, не несет заряда, но при увеличении рН она ионизуется, что сопровождается ростом флуоресценции. В области рН=6 и выше молекула ХТЦ может присоединять один ион Mg2lMH два иона Са2+. Даже в водном растворе связывание катионов сопровождается увеличением квантового выхода флуоресценции ХТЦ. Дальнейший рост флуоресценции наблюдается при попадании катион-ХТЦ комплекса в гидрофобное окружение [Caswell and Hutchison, I97l a,b]. Осуществляется ряд равновесий: ХТЦ(СН) + Са2+ =» XT4-Ca(Q2) хтщса) + м = XTU,-M(Q3) XTU-Ca(Q2) + М о XTu Ca-M(Q4) Са2+ + М « Са-М ХТЦ(01)+Са-М = XTU Ca-M(Q4), где М - связывающие центры в мембране, Q - квантовые выходы флуоресценции.
В неполярной фазе сродство зонда к ионам кальция выше, чем к ионам магния. В присутствии кальция возрастает сродство ХТЦ к мембране и квантовый выход флуоресценции комплекса ХТЦ с мембраной (в 200 - 400 раз). Увеличение квантового выхода происходит, возможно, благодаря тому, что погруженная в мембрану молекула зонда (или часть молекулы) становится недоступной для тушащего действия воды. Сдвиг спектров ХТЦ также говорит о погружении этого красителя в более гидрофобную область при связывании. В присутствии кальция ХТЦ практически полностью связан с мембраной [Владимиров и Добрецов, 1980].
Регистрацию флуоресценции ХТЦ проводили с помощью люминесцентного микроскопа Люмам И-3 (ЛОМО). Возбуждение флуоресценции ХТЦ осуществлялось с помощью галогеновой лампы накаливания КГМ 12-100 и комбинации светофильтров ФС-1-6 и СЗС 21-2. Регистрация проводилась фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А с использованием интерференционных светофильтров (максимум пропускания в области 520 нм). Приготовленные препараты инкубировали в растворе зонда рабочей концентрации 10" М в течение 10-15 минут, затем отмывали,
Для регистрации изменений потенциала внутренней митохондриальнои мембраны (ДЧ ) использовался флуоресцентный зонд родамин 123 (Rhl23, максимум поглощения 485 нм, максимум флуоресценции 530 нм) [Toescu and Verkhratsky, 2000]. Существует большое количество данных по применению Rhl23 при оценке А , для окрашивания митохондрий и наблюдения за движением митохондрий в клетке [Emaus, 1986]. Молекула зонда представляет собой липофильный катион, способный накапливаться в митохондриях пропорционально их ДЧЛ При накоплении в митохондриях наблюдается концентрационное тушение флуоресценции RM23. Если АШ уменьшается, т.е. происходит деполяризация митохондриальнои мембраны, то зонд начинает выходить в цитоплазму, что сопровождается ростом интенсивности его флуоресценции.
Регистрацию флуоресценции Rhl23 проводили таким же образом, что и для ХТЦ, Для возбуждения флуоресценции использовалась комбинация светофильтров СС 15-4 и СЗС 21-2. Приготовленные препараты инкубировали в растворе зонда рабочей концентрации 10"5М в течение 10-15 минут, затем отмывали.
Флуориметрия, основанная на регистрации собственной флуоресценции восстановленных пиридиновых нуклеотидов (НАДН и НАДФН) и окисленных флавопротеинов, является полезным инструментом при изучении клеточного энергетического метаболизма [Balaban and Mandel, 1990; Masters and Chance, 1993], НАДН - важнейший компонент дыхательной цепи (максимум спектра возбуждения 340-360 нм, максимум флуоресценции 460 нм). Известно, что максимальная интенсивность флуоресценции, регистрируемая в состоянии покоя (состояние 4 по Chance, 1955), уменьшается (53%) во время перехода в активное состояние (состояние 3). В случае дефицита субстрата (состояние 2), наблюдается дальнейшее уменьшение интенсивности флуоресценции НАДН. Так как окисленная форма НАД+ не флуоресцирует, то по уменьшению интенсивности свечения судят о снижении соотношения НАД+/НАДН. Отметим, что флавиновые компоненты, по-видимому, не вносят существенного вклада в спектры флуоресценции при возбуждении в данном диапазоне [Юденфренд, 1965; Duchen, 1992J.
Клеточные флавины, флавин адениндинуклеотиды (ФАД) и мононуклеотиды (ФМН) большей частью существуют в виде кофакторов ферментов, вовлеченных в окислительно-восстановительные реакции. Эти ферменты, как правило, слабо или совсем не флуоресцируют, поскольку флуоресценция флавиновых кофакторов в значительной степени тушится их белковым окружением [Kunz and Kunz, 1985; Voltti and Hassinen, 1978]. Известно, что только липоамиддегидрогеназа (LipDH) и электрон-переносящий флавопротеин (ЭПФ), находящиеся в митохондриальыом матриксе, вносят существенный вклад во флуоресценцию клеточных флавопротеинов [Hassinen and Chance, 1968; Hall and Kamin, 1975; Kunz, 1986]. По некоторым оценкам LipDH составляет 50% флавопротеиновой флуоресценции митохондрий печени крысы, ЭПФ -25%, остальная часть - неспецифические флавины [Kunz and Kunz, 1985]. Было обнаружено, что LipDH входит в состав нескольких дегидрогеназных мультиферментыых комплексов [Perham, 1991], и ред-окс статус ее ФАД-кофактора находится в прямом равновесии с митохондриальным НАДТНАДН пулом:
Перераспределение связанного Са плазматической мембраны и потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов при химической стимуляции (изменении содержания хлористого натрия в среде)
В экспериментах по исследованию изменений содержания мембраносвязанного Са2+ и состояния митохондрий при химической стимуляции (ХС) были использованы препараты головной и хвостовой присосок пиявки и участков боковой стенки тела с отходящими от них цепочками ганглиев. Клеточный ответ на действие стимула регистрировали для Rz-нейронов 4-ого ганглия в цепочке.
Как уже отмечалось ранее [Zhang et al, 2000; Elliott, 1986] ХС кожи губ ротовой присоски пиявки приводит к увеличению спонтанного РВ Rz-нейронов сегментальных ганглиев и цефалических нервов. Увеличение электрической активности нервов и нейронов не поддерживается в течение всего времени действия стимула и убывает, несмотря на продолжающееся действие стимула.
Мы доказали, что увеличение электрической активности Rz-нейронов в ответ на действие химического стимула сопровождается перераспределением ионов кальция на их плазматической мембране. Выявленные изменения флуоресценции зонда ХТЦ Пі. свидетельствуют о быстрой десорбции и сорбции Са на мембране после окончания стимуляции (рис. 25). Цикл сорбции/десорбции длится в течение 1,8±0,4 минут. Максимальная амплитуда ответа составляет 13,6±3,2% от величины исходного сигнала (п=4).
Помимо изменений содержания мембраносвязанного Са2+ при ХС были выявлены изменения функционального состояния митохондрий Rz-нейронов, Аппликация раствора NaCl (300 mM) на кожу губ вызывает быстрое (задержка ответа менее 2 сек) временное уменьшение потенциала внутренней мембраны митохондрий, ДЧ (рис. 26). Прекращение стимуляции сопровождается дополнительным уменьшением содержания связанного Са2+ ПМ и временным снижением ДТ на фоне восстановления исходного его уровня. Очевидно, прекращение действия стимула тоже является сигналом, меняющим характер электрической активности нейронов, что приводит к временной десорбции Са2+ и увеличению его концентрации в цитоплазме.
Нами также были выявлены отличия в вероятности развития реакции на ХС в зависимости от места нанесения воздействия. При ХС участка кожи головной присоски животного ответ развивался во всех случаях, тогда как в случае хвостовой присоски только в 60%. По-видимому, различия в ответе связаны с числом рецепторов или проекций нервов в данном отделе тела животного.
В следующей серии экспериментов было показано, что кинетика изменений ДТ меняется при повторном действии стимула (рис. 27 и 28). Прежде всего, изменения касаются амплитуды ответа и зависят о места прикладываемого раздражения. Для препаратов сегментальных ганглиев, связанных с головной присоской (п=4), амплитуда изменений в ответ на второй стимул возрастает в 1,6 раза, а к четвертому - уменьшается в 2,2 раза по сравнению с первым. В случае стимуляции рецепторов, локализованных на коже ганглиев, связанных с хвостовой присоской, наблюдается уменьшение амплитуды ответа при каждом последующем стимуле (п 4). Отметим, что при этом меняется не только амплитуда, но и кинетика ответов, развивающихся при прекращении действия стимула: возрастает время, необходимое для восстановления исходного уровня потенциала (рис. 29).
Полученные в данной серии экспериментов результаты свидетельствуют о сопряжении РВ нейрона и митохондриального метаболизма, что является важным для развития адаптационных реакций нейронов при продолжительном и повторяющемся действии внешних химических стимулов на кожу животного,
Ранее было показано, что механическая стимуляция (МС) кожи пиявки вызывает генерацию пачек ПД в Rz-нейронах сегментальных ганглиев [Zhang et al, 2000]. Распространение информации о механосенсорном стимуле по нервам проявляется в виде сигналов наибольшей амплитуды. Через 100 мсек непрерывной стимуляции многие из механочувствительных нейронов полностью адаптируются к раздражению и прекращают генерировать ПД. Адаптация осуществляется в первую очередь в нервных окончаниях, благодаря чему эти нейроны могут быстро отвечать на механическую стимуляцию разных участков кожи [Pinato and Torre, 2000]. Интервал в 30 сек, при повторном действии МС, является достаточным, чтобы вызвать ответ, аналогичный по силе первому.
В ходе проведенного исследования нами не было выявлено характерных изменений содержания мембраносвязанного Са+ Rz-нейронов при тактильной стимуляции рецепторов кожи (отсутствие изменений в 12 экспериментах из !6). Однако в четырех экспериментах была обнаружена быстрая обратимая десорбция иона с поверхности ПМ нейрона (рис. 30). Известно, что в ганглии пиявки локализованы специализированные нейроны (Р-, N- и Т-нейроны), которые отвечают на МС генерацией ПД [Nicholls and Baylor, 1968]. В наших экспериментах было показано, что для Р-нейронов также характерны изменения содержания связанного с мембраной Са2+ (п=б;рис. 31).
В экспериментах по исследованию изменений состояния нейронов при температурной, химической и тактильной стимуляции время действия стимулов было различным: 1 сек - при тактильной, 45 сек - при химической и 8 минут - при температурной. Сравнение изменений содержания мембраносвязанного Са , происходящих в течение 30 сек после начала действия стимула, показывает, что за этот интервал времени при тактильной стимуляции происходит десорбция и обратная сорбция иона на ПМ, при химической - достигается 1/2 максимальной амплитуды изменений, при температурной - 1/10 (рис. 32). Это, возможно, свидетельствует об участии данного процесса в адаптационных реакциях, развивающихся при увеличении нейрональной активности при распространении и обработке сенсорного стимула. Высокой скорости перераспределения мембраносвязанного Са2+ при тактильной стимуляции соответствует быстрая адаптация сенсорных нейронов. Температурные рецепторы являются медленно адаптирующимися.
Изменения вязкости мембран цитосом нейронов при действии ацетилхолина и серотонина
Итак, в ходе проведенного нами исследования было показано, что активация рецепторов при действии НМ приводит к комплексному ответу нейрона, включающему мембранные и цитоплазматические процессы, направленные на поддержание функциональной активности нейронов в изменившихся условиях. В связи с высокой степенью гетерогенности и архитектурной упорядоченности цитоплазмы нейронов возникает вопрос о локальном характере изменений, наблюдающихся при действии НМ. В следующей серии экспериментов для исследования изменений цитоплазматической концентрации Са2+ и ДУ митохондрий был применен метод КЛСМ, который позволяет исследовать динамические процессы в клетках с большим пространственным разрешением.
В ходе исследования было показано, что при действии глутамата (1 мМ) на нейроны изолированного ганглия пиявки происходит двукратное увеличение интенсивности флуоресценции кальций-чувствительного зонда fluo-3 (п=6). На рис. 51 представлены изображения Rz-нейронов, окрашенных fluo-З, в разные моменты времени после внесения НМ и изменения суммарной интенсивности свечения зонда по клетке. Максимальное изменение интенсивности флуоресценции наблюдается к 120 сек. Увеличение концентрации [Ca2+]UIIT Rz-нейронов при действии глутамата связано с деполяризацией ПМ вследствие активации рецепторов NMDA-типа и последующей активацией потенциал-зависимых Са2+-каналов [Rose, 1995].
Анализ пространственных изменений [Са2+]цит проводили, определяя распределение интенсивности свечения зонда по выделенной линии сечения нейрона в одном и том же положении в течение действия глутамата (рис. 51 и 53). Установлено, что до внесения НМ распределение интенсивности флуоресценции зонда, соответствующее распределению комплексов [fluo-3-Ca +], имеет более гетерогенный характер, чем к моменту максимального увеличения [Са +]циТ при действии глутамата. Изначально гетерогенный характер распределения ионов Са2+, очевидно, объясняется их ассоциацией с Са +-связывающими белками и мембранами цитоплазматических органелл (митохондрий и др.), т.е. с системой Са2+-буферов клетки (рис. 51А, 0 сек).
Внесение глутамата приводит к неравномерному увеличению интенсивности свечения зонда (рис. 51А, 30 и 60 сек), однако значительное увеличение [Са +]Ui,T нивелирует локальные различия (рис. 51 А, 90 сек). Неравномерное увеличение концентрации [Са +]цИГ может быть связано с характером распределения потенциал-зависимых Са2+-каналов на ПМ и неодинаковой скоростью диффузии иона в различных участках цитоплазмы [Augustine et al, 2003].
С помощью зонда Rhl23 мы регистрировали изменения потенциала внутренней мембраны митохондрий при действии глутамата (п=4, рис. 52), которые обусловлены накоплением в их матриксе ионов Са2+. Анализ кинетики развития максимального изменения интенсивности флуоресценции двух зондов, RM23 и fluo-З, показывает, что потенциал митохондрии при действии НМ на клетку меняется позже, чем концентрация внутриклеточного кальция (150 сек по сравнению с 90 сек). Проведенный нами анализ изменений интенсивности свечения потенциал-чувствительного зонда Rhl23 в различных участках клетки в течение действия глутамата подтвердил предположение о наличии неравномерных изменений ДЧ7 в зависимости от локализации митохондрии в нейроне (рис. 54). Установлено, что до внесения глутамата Ші123-окрашенньіе нейроны флуоресцируют слабо (рис. 52А, 0 сек). Действие глутамата приводит как к росту суммарной интенсивности флуоресценции, так и к проявлению ее структурной неоднородности (рис. 52А, 60 и 120 сек), которая, по-видимому, объясняется последовательной деполяризацией мембраны разных митохондрий. Это, в свою очередь, может быть связано с неравномерным ионофоретическим входом ионов Са в митохондрии, локализованные в различных участках нейрона [Collins et al, 2001].
Вероятно, динамические процессы и структурные перестройки, протекающие на плазматической мембране клетки и в ее субклеточных органеллах, а также вовлекающие белки цитоплазмы, проявляются в локальных изменениях показателя преломления. В связи с поставленной задачей в данной серии экспериментов исследовали регулярные изменения показателя преломления цитоплазмы в различных областях клетки при действии НМ. Для проведения подобного исследования был выбран специальный метод, позволяющий исследовать Са """-зависимые изменения состояния цитоплазмы в нативной клетке, а именно метод лазерной интерференционной микроскопии (см. главу «Материалы и методы исследования»).
Перед началом измерений была проведена калибровка измерительной системы интерференционного микроскопа МИМ-2.1 по частоте и амплитуде, для чего использовалось зеркало с алюминиевым покрытием, закрепленное на пьезокерамическом модуляторе и генератор НЧ от 0 до 20 Гц. Варьируемыми параметрами были частота и амплитуда колебаний, подаваемых на зеркало (таким образом моделировалась ситуация с регулярными изменениями ОРХ). На рисунке 55 показана зарегистрированная кривая изменений ОРХ в точке при колебаниях зеркала, где амплитуда 15 нм, частота 8,1 Гц. Частота колебаний определялась также независимо по частотомеру. Одновременно проверялась правильность работы программы спектрального анализа амплитуды и частоты. Расчетный спектр регулярных изменений ОРХ при колебаниях зеркала приведен на рис, 56. Получаемая частота колебаний зеркала совпадает с частотой, задаваемой на генераторе и регистрируемой с помощью частотомера. Минимальная регистрируемая амплитуда колебаний зеркала при подаче сигнала с генератора, для которой можно было рассчитать частоту, составляла 0,06 нм (рис. 57), При отсутствии модуляции зеркала, амплитуда колебаний в спектре менее 0,02 нм и представляет собой белый шум. Данные значения указывают на разрешающую способность прибора.
