Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9-34
1.1. Адренергическая регуляция функций печени, слизистой тонкого кишечника и некоторых пищеварительных желез 9-13
1.2. Клеточные механизмы реализации эффектов адреналина 13-16
1.3. Калоригенный эффект катехоламинов 17
1.4. Особенности функционирования митохондрий слизистой оболочки тонкого кишечника 18-21
1.6. Действие адреналина на митохондриальные функции 21-34
1.5.1. Влияние адреналина на дыхание и окислительное фосфорилирование в митохондриях . 23-27
1.5.2. Активация адреналином транспорта ионов Са2+ в митохондриях 27-29
1.5.3. Адреналин и обмен энергетических субстратов 29-32
1.5.4. О влиянии адреналина на митохондриальный обмен в энтероцитах 32-33
2. Методы исследования 35-51
2.1. Обеспечение спокойного состояния животного и инъекция адреналина 35-36
2.2. Выделение митохондрий печени крысы 36-38
2.3. Выделение митохондрий из слизистой оболочки тонкого кишечника крысы 38-41
2.4. Электронная микроскопия суспензий митохондрий 41
2.5. Полярографическое измерение скорости дыхания митохондрий 41-43
2.6. Потенциометрическое (рН-метрическое) изучение окислительного фосфорилирования и транспорта ионов в митохондриях 43-48
2.7. Определение вклада эндогенного сукцината в митохондриальные процессы 48-49
2.8. Определение митохондриального белка 49
2.9. Реактивы 49
2.10.Статистическая обработка данных 50-51
Результаты экспериментов 52-87
3.1. Зависимость скорости дыхания от концентрации суспензии митохондрий 52-54
3.2. Кинетические преинущества сукцината перед НАД-зависимыми субстратами в обеспечении транспорта Са в митохондриях 54-58
3.3. Особенности окисжтельного фосфорилирования и транспорта Са в митохондриях слизистой оболочки тонкого кишечника крысы 58-62
3.4. Действие близких к физиологическим доз адреналина на поддерживаемую окислением сукцината кальциевую емкость и время удерживания
Са в митохондриях печени 62-67
3.5. Влияние физиологической и стрессовой дозы адреналина на поддерживаемые окислением сукцината скорости фосфорилирования в митохондриях печени 67-71
3.6. Изменение уровня фосфорилирующего окисления эндогенного сукцината при действии физиологической и стрессовой дозы адреналина 72-75
3.7. Действие и последействие стрессовой дозы адренажна на дыхание митохондрий печени ... 75-83
3.8. О разобщающем действии адреналина 83-84
3.9. Повышенная чувствительность к адреналину (в дозах 5 и 25 мкг на 100 г) митохондри-альных процессов в слизистой оболочке тонкого кишечника по сравнению с печенью 85-89
4. Обсуждение результатов 90-100
Выводы
Список литературы 103-126
Приложение 127-133
- Адренергическая регуляция функций печени, слизистой тонкого кишечника и некоторых пищеварительных желез
- Выделение митохондрий из слизистой оболочки тонкого кишечника крысы
- Зависимость скорости дыхания от концентрации суспензии митохондрий
- Действие и последействие стрессовой дозы адренажна на дыхание митохондрий печени
Введение к работе
Актуальность темы. Симпато-адреналовая или катехоламинер-гическая система обеспечивает поддержание гомеостаза в организме и тканях в нормальном физиологическом состоянии и при возбуждении. Этой системе принадлежит важное значение в формировании адаптационного синдрома, развивающегося в организме при различных неблагоприятных воздействиях и патологических состояниях (Cannon. V., 1932; Орбели Л.А., 1962; Setye Н. , 1950, 1967).
Важной частью адаптации является регуляция энергетического обмена, запускаемая выбросом адреналина (АД). Казалось бы очевидным, что действие АД должно быть направлено, в основном, на функционирование митохондрий (MX). Однако известные на сегодняшний день данные по этому вопросу (TitKeradgeM., Сооре Н. , 1976; Кулинский В.И., 1976-1980; Малеев В.И., 1980-1983; Тапбергенов CO., 1982 и др.) не стали общепринятыми. Это связано с неоднозначностью и не всегда достаточной выраженностью эффектов АД на митохондриальном уровне в отличие от глюкагона, который оказывает выраженное стимулирующее действие на MX в меньших, чем АД концентрациях.
Мы считаем, что эффекты АД на митохондриальном уровне в значительной степени зависят от уровня нативности выделенных MX, от степени их соответствия состоянию в организме. В большинстве работ (Titheradge М., Сооре И., 1976; Туракулов Я.Х., Гайнутди-нов М.Х., 1980 и др.) применяемые дозы АД значительно превышают физиологические. Это может индуцировать торможение и "маскировку" стимулирующих эффектов гормона в MX в отличие от применяемых нами физиологических и близких к ним доз.
И наконец, представляет особый интерес изучение влияния АД не только на хорошо изученные и стабильные MX печени, но и на MX тканей чувствительных к нейрогенным и гормональным воздействиям, какой является слизистая оболочка тонкого кишечника.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было исследование действия АД на некоторые параметры окислительного фосфорилирования и транспорта ионов Са в MX печени и слизистой оболочки тонкого кишечника крысы. В конкретные задачи входило:
1. Усовершенствовать методику выделения MX из слизистой тонкого кишечника крысы с целью сохранения нативных свойств органелл. Изучить особенности окислительного фосфорилирования и поглощения Са в MX энтероцитов.
2. Исследовать влияние физиологической и близкой к ней стрессовой дозы АД на окислительное фосфорилирование и обмен Са в MX гепатоцитов и энтероцитов в начальные (15-30 мин) и отдаленные (3 ч) периоды времени после инъекции гормона животному.
3. Определить значение J2 -адренорецепторов, а также окисления различных энергетических субстратов в реализации влияния АД на функционирование MX.
4. Выявить возможные механизмы регуляции функций MX адреналином.
Научная новизна. I. При обеспечении сохранения состояния в организме получены хорошо фосфорилирующие и транспортирующие Са MX из слизистой тонкого кишечника крысы.
2. Установлено, что MX энтероцитов более реактивны чем MX печени. Полученные данные позволяют заключить, что реактивность MX энтероцитов и обусловливает повышенную чувствительность слизистой тонкого кишечника.
3. В разработанных условиях обнаружены неизвестные ранее стороны действия физиологических и близких к ним доз АД на митохондриальные процессы в печени:
а;)1 воспроизводимая стимуляция скорости окислительного фосфо-рилирования, кальциевой емкости и времени удерживания Са в MX (стрессовая доза) в начальные периоды действия гормона;
б) преимущественная направленность действия АД на обмен сукцината-субстрата, энергия окисления которого обеспечивает эти митохондриальные процессы;
в) блокада J5 -адреноблокатором индералом активирующего действия АД на фосфорилирование АДФ в MX, указывающая на то, что этот эффект гормона реализуется, в основном, через (2 -адреноре цепторы;
г) двуфазность действия стрессовой дозы АД, выражающаяся в смене через 3 ч после введения активации окисления добавленного сукцината его торможением, обусловленным развитием ингибирования сукцинатдегидрогеназы оксалоацетатом.
4. Установлено, что нефизиологическая доза АД, значительно превышающая концентрации гормонов в тканях, вызывает разобщение дыхания и фосфорилирования в MX.
Научно-практическая ценность. Расширены теоретические представления о кинетических преимуществах сукцината - главным энергетическим субстратом слизистой тонкого кишечника. Отработка условий выделения MX из этой ткани позволяет предложить эти орга-неллы в качестве чувствительных тест-систем на регулирующие воздействия и использовать при изучении клеточных и молекулярных механизмов функционирования желудочно-кишечного тракта. Основные положения, выносимые на защиту.
1. Преимущественное окисление сукцината при поглощении ионов кальция в MX печени и слизистой оболочки тонкого кишечника крысы.
2. Активация окислительного фосфорилирования и поглощения Са в MX гепатоцитов и энтероцитов в начальные периоды действия физиологических и близких к ним стрессовых доз АД.
3. Повышенная чувствительность к АД митохондрий слизистой тонкого кишечника.
4. Двухфазный характер действия АД в MX печени, выражающийся в смене активации окисления сукцината его торможением.
5. Отсутствие активации дыхания, наличие элементов разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования в MX при действии больших нефизиологических доз АД.
Адренергическая регуляция функций печени, слизистой тонкого кишечника и некоторых пищеварительных желез
Печень занимает центральное место в обмене веществ организма. Анатомо-топографическое расположение и особенности воротного кровоснабжения печени предопределяют ее особую роль в регуляции межуточного обмена. Резорбируемые в желудочно-кишечном тракте неорганические соли, продукты гидролиза белков, липидов, полисахаридов с кровью воротной вены транспортируются к гепатоцитам, где и включаются в метаболические процессы. Печень играет важную роль в дезинтоксикации организма, образовании и секреции желчи. Сложность и многообразие метаболических процессов, постоянно протекающих в печени, ее участие в регуляции обмена веществ целостного организма возможны лишь при условии взаимосвязи эффекторннх реакций с интегративнымш, в которых ведущая роль принадлежит нервной системе и железам внутренней секреции.
Печень, как и многие другие органы млекопитающих, находится под контролем симпато-адреналовой системы. Симпатическая иннервация печени осуществляется, в основном, через солнечное сплетение, от которого отходят волокна, образующие переднее и заднее печеночное сплетение. Волокна переднего сплетения идут по ходу печеночной артерии и ее ветвей, а заднего - по ходу воротной вены и желчных путей. По своему функциональному значению нервы печени являются смешанными. В их составе имеются холинергические и адренергические волокна (Росин Я.А., 1965; Ноздрачев А.Д., 1983).
Симпатическая нервная система и надпочечники физиологически тесно связаны друг с другом. При выключении гормональной функции мозгового слоя надпочечников, нарушается деятельность симпатической нервной системы. И, наоборот, нервные импульсы влияют на функциональную активность мозгового слоя надпочечников (База-ревич Г.Я. и др., 1979; Смиттен Н.А., 1972). Поэтому функция печени могут регулироваться как непосредственно импульсацией адренер-гических нервов, так и гормоном надпочечников - адреналином.
Блокада адренергической импульсации приводит к усилению желчеотделения, некоторому "разбавлению" желчи и к повышению в ней содержания пигментов и желчных кислот (Назарчук О.В., 1968; Скляров Я.П., 1965). Введение АД вызывает стимуляцию гликоген-фосфорилазы, распад гликогена в печени и накопление в крови глюкозы и молочной кислоты (Хочачка П., Сомеро Д., 1977; Мак-Мюр-рей У., 1980). Инъекции АД сопровождаются не только усилением гликолиза, но и повышением в крови и желчи концентрации калия и кальция в зависимости от метаболических процессов в печени (Davis L.etat., 1964; Романенко В.Д., 1978). В опытах in, vivo зарегистрировано снижение содержания аминокислот в крови и повышение его в печени крыс после многократного внутримышечного введения АД, что свидетельствует об активации синтеза белка ("Russet 1955; Miller L. , 1965). Активирование катехоламинами (КА) липаз вызывает усиленный распад жиров в печени и окисление жирных кислот (Баяндуров Б.И., 1949). Установлено, что КА активируют внутриклеточную аденилатциклазу, что в свою очередь стимулирует образование циклического 3 , 5-аденозинмонофосфата (цШ ) (Wimms-Hageta І., 1967; Moran N. , 1967). Так как цАШ усиливает липолиз в печени, то адренергическое влияние на обмен липи-дов может быть связано с образованием этого соединения (Weiss В. , Maickel R., 1968).
Благодаря наличию энтерогепатического кругооборота желчных кислот, солей кальция, некоторых жирорастворимых витаминов и других веществ между функционированием печени и кишечника существует тесная функциональная связь. Основная функция кишечника состоит в дальнейшем переваривании пищевых масс, всасывании различных продуктов пищеварения и перистальтическом продвижении плотных частей содержимого. Как и печень, тонкий кишечник позвоночных имеет двойную иннервацию со стороны симпатической и парасимпатической нервной системы за счет мышечнокишечного и подслизистого нервных сплетений (Колосов Н.Г., 1968).
Холиномиметики (ацетилхолин, пилокарпин и др.) и ингибиторы холинэстеразы усиливают кишечную секрецию, а холинолитики (атропин) и адреномиметики (АД, норадреналин (БА) и др.) тормозят ее (Орбели Л.А., 1962). При адреналэктомии снижается активность некоторых кишечных ферментов (Levin. R., 1969). И.К.Гозите (1971) установила, что АД повышает инвертазную активность изолированных эпителиальных клеток тонкой кишки крыс на 64,8$, гомогенатов -на 72,9$. Эффект НА был менее выражен. Т.В.Шахова (1971) наблюдала после длительного введения собакам адренолитиков некоторое снижение активности энтерокиназы и щелочной фосфатази в содержимом тонкой кишки. При длительном введении крысам адреномиметика ДОФА в тонкой кишке наступает увеличение лизосом и повышается активность лизосомальных ферментов в ткани кишки (Rivera -Calitu-lin. L. et al., 1973). Имеются данные, что АД и НА тормозят мито-тическую активность в эпителиальных клетках желез тонкой кишки крыс, задерживая клеточное деление (Пужака Х.Я., 1970).
Существующие в литературе данные о влиянии адренергических веществ на пищеварительную функцию и всасывание в тонкой кишке довольно противоречивы, что обусловлено, вероятно, видовой специфичностью подопытных животных (Фролькис А.В., 1981).
По утверждению G-. Gray (1973) адреномиметики повышают всасывание глюкозы в тонкой кишке на 60$. Усиление всасывания глюкозы при введении АД крысам было установлено также в исследованиях Н.Ш.Амярова, К.Фрейде (1973). Повышение всасывания ионов натрия и хлора в подвздошной кишке кроликов под воздействием АД и НА отметили M.Pield et at.(1975). В противоположность этим данным Е.Е.Яремко (I960) наблюдал у собак при введении АД резкое угнетение всасывания глюкозы в изолированном отрезке тонкой кишки. АД также вызывал у собак торможение абсорбции жирных кислот (Анастасьева Н.В., 1962), a J3-адреноблокатор индерал усиливал кишечную абсорбцию (Фролькис А.В., 1981). Длительное введение АД вызывает в двенадцатиперстной кишке повсеместный распад и дегра-нуляцию тучных клеток с последующим снижением их новообразования (Успенский В.М. и др., 1982).
Адреналин влияет и на функционирование других систем желудочно-кишечного тракта. Отсутствие единого мнения относительно влияния этого гормона не деятельность пищеварительных желез обусловлено также зависимостью эффектов от функционального состояния желез (Скляров Я.П., 1971). Катехоламины вызывают значительные изменения в обмене макроэргических соединений секреторных органов (Шостаковская И.В., 1968).
Выделение митохондрий из слизистой оболочки тонкого кишечника крысы
Митохондрии печени выделяли по общепринятым схемам с модификациями, обеспечивающими лучшее выявление in vitro изменений MX in vivo . Эти условия описаны ранее (Кондрашова М.Н., Григо-ренко Е.В., 1981) и ниже.
В качестве основы метода получения MX использовали классическую работу G. Hogeboom , W. Sckneider (1948). Животных забивали декапитацией. После извлечения печень хранили 10 мин в среде гомогенизации охлажденной до появления плавающих шелковистых кристаллов. Ткань измельчали в прессе и гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма при скорости 200 оборотов в минуту и трех вертикальных ходах пестика. Среда гомогенизации содержала 250 мМ сахарозу и 10 мМ трис-буфер, рН 7,4. Из 10$ гомогената центрифугированием осаждали фракцию ядер поэтапно: 3 мин при 150g и 4 мин при 330g без остановки центрифуги. Фракцию тяжелых MX получали центрифугированием супернатанта в течение 10 мин при 4500 g . Полученный непромытый осадок повторно регомогени-зировали вручную (один вертикальный ход пестика) со средой гомогенизации, которую добавляли из расчета получения густой суспензии с концентрацией 70-90 мг митохондриального белка в I мл. Полученную непромытую суспензию Ж (рис. 2.1,А) использовали для непосредственных исследований. При этом она хранилась на льду.
Все операции получения MX проводили в холодной комнате при температуре 0-+1С. Растворы и используемая при выделении посуда предварительно охлаждались. При сравнительном исследовании влияния катехоламинов выделение MX проводили одновременно из печени опытного и контрольного животного.
Попытки выделить Ж из слизистой оболочки тонкого кишечника предпринимались давно ( Nakamura M.etat., 1959; Uubsher G.etal., 1962), но далеко не все препараты Ж соответствовали требованиям интактности. Трудности работы с Ж этой ткани связаны с "агресив-ностью внутриклеточной среды энтероцитов" (цит. по: Ахмеров Р.Н., 19786), наличием слизи и нестабильностью биохимических показателей митохондрий при хранении. Для преодоления этих трудносте мы применили для выделения и исследования MX кишечника комплекс условий, разработанный М.Н.Кондрашовой и соавт. (1881) для других тканей, который позволяет получать изолированные митохондрии со свойствами, приближенными к нативным.
После извлечения тонкой кишки ее быстро промывали 100 мл холодного (-1С) физиологического раствора (0,9%ый NaCl ) и оставляли в нем на 5-Ю мин до полного охлаждения ткани. В дальнейшем все операции по выделению проводились при температуре 0+2С с использованием предварительно охлажденной посуды и инструментов. Слизистую выдавливали шпателем, не разрезая и не выворачивая кишку. Выход слизистой ткани из одной крысы массой 200-220г составлял 2,5-Зг сырого веса ткани. Далее ее гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма при скорости 200 оборотов в минуту и трех-четырех вертикальных ходах пестика. Среда гомогенизации содержала 250 мМ сахарозу, 20 мМ трис-буфер (рН 7,4) и сывороточный альбумин (Олайнский, марки Б или фирмы "Реанал", лио-филизированный) из расчета 250-500 мг на I г ткани. (Альбумин стабилизирует митохондриальную мембрану и снимает разобщающий фосфорилирование эффект жирных кислот в митохондриях слизистой кишечника (Sym.on.sL., 1966; Ахмеров Р.Н., 19786). Чем чище препарат альбумина тем меньше его можно добавлять в среду гомогенизации. Из 10 -ного гомогената, профильтрованного через слой марли, центрифугированием осаждали слизь и фракцию ядер поэтапно: 3 мин при 150 g и 4 мин при 600 g без остановки центрифуги. Для лучшего осаждения слизи добавляли нереактивный BaS04 (50 мг на 1г ткани) (Ахмеров Р.Н., 1978а). Митохондриальную фракцию получали центрифугированием супернатанта в течение 10 мин при 4500 g . Полученный непромытый осадок повторно гомогенизировали вручную (один вертикальный ход пестика) со средой.
Зависимость скорости дыхания от концентрации суспензии митохондрий
Концентрация тканевого препарата является фактором, имеющим большое значение для характера получаемых результатов. От изменения концентрации Ж при хранении и инкубации может измениться не только величина наблюдающихся превращений, но даже их знак. Обычно влияние этого фактора в надлежащей степени не учитывается. Хотя ранее на это обращали специальное внимание (Кондрашова М.Н. и др., 1973).
На рисунке 3.1 приведен пример значительного повышения скоростей дыхания (особенно фосфорилирующего) у обычно применяемого при биохимических исследованиях разведенного препарата MX печени (Б) в сравнении с более густым (А). Такое исчерпание резервов дыхания Ж in. vitro при разведении обусловливается рядом причин, в том числе увеличением относительной нагрузки и повышением концентрации кислорода в ячейке на единицу белка MX, снижением количества защитных компонентов Ж и т.д. Кроме этого такая искусственная активация функций Ж препятствует выявлению стимулирующих воздействий in vivo , которые ожидали от АД. Выявлению таких воздействий способствует использование в опыте более густых, чем обычно принято, суспензий Ж, обладающих большим резервом дыхания (рис. 3.1., А). ливо проявляющееся при инкубации MX, сказывается и во время получения и хранения суспензии MX. На основании проведенной предварительной работы можно считать оптимальными для выявления физиологических изменений концентрации Ж, которые составляют (в мг белка на мл суспензии MX) для печени 70-90 и для слизистой тонкого кишечника 30-40 (при хранении), а при инкубации (в мг белка на мл пробы) для печени - 4-5, слизистой - 2-2,5. В густой суспензии изолированных MX, как показали исследования под световым микроскопом ( Koadrashova M.etal., 1984) сохраняются ассоциаты этих ор-ганелл, что более соответствует состоянию MX в клетке. НАД-зависимыми субстратами в обеспечении 2+ транспорта Са в митохондриях печени Работая с густой суспензией MX печени, нами выявлены некоторые особенности субстратного окисления при транспорте ионов Са2+ в MX. Исследование транспорта Са2+ при окислении различных субст-ратов были и раньше (Vasington. F., Murpky J. , 1962), но они проводились в условиях, так называемой, массированной нагрузки на фоне добавок АДФ и Мд . При этом MX способны поглотить Са + в сотни раз больше его эндогенных концентраций. Однако, в этом случае происходит значительное повреждение митохоядриальных мембран и разобщение системы окислительного фосфорилирования (Vasingtort V., MurpKy J., 1962). Физиологические изучения транспорта Са + в MX лучше проводить в условиях ограниченной нагрузки.
Данные по субстратной зависимости кальциевой емкости MX печени представлены на рисунке 3.2. Как видно, кальциевые емкости MX поддерживаемые окислением сукцината и -оксибутирата резко отличаются. При окислении сукцината (A) MX способны поглотить 6 добавок Са + по 15 нмоль на мг белка и только в ответ на седьмую добавку наблюдается спонтанный выход катиона. При окислении только Jb -оксибутирата, когда вклад эндогенного сукцината снимался малонатом (В) MX аккумулировали только одну порцию CaClg, а на второй уже наблюдался выброс Са . Когда небольшие количества эндогенного сукцината присутствовали (Б), то кальциевая емкость MX при окислении J3 -оксибутирата составляла только половину кальциевой емкости на добавленном сукцинате. Похожие результаты были получены с о -кетоглутаратом и пируватом + малат.
Аккумуляция Са + в MX - результат двух взаимосвязанных процессов: электрогенного транспорта катиона в MX и электронейтрального Са +/Н+ насоса, откачивающего Са из MX (FiskumCr., Lehnirx -ger A., 1980). Б соавторстве с В.Г.Гогвадзе было показано, что при переходе от окисления НАД-зависимых субстратов ( J2 -оксибу-тират и др.) к сукцинату происходит как увеличение скорости погло-щения, так и снижение скорости выхода Са из Ж, что приводит к увеличению кальциевой емкости MX (Kondrashova M.et at., 1982).
В том случае, когда кальциевая нагрузка MX относительно невелика, они способны в течение некоторого времени удерживать накопленный кальций. Затем следует спонтанный выброс катиона связанный с необратимыми изменениями в митохондриальной мембране. Сравнение времени удерживания при окислении различных субстратов показало (рис. 3.3), что при использовании -оксибутирата с малонатом (В) наблюдается спонтанный выброс Са + сразу после накопления 200 нмоль CaCl , тогда как с сукцинатом (А) те же количества катиона удерживаются в течение 10 мин. При окислении р -оксибутирата, когда эндогенный сукцинат не выключается (без малоната), Ж удерживают Са 60 с (Б).
Модификация метода изолирования MX слизистой тонкой кишки крысы, описанная в методической части работы, позволяет выделять активно функционирующие MX этой ткани, которые in. vitro способны и транспортировать ионы Са , и фосфорилировать добавленный АДФ с дыхательным контролем 3-3,5 (при окислении сукци-ната). В ранее проводимых работах исследовали полярографическим методом дыхание MX слизистой тонкого кишечника (Symons L., 1966; Ахмеров Р.Н., 1978; Мусаев Х.Н. и др., 1983), а также их ферментативную активность (Uubsker G.etat., 1962; iemkoff W., Hutsman W.t 1971; Шостаковская И.В. и др., 1981). В своей работе с MX энте-роцитов мы использовали рН-метрический метод для изучения фосфорилирования АДФ и транспорта Са + в органеллах.
рН-метрическая регистрация позволила выявить особенности функционирования MX слизистой тонкого кишечника. На рисунке 3. 4 ,А показана зависимость окислительного фосфорилирования дробных добавок АДФ от окисления разных субстратов. В наших условиях MX энтероцитов были способны профосфорилировать две добавки АДФ (по 150 нмоль/мг). При этом скорость защелачивания среды при фосфорилировании второй добавки была на 15-20% ниже, чем первой. После этого наступало спонтанное закисление среды, в отличие от MX печени, где после остановки фосфорилирования уровень рН оставался постоянным (Кудзина Л.Ю., 1970). Из рисунка 3.4,А видно, что скорость фосфорилирования добавленной АДФ при окислении сукцината
Действие и последействие стрессовой дозы адренажна на дыхание митохондрий печени
При работе в адекватных для физиологических исследований митохондрий условиях удалось выявить отчетливое действие АД в дозе 25 мкг на 100 г массы на дыхание Ж как в начальные (15 и 30 мин), так и в отдаленные (3 часа) сроки после введения.
Как видно из таблицы 3.4 и рисунков 3.II и 3.13, наиболее чувствительным к АД оказалось дыхание Ж при окислении добавленного энергетического субстрата (сукцинат) стимулированное АДФ и Са2\ Через 15 и 30 мин после введения ад скорость фосфорялируи-щего дыхания повышалась по сравнению с контролем на 28$ (см. табл. 3.4 и рис. 3.II). Скорость дыхания контролируемого состояния покоя у MX крыс, которым вводился АД за 15 мин до забоя достоверно от контроля не отличалась, а через 30 мин повышалась на 18$ (табл. 3.4 и рис. 3.II). При этом повышение скоростей дыхания MX после инъекции животному АД не сопровождалось разобщением окисления и фосфорилирования: показатели дыхательного контроля и АДФ/0 или повышались, или были лишь немного ниже контрольных. В этих условиях, как видно из таблицы 3.4, наблюдалось повышение скорости фосфорилирования через 15 и 30 мин после введения АД на 16$ и 18$, соответственно. Эти данные подтверждают полученные нами ранее результаты при регистрации скорости фосфорилирования рН-метрическим методом (подраздел 3.5), что еще раз подтвердило.достоверность наблюдаемого явления. К тому же показало возможность и правомерность использования потенциометри-ческого метода, наряду с широко применяемым полярографическим, при изучении тонких регуляторных влияний на MX. Двумя методами была показана одинаковая качественная направленность стимулирующего окислительное фосфорилирование эффекта АД» который при непосредственной регистрации по рН оказался немного выше. Сравнение абсолютных величин скоростей фосфорилирования затруднено из-за разных методов перерасчета и единиц измерения: для потен-циометрического метода - в нмолях АТФ (или Н+) на I мг белка за I мин, для полярографического - в нмолях АДФ на I мг белка за I мин.
Через 3 часа после введения АД в митохондриях печени стимуляция поддерживаемого окислением сукцината фосфорилирующего дыхания не наблюдалась (табл. 3.4 и рис. 3.II). Можно было думать, .что эффект активации иссяк. Однако, из исследований адаптационного синдрома при продолжительных воздействиях на организм известно, что активация окисления сукцината сменяется оксалоаце-татным торможением, которое ограничивает эффект стимуляции (Кондрашова М.Н., 1969; Григоренко Е.В., 1982). Возникло предположение, что отсутствие эффекта активации дыхания в MX через Зчаса после введения АД кажущееся и "замаскировано" развившимся оксалоацетатным торможением. Для проверки этого предположения в среду инкубации совместно с сукцинатом добавляли изоцитрат, который снимает оксалоацетатное торможение сукцинатдегидрогеназы (Кондрашова М.Н., 1969). Лучше всего уровень этого торможения выявляется в метаболическом состоянии 3 ( V ) по Чансу. Из рисунка 3.12 видно, что через 15 и 30 мин после введения АД торможение (заштрихованная часть диаграмм I и 2), т.е. "замаскированная" оксалоацетатом активация, незначительно и даже ниже контроля. На контрольных MX здесь сказывается, вероятно, возбуждение вызванное уколом. Зато через 3 часа уровень торможения у контрольных Ж минимален и на этом фоне четко проявляется оксалоацетатное торможение (23$), вызванное введением АД (рис. 3,12,3). Это замаскированное при обычных исследованиях явление мы назвали эффектом последействия АД.
Описанный эффект действия АД на дыхание Ж четко проявляется и при исследовании Са +-стимулирующего дыхания. Добавка к суспензий MX в полярографической ячейке СаС12 вызывает стимуляцию дыхания пропорциональную скорости транспорта Са через митохон-дриальную мембрану (Kondrashova M.et al., 1982). Из рисунков 3.13 и 3.14 видно, что через 15 и 30 мин после введения АД наблюдается отчетливая активация в сравнении с контролем скорости дыхания MX при транспорте Са . Менее выражена активация адреналином разобщенного ДНФ дыхания (рис. 3.13). Наблюдаемые изменения происходили без признаков разобщения окисления сукцината и транспорта Са +: дыхательный контроль у опытных MX в начальные периоды действия гормона повышался, а соотношение Са/0 лишь немного снижалось в сравнении с контрольными показателями (рис. 3.14).
Таким образом, наблюдается четкое влияние АД на функционирование Ж печени: активация дыхания, фосфорилирования и транспорта Са + в начальные периоды действия гормона (15 и 30 мин) и исчезновение эффекта активации.
